利用基因芯片技术检测BRAF基因在胰腺癌组织中的表达

目的：研究BRAF基因在正常胰腺与胰腺癌组织中表达的情况。方法：收集正常胰腺组织3例以及胰腺癌手术切除标本6例。后者均经病理学检查证实;用TRizol法对组织进行总RNA抽提,采用无RNA酶的DNA酶I等方法进行纯化;通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳以及Lab-on—chip对总RNA进行质控;利用寡核苷酸芯片技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达,并且应用逆转录聚合酶链反应（RT‘PCR）技术加以验证。结果：总RNA的OD260nm／OD280nm之值在1．8～2．0之间;琼脂糖凝胶电泳18s和28s电泳条带清晰,且28s和18s亮度之比≥2;Lab—on—chip检测显示18s和28s双峰比例及位置均正常。无降解杂峰出现。芯片杂交扫描图像信号清晰,具有较低的整体背景和较高的信噪比;Ratio分析表明,BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调（Cy3／Cy5〉2．0）。RT—PCR验证了胰腺癌组织中BRAF mRNA表达上调。结论：BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调,其在胰腺癌发生发展过程中的作用机制还有待于进一步探讨。     

短发卡状RNA对AKT2基因表达的抑制诱导人胰腺癌细胞凋亡

目的:构建AKT2基因特异性短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,运用RNA干扰(RNA i)技术,观察其对人胰腺癌细胞SW 1990和Capan2中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用,并探讨其增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性,促进细胞凋亡的机制。方法:运用基因工程技术,设计合成针对AKT2 mRNA的特异性shRNA,构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体包裹转染人胰腺癌细胞SW 1990和Capan2,荧光显微镜观察细胞内红色荧光蛋白的表达,计算转染效率,RT-PCR、W estern B lot检测AKT2的表达及干扰效率,FACS检测细胞凋亡率来比较转染前后人胰腺癌细胞的抗凋亡能力。结果:①经双酶切及测序证实pAKT2-shRNA构建成功。②SW 1990和Capan2细胞转染pAKT2-shRNA后,荧光显微镜下观察,发红色荧光的细胞占总细胞数的35%~40%;RT-PCR和W estern B lot检测结果示,转染后AKT2 mRNA和蛋白表达显著降低。③FACS检测结果示,转染pA-KT2-shRNA后,紫杉醇30 nM作用24h,与对照组相比,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论:pAKT2-shRNA能有效抑制胰腺癌细胞AKT2基因表达,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。     

Ezrin在胰腺癌组织芯片中的表达及其临床意义

目的:探讨转移相关蛋白Ezrin在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。方法:利用高通量的组织芯片技术及免疫组织化学SP法检测88例胰腺癌组织和11例正常胰腺组织中Ezrin的表达,分析它与胰腺癌临床病理特征的关系。结果:8例胰腺癌组织中Ezrin的阳性表达率为77.3%(68/88),而11例正常胰腺组织中均无Ezrin的过度表达(0/11),两者比较P<0.001,差异有统计学意义。同时,Ezrin的阳性表达率与胰腺癌患者的淋巴结转移相关(P<0.001)。结论:胰腺癌组织中Ezrin阳性表达显著高于正常胰腺组织,提示Ezrin的表达上调可能在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。     

结缔组织生长因子在大鼠肝纤维化发生中的作用机制初探

目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)在大鼠肝纤维化形成中的作用机制。方法:雄性SD大鼠32只,体重250~300g,皮下注射四氯化碳(CC l4)制备大鼠肝纤维化模型,分别于注射后1、4、8周处理动物,采用免疫组化、RT-PCR、W estern b lot等方法对肝组织中CTGF的表达进行检测。结果:免疫组化、W estern b lot结果显示,CC l4注射诱导后,大鼠肝组织中CTGF的表达较正常对照明显增强,且CC l4注射1、4、8周组肝组织中CTGF的表达强度呈明显递增趋势。CTGF主要表达于肝星状细胞胞质中。RT-PCR检测结果显示CTGF mRNA的表达与其蛋白质水平的改变相一致。结论:CTGF作为一种致纤维化因子,其过表达促进肝星状细胞的活化增殖及细胞外基质的形成,从而促进大鼠肝纤维化的发生、发展。     

丘脑底核高频电刺激对大鼠黑质-纹状体多巴胺代谢的影响

目的研究丘脑底核(STN)高频电刺激(HFS)对大鼠黑质-纹状体系统的影响。方法给予正常大鼠一侧STN-HFS,应用微透析观察其对纹状体多巴胺(DA)及其代谢产物的影响,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和W estern b lot观察其对黑质、纹状体酪氨酸羟化酶(TH)的影响。结果刺激侧纹状体DA代谢产物明显增多(P<0.05),DA水平无变化;RT-PCR检测发现刺激侧黑质、纹状体TH mRNA水平升高;W estern b lot检测发现刺激侧黑质TH表达无变化,而纹状体TH表达明显升高(P<0.01)。结论STN-HFS可能通过影响黑质-纹状体DA代谢及其限速酶的水平发挥作用。     

