新生大鼠右心室心肌细胞的原代培养及鉴定

目的:建立一种简便、重复性好的新生大鼠右心室心肌细胞原代培养方法,为右心疾病及肺循环右心相关研究提供可靠的细胞工具。方法:采用出生1～3 d无特定病原体级,SD新生大鼠12只,无菌操作开胸取心脏后,在体视显微镜下分离右心室,用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化法消化右心室心肌组织,差速贴壁法纯化右心室心肌细胞。用0.4%台盼蓝染色检测右心室心肌细胞存活率,在倒置显微镜下观察右心室心肌细胞的生长特点并记录细胞搏动频率。利用cTnT对右心室心肌细胞进行免疫荧光染色鉴定细胞纯度。结果:采用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化右心室心肌组织及差速贴壁法分离所得右心室心肌细胞存活率为(94.96±2.13)%。培养的心肌细胞24 h大部分贴壁并伸出伪足,少数细胞出现自发性搏动;48 h后细胞基本全部贴壁,伪足延长,出现局部同步化搏动;72 h后细胞伪足继续延长并形成细胞簇,搏动基本同步化;96 h后细胞连接成片,呈现完全同步化搏动,搏动频率为(121.2±10.7)次/min。用cTnT染色培养的细胞纯度达(96.71±2.66)%。结论:体视显微镜下分离右心室结合复合酶消化法能成功培养出纯度高、功能较好的新生SD大鼠右心室心肌细胞。     

基于密度梯度法分离纯化的改良培养新生小鼠心肌细胞方法研究

目的基于Percoll不连续密度梯度法分离纯化心肌细胞,建立一个快速稳定提取新生小鼠心肌细胞的原代培养方法。方法在无菌状态下取C57BL/6乳鼠心室,用低浓度Ⅱ型胶原酶消化,通过调整温度、消化方式、离心时间及转速,采用Percoll密度梯度法分离纯化心肌细胞。观察不同时间心肌细胞形态;用0.4%台盼蓝染色检测细胞存活率及细胞数量;采用免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达情况,鉴定心肌细胞及其纯度。结果 5次培养结果显示,心肌细胞的平均存活率为(93.12±0.75)%,纯度为(96.36±0.60)%,细胞生长状态良好,可以贴壁自发搏动。结论采用本方法能获得产量、存活率及纯度很高的新生小鼠原代心肌细胞,耗时较短,是一种理想的分离纯化原代心肌细胞的方法,可满足后续各种实验要求。     

新生大鼠心肌细胞的分离与培养

目的探讨新生大鼠心肌细胞分离与培养的条件和方法,建立简单、可靠的原代心肌细胞培养方法。方法新生SD乳鼠10只,开胸取心剪碎后,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化心肌组织,差速贴壁法纯化心肌细胞。倒置荧光相差显微镜下连续观察15 d心肌细胞形态特征及变化。用0.4%锥虫蓝染色测心肌细胞存活率,记录心肌细胞搏动次数。结果心肌细胞24 h基本贴壁并伸出伪足,出现自发性搏动,72 h后心肌细胞逐渐形成细胞簇,并呈现部分同步搏动,之后心肌细胞连接成片生长。心肌细胞存活率为96.5%,培养72 h至第15天内心肌细胞搏动次数无差异(P>0.05)。结论用该法分离与培养新生大鼠心肌细胞,操作简单且稳定可靠,心肌细胞存活率较高。     

新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,培养存活率高和纯度高的心肌细胞。方法：无菌条件下取出出生1~2 d的SD大鼠心脏,用2.5 g/L胰蛋白酶和 2.0 g/L Ⅱ型胶原酶等量混合液在37℃条件下分次消化心肌组织。以差速贴壁并将时间延长至90 min纯化心肌细胞,48 h后换液。结果： 将心肌细胞24 h贴壁生长,于2~3 d心肌细胞伸出伪足,形成细胞簇,同步搏动,频率约80~130次/min,存活率为（93.9±2.8）%,纯度为（91.9±2.2）%。结论：以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高,是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。     

