HBV信号肽区热点变异真核表达载体的构建及对HBeAg表达的影响

采用分子生物学方法,设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增HBV的Pre－C／C片段（1814－2452）,经酶切后连于EBO真核表达载体,利用定点突变技术分别对连接载体进行了T1862,A1896,A189,A1896＋A1899点的定点诱变。经错配PCR－RFLP和测序, 克隆。将突变前后的质粒以脂质体转染法转染HepG2细胞,检测不同点突变后HBeAg表达的改变,突变前后质粒转染HepG2细胞经稳定表达,结果未突变的EBO－PreC/C重组质粒HBeAg表达为强阳性,A1899突变的重组质粒HBeAg表达比未突变的重组质粒稍弱,而转染EBO空载体和T1862,A1896,A1986＋A1899重组质粒突变体的细胞培养上清HBeAg均为阴性,上述体的构建将为体外研究前C信号肽区热点变异对HBeAg在细胞中表达及对肝炎病毒基因组复制的影响奠定基础。     

肺癌相关基因LSCC-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建含有肺癌相关基因LSCC-3全长ORF片段的真核表达载体,并验证其在细胞内的表达。方法PCR方法获取LSCC-3基因全长ORF片段,构建含有上述片段的真核表达载体（含3’端绿色荧光蛋白尾）并验证、纯化;将该真核表达载体转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下对LSCC-3基因的表达进行观察和验证。结果成功将LSCC-3基因全长ORF片段装入真核表达载体pLPS-3’EGFP（pLPS-LSCC-3-3’EGFP）并转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下观察到了核外细胞浆内LSCC-3基因蛋白表达产物的存在。结论成功构建了LSCC-3真核表达载体pLPS-LSCC-3-3’EGFP,该载体可在肺癌细胞胞浆内顺利表达。     

辐射诱导表达载体pEgr-p16的构建及其体外蛋白表达的研究

目的构建辐射诱导表达载体pEgr—p16并研究其体外稳定转染联合^60Co．γ射线照射对人宫颈癌HeLa细胞p16蛋白表达变化的影响。方法利用双酶切、粘端连接的方法构建了含有辐射诱导特性的早期生长反应因子Egr-1和p16的pEgr—p16的质粒载体，以脂质体介导的方法，将重组载体导入人HeLa细胞，采用免疫细胞化学和流式细胞术的方法检测照射转染后的HeLa细胞p16蛋白表达的变化。结果经全自动测序证明辐射诱导表达载体pEgr—p16构建正确；稳定转染可见有明显的p16表达增强；5Gy以内p16蛋白表达呈剂量依赖性的增加，在2Gy照射后2hp16蛋白表达水平即开始增高，4h达到最高，12h趋于正常水平。结论本研究成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-p16，在HeLa细胞中蛋白表达明显增强。     

C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

人表皮生长因子基因的克隆及其真核表达载体的构建

人表皮生长因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｈＥＧＦ）具有促进表皮细胞增殖的作用，与免疫性皮肤病及创面组织修复有着密切的关系。随着分子生物学理论和技术的发展，人们对外源性基因在真核系统中表达的机理有了进一步了解〔１〕。为了进行ｈＥＧＦ基因的真核表达及表皮组织基因治疗方面的研究，我们采用逆转录ＰＣＲ方法扩增了ｈＥＧＦ及其信号肽基因，并选用ｐＢＫＣＭＶ穿梭质粒构建了ｈＥＧＦ基因真核表达质粒。１　材料和方法１．１　主要试剂限制性内切酶ＮｈｅⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ及Ｔ４Ｄ…     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。     

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的：表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugomushi)Karp株56000表面蛋白，探索其作为诊断抗原的可能性。方法：采用PCR方法，从Ot．Karp株菌种基因组DNA中扩增出56000成熟蛋白基因片段，将该片段克隆于原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30／56，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果：(1)获得长约l500bp的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因；(2)SDS-PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为56000的独特蛋白带；(3)表达后菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在；(4)重组表达质粒序列分析结果显示，pQE30／56中插入的基因片段的序列与已报道的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因序列基本一致。结论：获得了Ot．Karp56000蛋白基因，并在大肠杆菌中实现了表达，表达的重组蛋白具有免疫反应性。     

