Semi-quantitative analysis of cytokine gene expression in blood and cerebrospinal fluid cells by reverse transcriptase polymerase chain reaction

An easy, reproducible and semi-quantitative, non-radioactive method for the analysis of mRNA expression for various cytokines, (i.e., Interleukin (IL)-1β, IL-4, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-α, lymphotoxin (LT), transforming growth factor (TGF)-β, interferon (IFN)-γ and endothelin-1 (ET-1)) in cells from cerebrospinal fluid (CSF) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) has been established. By means of polymerase chain reaction primers that cover a splice junction, amplification of contaminating DNA was omitted. Densitometric scanning of ethidium bromide-stained agarose gels proved to be very sensitive for semiquantitative analysis of PCR products. Serial tenfold dilutions of cDNA revealed a log-linear regression from 10⁶ to 10² cells under optimal cycle conditions. The intra- and inter-assay variability of the method was below 10%. With this assay, the cytokine expression pattern of as few as 10⁴ mononuclear cells from blood or CSF was determined. This method made it possible to detect differences in the cytokine gene expression pattern of mononuclear cells from patients with different neurological diseases. CSF cells from 43 patients with various neurological diseases were analyzed. TNF-α, LT, and IL-1 mRNA were prominent in the CSF cells of most patients with bacterial meningitis. TNF-α, LT, IFN-γ and IL-6 mRNAs were detected in patients with active multiple sclerosis, whereas TNF-α, IL-6, and endothelin-1 mRNA expression was found frequently in patients with HIV encephalitis. Pro-inflammatory cytokines were rarely detected in CSF cells from patients with non-inflammatory diseases of the central nervous system. In blood mononuclear cells from patients with multiple sclerosis, TNF-α mRNA expression was associated with disease activity. The sensitivity, specificity, velocity and reliability of this assay considerably facilitates the analysis of cytokine production in mononuclear cells even in conditions where only a limited number of cells is available for analysis.     

巢式聚合酶链反应对231例白血病融合基因的检测

目的:探讨巢式逆转录聚合酶链反应(巢式RT-PCR)动态检测白血病bcr/abl、PML/RARa及AML/ETO融合基因在白血病诊断、治疗、预后判断的价值。方法:应用巢式PCR法对231例急慢性白血病患者bcr/abl、PML/RARa及AML/ETO融合基因作检测,同时结合患者细胞形态学及临床转归予以分析。结果:94例慢性粒细胞白血病患者中,79例bcr/abl融合基因阳性,阳性率为84.0%;55例急性淋巴细胞白血病患者中,20例bcr/abl融合基因阳性,阳性率为36.4%;50例急性早幼粒细胞白血病患者中,29例PML/RARa融合基因阳性,阳性率为58.0%;32例急性粒细胞白血病M2患者中,9例AML/ETO融合基因阳性,阳性率为28.2%。结论:巢式PCR是一种快速、敏感而准确的检测方法,可为白血病患者提供分子生物学的诊断依据,并可作为微小残留病的监测指标之一。     

荧光定量RT-PCR检测白血病多药耐药基因及其临床意义

目的　在Light-CyclePCR仪上对多药耐药基因 (MDR1)定量的技术方法和临床应用进行探讨。方法　应用荧光定量逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)检测了 30例急性白血病患者和 8例正常人外周血MDR1基因的表达。结果　该实验方法标准曲线线性良好 (r=1.0 ) ,耐药组MDR1基因拷贝数与非耐药组有显著性差异 (P <0 .0 1) ,正常人亦有低水平MDR1基因的表达。结论　荧光逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)是一种可靠的定量方法 ,能快速、特异地检测临床肿瘤标本中MDR1,为临床医生用药、预防MDR发生、考核逆转MDR效果等方面提供了有价值的量化指标。     

复合定量PCR检测谷胱苷肽-S转移酶和多药耐药相关基因mRNA表达水平方法的建立及初步应用

用β－肌动蛋白（β－ａｃｔｉｎ）作内参照，设计不同扩增片段的谷胱苷肽－Ｓ转移酶（ＧＳＴ－π）和多药耐药基因（ＭＤＲ１）引物，建立同时定量检测ＧＳＴ－π和ＭＤＲ１ｍＲＮＡ表达水平的复合定量ＰＣＲ法。扩增条带光密度值用凝胶成像系统检测，基因相对表达水平用目的基因和β－ａｃｔｉｎ光密度比值计算。本法灵敏度高、重复性好，能作批量分析。室内Ｘ控制图可有效控制定量ＰＣＲ扩增和电泳质量，保证本法能检测出小于２倍的表达差异。在乳腺癌组织中ＧＳＴ－π和ＭＤＲ１ｍＲＮＡ中位数分别为０．２７和１．３２，且表达水平呈明显正相关（ｒ＝０．３２３，Ｐ＜０．０５）。     