新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良

目的改良简化心肌细胞培养的条件和方法,培养纯度高、存活时间长的新生SD大鼠的心肌细胞。方法采用含牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）的Ⅱ型胶原酶单次消化心肌、差速贴壁1 h纯化心肌细胞进行培养,全过程在37℃条件下进行。于培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,并在生物倒置显微镜下观察形态学变化。取培养48 h的细胞,用免疫组织化学染色的方法检测心肌细胞的纯度。结果心肌组织在6 h时基本消化完全。培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测心肌细胞的存活率均大于95%,培养30 d时仍为95.2%。在生物倒置显微镜下观察,培养24 h左右的细胞之间形成交联并有细胞搏动。培养48h的细胞经免疫组织化学染色法测定,心肌细胞的纯度为（97.1±1.9）%。结论应用改良并简化的心肌细胞培养方法和培养条件,可得到纯度和存活率均高能满足大多数科研要求的原代乳鼠心肌细胞。     

胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离方法及优化

目的:基于目前已有报道的心肌细胞体外消化及分离方法,对胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离的方法进行系统探索和优化。方法:取胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心脏,运用不同方法分离心肌细胞。利用Count Star仪器检测心肌细胞大小及活性。取细胞悬液涂片,针对心肌细胞标志物α辅肌动蛋白(α-actinin)表达进行免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察心肌细胞形态。结果:用胰酶消化法分离胚胎期小鼠心肌细胞,获得存活率大于94%的心肌细胞。用心脏解离试剂盒法(Gentle MACS法)体外分离新生小鼠(出生后1～3 d)心肌细胞,获得存活率约为97%的心肌细胞。分别用Gentle MACS法、非Langendorff灌流法分离出生后4 d和7 d的小鼠心肌细胞,前者仅获得存活率为58%的心肌细胞,而后者获得的心肌细胞存活率为70%～80%。对于成年小鼠,非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法均可获得杆状率、存活率都在70%左右的心肌细胞。结论:结合文献以及本实验结果发现,分离胚胎期小鼠心肌细胞可用胰酶消化法;分离出生后1～3 d小鼠心肌细胞可用Gentle MACS法。对于出生后4 d和7 d的小鼠,非Langendorff灌流法可获得存活率及杆状率均较高的心肌细胞,分离成年小鼠心肌细胞则适合用非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法。     

乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进

目的 对乳鼠的心肌细胞进行原代培养方法的改进.方法 参照乳鼠心肌细胞原代培养方法,并进行改进,选用混合消化酶(0.08%胰蛋白酶 0.04%～0.06% Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液)及DF培养液进行消化和培养,减少了对心肌细胞的损伤,差速贴壁分离纯化后,加入5-溴-α-脱氧尿嘧啶抑制成纤维细胞分裂增殖.结果 本方法培养的心肌细胞存活率为95.7%,培养2～5 d,视野中绝大多数为已搏动的心肌细胞和心肌细胞团,成纤维细胞无明显增殖.结论 本方法是一种较为理想的乳鼠心肌细胞原代培养方法.     

Wistar大鼠乳鼠与成年鼠心室肌细胞的分离与性质鉴定

目的 探索和优化稳定的适于电生理实验研究的乳鼠及成年大鼠心室肌细胞分离方法。方法 切碎乳鼠心室肌,胰蛋白酶消化,差速贴壁2 h纯化心室肌细胞,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,体外培养48 h后分别行倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化鉴定,微电极阵列记录细胞搏动频率和场电位。采用Langendorff灌流成年大鼠心脏,主动脉逆行插管,胶原酶域反复灌流消化约30 min,无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心室肌组织,台氏液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,将细胞悬液用逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,用于膜片钳记录。结果 经4 -6次消化后,乳鼠心室组织消化完全,细胞存活率大于80%。倒置显微镜下观察,细胞呈梭形、多角形。 12 h有少部分细胞搏动,48 h细胞交织成网,搏动呈同步性,搏动频率30 - 80次/分。 琢鄄辅肌动蛋白（琢鄄actin）经免疫组化检测,纯度达96%。 Langendorff灌流酶解法可获得形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整、立体感强的单个成年鼠心肌细胞,存活率85%,复钙后存活率50%,可用于膜片钳记录。结论 采用本方法可以获得高产量与高质量的用于电生理检测的心室肌细胞。     

乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞体外分离培养方法的优化

目的优化SD乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的体外分离培养的条件和方法。方法分别用胰酶、Ⅱ型胶原酶依次消化分离心肌组织,再通过两次差速贴壁分离法分别收集、培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞。光学显微镜下分别观察心肌细胞和心肌成纤维细胞的基本形态特征的变化,原代心肌细胞行心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定,而心肌成纤维细胞则用第2代行波形蛋白免疫荧光鉴定。结果心肌细胞在2~4 h开始贴壁生长,12~24 h贴壁速率大幅增加,并出现自发性搏动,48~72 h心肌细胞粘合成簇,细胞成活率,纯度均达95%以上;心肌成纤维细胞第2~4代细胞生长良好,纯度高达98%以上。结论此种方法可得到产量大,纯度高,活力好的心肌细胞和心肌成纤维细胞,为心血管疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。     

乳鼠心肌细胞原代培养及电生理特征记录

目的分离培养原代乳鼠心室肌细胞,观察其搏动性,并探索其静息电位(RP)、自发性动作电位(AP)等电生理特征。方法用0.1%胰蛋白酶分离新生1～2 d SD大鼠心室肌细胞,并用差速贴壁法和5-溴脱氧尿嘧啶纯化心肌细胞;通过光镜观察心肌细胞形态和搏动情况;膜片钳技术记录心肌细胞的RP、自发性AP及钠离子电流(INa)特征。结果光镜下见培养12 h后心肌细胞基本贴壁,培养至第5 d时85%左右的心肌细胞都有自发性搏动,搏动频率80次/分左右;记录到自发性搏动心肌细胞RP为-85.34±4.15 mV,并可记录到同步产生的自发性AP,频率84±12次/分,而无自发搏动的心肌细胞RP为-42.1±6.5 mV,未能记录到自发性AP;心室肌细胞INa的阈电位为-60mV。结论该方法分离培养的原代乳鼠心室肌细胞搏动比例高,同时证实了自发搏动性是乳鼠原代心肌细胞状态佳,并具有良好电生理特征的重要标志。     

Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.

Autoantibodies against the beta1-adrenoceptor (beta1-AAB) from patients with dilated cardiomyopathy (DCM) increase the beating frequency of cultured neonatal rat cardiomyocytes. This effect is accompanied by only a small increase in cAMP production. Here we have investigated whether beta1-AAB affect electrophysiological properties and cell shortening of isolated cardiomyocytes by interacting with the beta1-adrenoceptor. Beta1-AAB were obtained during immunoadsorption of patients with DCM and were used for experiments in isolated myocytes cultured from neonatal rat hearts, or freshly isolated from adult rat ventricles or from human right atria. The unselective beta -adrenoceptor agonist (-)-isoprenaline was studied for comparison. Immunoglobulin G (IgG) antibodies increased the spontaneous beating frequency of neonatal rat cardiomyocytes to a lesser degree than (-)-isoprenaline, but both effects were maximum and stable after 2 min. In rat ventricular and human atrial myocytes, IgG increased action potential duration (APD) in a concentration-dependent manner with larger effects on late than on early repolarization phases. Similar effects were obtained with purified beta1-AAB, whereas flow through of the chromatography column was ineffective. (-)-isoprenaline prolonged APD to the same extent during plateau and late phase of repolarization. beta1-AAB increased L-Type Ca2+ current in correspondence with the prolongation of APD. The effects of beta1-AAB and (-)-isoprenaline on APD were strongly attenuated after preincubation of the myocytes with the selective beta1-adrenoceptor antagonist (-)-bisoprolol. In addition, beta1-AAB increased cell shortening in ventricular myocytes from adult rat hearts. Beta1-AAB enhancing the beating frequency of cultured cardiomyocytes, increase L-Type Ca2+ current, APD and contractility in freshly isolated cardiomyocytes mediated via beta1-adrenoceptors. These effects may contribute to beta1-adrenoceptor-mediated cardiotoxicity in heart failure.     