烷烃羟化酶基因alkB表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的 构建烷烃羟化酶基因alkB表达载体并检测其在大肠杆菌的表达.方法 体外合成alkB基因,选择烷烃表达载体pCom8,构建含alkB基因的重组质粒pCom8-alkB,并采用CaCl2法将其转入大肠杆菌DH5α中,通过十二烷基碘酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测不同诱导条件下的alkB基因表达的变化.结果 构建的含alkB基因的重组质粒在DH5α中得到有效表达,且随诱导时间的延长而增加,在柴油诱导浓度为2％～3％(V/V)时,目的蛋白表达量相对较大.结论 成功构建了含alkB基因的表达载体,阐明了不同诱导条件对目的蛋白表达的影响规律.     

SP110基因过表达慢病毒载体的构建与包装

目的 构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法 利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用RNAi-Mate将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)包装成重组慢病毒颗粒,共转染293T细胞,包装产生慢病毒。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞,结合稀释倍数计算病毒滴度。结果 酶切鉴定结果显示产生约1 650 bp的片段,片段大小与SP110基因cDNA大小一致。DNA测序比对测序结果与预期SP110基因序列完全一致,说明SP110基因正确插入载体中,成功构建了SP110基因过表达载体。经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为1.0×108 TU/mL的重组慢病毒LV5-SP110。结论 SP110基因过表达慢病毒载体构建与包装成功完成,为进一步探讨SP110基因在结核病发生发展中的作用提供工具。     

人hTERT基因的pCIneo真核表达载体的构建Q78

构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）片段的基因的pCIneo真核表达载体。方法：根据hTERTmRNA序列设计引物,人胚肾转化细胞系293总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增后克隆到载体pCIneo上,并进行酶切鉴定及测序。结果-酶切结果表明hTERT基因已经插入pCIneo真核表达载体,测序结果显示,核苷酸序列的同源性为99．89％,氨基酸序列的同源性为100％。结论：成功构建hTERT基因的pCIneo真核表达载体,为其下一步的研究奠定了基础。     

HBe抗体阳性的乙型肝炎活动与静息HBV X基因变异的对比研究

为研究乙型肝炎病毒（HBV）X基因变异是否与e抗体阳性的HBV感染的不同临床现象相关,对14例e抗体阳性的无症状携带（AsC)及14例e抗体阳性的慢性活动性肝炎（CAH）病人的血清HBV X基因进行了克隆、测序研究。结果显示,14例AsC中,12例（85.7%）X基因上出现核苷酸插入、缺失、点突变,导致X基因编码的框移而提前终止,或提前出现终止密码子,从而使X蛋白被截短;而14例CAH匀编码154个氨基酸的完整的X蛋白,没有出现上述X基因的变异（P＜0.01）。本研究表明,X基因变异所致的X蛋白截短与e抗体阳性肝淡静息的无症状携带临床现象密切相关。     

腺病毒表达Ribozyme在细胞内对HBV的免疫作用

了解利用腺病毒腺体表达针对乙型肝炎病毒（HBV）的核酶在细胞内对HBV表达的抑制作用。将针对HBV的多位点核酶克隆入腺病毒载体中，利用包装细胞包装出含核酶及突变核酶的重组腺病毒，将腺病毒感染2．2．15细胞（含HBV），检测感染细胞中核酶及突变核酶的表达，利用ELISA，打点杂交及激光共聚光共聚焦等方法，检测核酶对细胞内乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果显示核酶及突变核酶的确被克隆入腺病毒载体，并经过包装后可形成包装腺病毒，感染2．2．15细胞后可表达出目的核酶，并发挥核酶的剪切作用，其对HBV表达的抑制率最高可达87．1％。证实包装腺病毒表达的多位点核酶对HBV的复制有明确的抑制作用，支持核酶的抗病毒效果，有希望成为HBV治疗的潜在方法之一。     

HCVC区、E1区基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd·HCV—CE1的构建、鉴定及表达