NPTX2甲基化在胰腺癌中的定量检测及诊断应用

目的:检测NPTX2甲基化水平在胰腺癌中变化并评价其用于胰腺癌诊断的价值.方法:在10例胰腺癌组织和10例癌旁正常胰腺组织中,分别应用定量RT-PCR和SYBR Green荧光掺入甲基化特异性定量检测法检测NPTX2 mRNA表达量及CpG岛的甲基化量.应用上述建立甲基化特异性定量检测方法分析NPTX2甲基化在胰腺癌及健康志愿者全血DNA中的差异.结果:NPTX2基因在胰腺癌组织中mRNA表达量低于癌旁正常胰腺组织(RQ,0.276±0.263 vs 3.526±3.037,P=0.001),而其甲基化指数(MI)较癌旁正常胰腺组织高[(9.02±7.52)%vs(1.28±0.98)OA,P=0.003].RQ与MI两者之间存在负相关关系(R=-0.552,P=0.012).NPTX2基因MI在胰腺癌患者全血DNA中显著高于健康人[(1.80±1.76)%vs(0.84±0.45)%,P<0.05].结论:在胰腺癌组织中NPTX2发生高甲基化变化,检测其在临床样品中的MI可辅助用于胰腺癌诊断.     

胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用

目的观察胰腺癌疼痛患者的胰腺肿瘤标本内胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达。方法取视觉模拟疼痛评分（VAS）在5分以上的胰腺肿瘤患者的新鲜组织标本,采用RT-PCR及ELISA的方法对胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达进行检测。结果胰腺癌组织中人胰蛋白酶mRNA水平明显高于正常胰腺组织,ELISA显示胰腺癌组织的胰蛋白酶水平明显增高,与正常胰腺组织相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论高水平的胰蛋白酶可能通过激活PAR-2介导胰腺癌疼痛的。     

姜黄素诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其作用机制的研究

目的:研究姜黄素在体外诱导宫颈癌H eL a细胞凋亡及其作用机制。方法:3H-脱氧胸苷掺入法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR检测HPV E 6的mRNA水平表达;W estern b lot检测细胞凋亡相关基因bcl-2、bax、P 53和P 21ras的蛋白水平表达。结果:姜黄素对H eL a细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性;流式细胞仪和荧光双染法结果提示姜黄素可诱导H eL a细胞凋亡;RT-PCR提示姜黄素作用H eL a细胞后HPV E 6的mRNA水平表达逐渐降低;W estern b lot结果提示姜黄素能上调B ax、P 53和P 21ras的蛋白水平表达,而B cl-2的表达无明显影响。结论:姜黄素通过抑制HPV E 6的表达,恢复P 53的功能,引起细胞凋亡,起到杀伤肿瘤的作用。     

Glut-1、VEGF在胰腺癌中的表达及意义

目的研究葡萄糖转运蛋白-1（Glut-1）及血管内皮生长因子（VEGF）在胰腺癌中的表达及意义。方法应用半定量RT-PCR及免疫组织化学染色技术检测Glut-1、VEGF在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达。结果RT-PCR结果显示Glut-1mRNA、VEGFmRNA在正常胰腺和胰腺癌组织中均有表达,但在胰腺癌组织中的表达量明显高于正常胰腺组织（P〈0.01）;免疫组化染色阳性细胞计数显示Glut-1、VEGF在胰腺癌组织中的阳性细胞数明显多于正常胰腺组织（P〈0.01）。结论Glut-1与VEGF的异常表达可能在胰腺癌的发生中起协同作用;VEGF通过上调Glut-1表达促进胰腺癌的发生发展。     

酪氨酸激酶Syk在胰腺癌中的表达检测及其临床意义

目的:探索酪氨酸激酶Syk(spleen tyrosine kinase,Syk)基因的表达与胰腺癌生长、转移的影响,以及与病理特点的关系。方法:用RT-PCR检测25例胰腺癌瘤体标本、癌旁正常胰腺组织中Syk mRNA的表达,并同时作免疫组化检测上述P53蛋白的表达。结果:癌旁正常胰腺组织都有Syk基因的表达,而25例胰腺癌组织中只有7例表达,正常胰腺组织与胰腺癌组织中Syk基因表达差异有显著性(P<0.05)。有淋巴结转移的14例胰腺癌标本中,2例有Syk基因表达,无淋巴结转移的11例胰腺癌患者中有5例检测到Syk mRNA的表达,有淋巴结转移的胰腺癌Syk mRNA的表达率低(P<0.05),Syk mRNA表达与P53蛋白的表达呈正相关。结论:Syk基因的表达缺失与胰腺癌的生长及转移相关。