人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因体外转染乳鼠心肌细胞

目的观察人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(hHCN4)基因对大鼠心肌细胞搏动的影响,初步探讨hHCN4转染心肌细胞构建生物起搏器的可行性。方法胰酶消化法分离培养原代乳鼠心肌细胞,随机分为实验组、空病毒对照组、空白对照组,转染时分别加入带hHCN4和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒、带GFP的腺病毒、PBS,观察分析心肌细胞转染前,转染后2天和3天的搏动情况;采用逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光检测各组心肌细胞hHCN4 mRNA和通道蛋白的表达。结果hHCN4重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞后2天和3天较转染前搏动频率明显增加,频率高于对照组;hHCN4重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞后,可检测到hHCN mRNA和通道蛋白表达,而对照组无表达。结论hHCN4转染心肌细胞的搏动频率增加,hHCN4基因转导入心肌细胞构建生物起搏器的方法具有初步可行性。     

不同剂量辛伐他汀对多柔比星导致的乳鼠心肌细胞损伤的保护作用

目的探讨辛伐他汀（SIM）对多柔比星（DOX）损伤乳鼠心肌细胞的保护作用。方法新生SD大鼠（乳鼠）心肌细胞随机分为5组,对照组不予任何药物,正常培养;DOX组予1μmol/L DOX,SIM低、中、高剂量组分别在给予1μmol/L DOX基础上予11、0、20μmol/L SIM,继续培养24 h后,倒置相差显微镜下测定各组心肌细胞搏动频率,流式细胞术检测凋亡率,Western blot法检测钙释放通道（RyR2）蛋白表达情况。结果 DOX组及SIM低、中、高剂量组的心肌细胞搏动频率、RyR2表达均明显低于对照组,凋亡率均明显高于对照组,P均〈0.05;SIM低、中、高剂量组的心肌细胞搏动频率、RyR2表达均明显高于DOX组,凋亡率均明显低于DOX组,且呈剂量依赖性,P均〈0.05。结论 SIM对DOX损伤乳鼠心肌细胞有保护作用,且呈剂量依赖性,其机制可能与提高RyR2表达有关。     

Pro-arrhythmogenic potential of immature cardiomyocytes is triggered by low coupling and cluster size

OBJECTIVE: Cell transplantation strategies to regenerate compromised myocardium take advance of in vitro generated cardiomyocytes. Common in those immature myocytes is spontaneous impulse formation and a restricted ability to establish proper electrical interaction. Spontaneous impulse formation and impaired cell-to-cell coupling have been shown to be arrhythmogenic. To investigate whether these features harbour a pro-arrhyhmogenic potential for cell transplantation, a co-culture of spontaneously active neonatal rat cardiomyocytes (NRC) and quiescent adult dog cardiomyocytes (ADC) was used. METHODS: ADCs and NRCs were isolated and cultured on laminin-coated substrates. Connexin43, N-cadherin and alpha-actinin expression was evaluated with immunohistochemistry. Intercellular coupling was measured in cell pairs using the dual voltage clamp technique and fluorescent dye injection. RESULTS: One day after isolation, NRCs were beating spontaneously, while ADCs remained quiescent in monoculture. ADC resting membrane potential was -80.3+/-0.2 mV (mean+/-SEM, N=24) and did not change significantly over time. NRCs had a maximal diastolic potential of -65.0+/-2.8 mV (N=4). After one day of co-culture, pseudopodia-like extensions developed at the former intercalated discs of ADCs, contacting the NRCs. Only ADCs that contacted three or more NRCs started to beat in synchrony. Expression of connexin43 and N-cadherin indicated presence of electrical and mechanical junctions at the interface between the two cell-types. Transfer of Lucifer Yellow demonstrated junctional permeability between ADCs and NRCs. Junctional conductance between ADC-ADC (31.9+/-5.1 nS, N=10) and NRC-NRC (35.0+/-9.6 nS, N=6) pairs was significantly higher compared to ADC-NRC pairs (9.7+/-2.9 nS, N=8). Gap-junctional blockade with halothane reversibly abolished NRC-triggered beating of ADCs. Computer simulations demonstrated that within a delicate 'window' of gap junctional conductance small clusters of spontaneously active cells are able to induce triggered activity in quiescent mature myocytes but also in a two-dimensional sheet of ventricular cells. CONCLUSION: Spontaneously active immature cardiomyocytes are able to trigger mature cardiomyocytes depending on their level of electrical coupling and the amount of coupled immature myocytes.     