用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVCE1基因上、下游引物,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCVCE1基因片段,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-CE1。通过BgiⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定,证实了pAd.HCV-CE1插入片段为HCVCE1区基因片段,以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法证实 pAd.HCV-CE1可以在人肝癌细胞7721中瞬时表达。以上结果初步表明,构建的质粒pAd.HCV-CE1可以表达HCVCE1区基因,为进一步包装能高效表达HCVCE1基因的腺病毒载体奠定了基础。     

乙型肝炎病毒前S1基因酵母表达载体的构建及表达

为探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S1蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HBV前S1基因。以HBV ayw亚型全长质粒pCP10为模板，多聚酶链反应（PCR）扩增HBV前S1基因，克隆到pGEM-Tfawsk ,双酶切后回收与酵母表达质粒pGBKT7连接，将重组载体转化酶母细胞AH109，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析，结果成功地构建了HBV前S1基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示HBV前S1在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，分子量30kD左右。表明HBV前S1蛋白在酵母细胞中表达成功。     

HCV包膜蛋白E2的表达及其抗原性的检测

为研究丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2在原核细胞和真核细胞中的表达，并对表达蛋白的抗原性进行检测。将HCV E2区N端的一段基因分别克隆入原核表达载体pQE30和真核表达载体pEF1/HisC中进行E2蛋白的表达，采用ELISA和WB对表达蛋白的抗原性进行检测。结果在原核细胞和真核细胞中均表达了预期大小的蛋白，能同HCV感染者血清发生特异性反应。提示该段E2基因在原核表达系统和真核表达系统均能表达出具有抗原活性的蛋白，其中真核细胞表达的蛋白可被糖基化。     

鼠伤寒沙门菌stn基因突变株的构建与毒力检测

作者构建了鼠伤寒沙门菌肠毒素（stn）基因插入失活型与失型突变的重组自杀载体质粒,通过重组自杀质粒中的突变stn基因与鼠伤寒沙门菌株2000染色体上野生型stn基因发生同源交换,筛选获得stn基因突变的同源突变菌体。在小鼠体内检测菌株stn基因产物生物活性的结果表明,突变菌株诱发小鼠肠液分泌的能力较野生菌株明显减弱,而小鼠口服突变菌株的半致死剂量较野生株明显增高,提示stn基因是鼠伤寒沙门菌致病机制中一个较为重要的毒力因子。     

治疗型双质粒HBV DNA疫苗的构建及其鉴定

为构建以人白细胞介素 2 /γ干扰素(hIL 2 /hIFN γ)融合基因为佐剂的治疗型HBVDNA疫苗 ,采用DNA重组技术分别构建含有HBV包膜中蛋白 (preS2 ·S)抗原和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白的真核表达质粒即pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF ,酶谱和测序分析表明克隆的preS2 ·S和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白基因片段的方向、序列与预期相符。用脂质体转染试剂转染COS 7细胞 ,并用ELISA检测转染细胞培养上清中目的基因表达水平。结果显示 ,质粒转染后 4 8h达峰值 ,分别为HBsAg(P/N) =7.6 3、IL 2 =1 0 .35ng/ml、IFN γ =7.90ng/ml。以CTLL 2依赖细胞株/MTT比色法和微量细胞病变抑制法 (WISH VSV)检测pcDNAIIF转染后 4 8h培养上清中IL 2及IFN γ活性 ,结果分别为 998U/ml和 2 4 9U/ml。证明构建的重组质粒pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF结构正确 ,在体外转染细胞其质粒得到分泌表达并保留生物学活性     

丙型肝炎病毒NS5B基因的克隆及在大肠杆菌的分泌表达

由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性，其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B，作者对NS5B进行截短，缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCV NS5B基因，并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）的方法，设计截去NS5B疏水部分，PCR引物以HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板，克隆到pGEM-Teasy载体中，双酶切后回收连接到pET-21b中表达。大肠杆菌培养上清过柱纯化，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹显示NS5B蛋白在大肠杆菌细胞中表达。表达产物在大肠杆菌培养上清中存在，分子量68kD左右，而且[^3H]总掺入率达6900cpm。NS5B蛋白在大肠杆菌上清中表达成功，经过活性测定，所表达的NS5B具有活性功能。