羟自由基诱导心肌细胞损伤时ATP酶等变化

目的　探讨外源性羟自由基诱导乳鼠心肌细胞损伤的作用机理。方法　采用 Fe SO4 / H2 O2 产生系统 ,羟自由基诱导心肌细胞损伤 ,观察乳鼠心肌细胞内 Na+、K+ - ATP酶 ,Ca2 +、Mg2 + - ATP酶和丙二醛 (MDA)含量及其上清液中乳酸脱氢酶 (L DH)与一氧化氮 (NO)含量变化。结果　心肌细胞中 Na+、K+ - ATP酶 ,Ca2 +、Mg2 + - ATP酶减少 ,MDA含量增加 ,与对照组相比较 ,具有显著性差异 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 ,P<0 .0 1) ;上清液中 L DH和 NO漏出增加 ,与对照组相比较 ,均具有显著性差异 (P<0 .0 1)。结论　羟自由基诱导心肌细胞中 Na+ 、K+ - ATP酶 ,Ca2 + 、Mg2 + - ATP酶减少 ,MDA及其上清液中 L DH和 NO漏出增加。从而揭示外源性羟自由基可能通过增加膜脂质过氧化 ,引起 ATP酶失活及膜结构破坏等 ,是导致心肌细胞死亡的机理之一     

微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞表型分化的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hBMSC)在非接触共培养的微环境中向心肌细胞分化的能力.方法 密度梯度离心法分离培养hBMSC,用流式细胞仪鉴别其表面标记特征.采用transwell按1:10的比例共同培养hBMSC和SD乳鼠心室肌细胞.用聚合酶链反应检测心肌转录因子GATA4的基因表达水平.免疫细胞化学、免疫荧光检测横纹肌α-辅肌动蛋白、结蛋白、肌钙蛋白(cTn)T和cTnI等心肌细胞标志蛋白的表达.结果 hBMSC的标志物主要为CD29(98.64%±0.80%)和CD44(96.70%±1.50%),而极少表达CD105(2.21%±0.60%)、CD11b(0.80%±0.05%)、CD45(1.39%±0.13%)和CD34(1.73%±0.08%).与心肌细胞共培养后第7天可在hBMSC细胞中观察到少量搏动的细胞,随着诱导时间的增加,细胞的搏动更规则、有力.与心肌发育有关的转录因子GATA4基因在诱导后1、2、3周均有表达.共培养后2周,检测的心肌标志蛋白均有阳性表达,分别是结蛋白,α-辅肌动蛋白,cTnI和cTnT.荧光标记也检测到cTnT和cTnI的阳性表达.结论 hBMSC具有向心肌细胞分化的潜能,在共培养的微环境中,可以分化成心肌细胞表型,其机制是通过心肌细胞的旁分泌作用,而不需要hBMSC与心肌细胞的直接接触.