实时荧光定量PCR检测CD44和RHAMM在胃肠肿瘤中的表达研究

目的探讨CD44和透明质酸介导运动的受体（RHAMM）在胃肠肿瘤组织中的表达,研究其在肿瘤诊断中的价值。方法收集病理分期为Ⅱ～Ⅲ级胃肠道恶性肿瘤样本30例,并通过实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）对CD44和RHAMM进行定量分析。结果CD44和RHAMM在癌组织中相对于管家基因GAPDH的表达中位数分别为1．587和1．074,正常组织中分别为0．704和0．098;肿瘤组织中,区域淋巴结转移组的CD44拷贝数／GAPDH拷贝数的中位数为1．650,未转移组相应的均值为1．431;区域淋巴结转移组的RHAMM拷贝数／GAPDH拷贝数的中位数为1．301,未转移组的中位数为1．064。区域淋巴结转移样本其CD44和RHAMM表达同步增高,肿瘤组织中CD44和RHAMM之间的相关系数（r）为0．96。结论胃肠肿瘤中的CD44和RHAMM表达高于正常组织,且两者表达具相关性。CD44和RHAMM的表达量增加的多少不足以判断肿瘤是否有区域淋巴转移,CD44和RHAMM同时增高可能预示肿瘤的淋巴转移。     

实时定量逆转录PCR检测慢性淋巴细胞白血病中脂蛋白酯酶mRNA的表达及临床意义

目的 研究慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者脂蛋白酯酶(LPL)表达情况,探讨LPL在CLL预后中的意义.方法 采用基于Taqman探针技术的实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)方法检测62例CLL患者及10名健康对照者外周血标本中LPL的表达水平.对LPL表达水平与免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变、ZAP-70蛋白和CD38表达等预后因素进行相关性分析.采用ROC曲线确定LPL表达的最佳分界值,计算其对IgVH突变情况的阳性及阴性预测值.结果 qRT-PCR标准曲线的R2均≥0.990,敏感度可以检测到102拷贝/μg RNA,批内差及批间差变异系数(CV)均小于5%.62例CLL患者LPL表达水平中位数为0.006 0(0～0.737 0).在10名健康对照者中LPL均不表达或低表达,LPL中位表达水平为0(0～0.000 4).在经CD19磁珠分选后的3份CLL患者标本中,LPL相对表达量分别为0.036 0、0.075 0和0.197 0,与分选前表达水平(分别为0.024 0、0.074 0和0.225 0)相似.LPL表达水平与IgVH基因突变情况相关(r=0.45,P<0.05),无突变患者的LPL中位表达水平为0.006 0(0.000 7～0.110 0),明显高于突变患者的LPL中位表达水平[0.002 0(0.000 2～0.027 0)],差异有统计学意义(U=96.5,P<0.05);LPL表达水平与ZAP-70(r=0.38,P<0.05)及CD38(r=0.43,P<0.05)均显著相关.按照IgVH突变情况作为标准对LPL表达水平做ROC曲线分析,确定最佳分界值为0.036 0,敏感度为66.7%,特异度为72.4%,对IgVH突变情况阳性预测值(无突变)为51.8%,阴性预测值(有突变)为83.3%.结论 qRT-PCR方法检测LPL表达敏感可靠.LPL表达水平与CLL重要预后因素IgVH基因突变、ZAP-70、CD38密切相关,并可较准确地预测IgVH突变情况,在CLL的预后中具有重要价值.     

聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性

聚合酶链反应(PCR)技术自1983年问世以来，因其对基因或特定核酸序列在短时间内具有极大的扩增效率，已广泛应用于感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等诊断和研究领域，并在某些方面呈现出几乎难以替代的优势。PCR用于疾病的临床诊断后，使人们对蛋白分子表型的认识，进一步深入到了遗传物质——核酸分子的探索，也使临床检验诊断学科中的临床分子诊断技术得到了飞速发展。像任何自然界的事物一样，PCR虽然有其无可比拟的优点，但也有其一定的局限性。如果在临床实际应用中，不遵循客观规则，也很容易产生非PCR技术问题所致的错误检验结果。     

荧光定量聚合酶链反应检测CCND1基因扩增在乳腺癌诊断中的应用

目的应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法检测细胞周期蛋白D1（CCND1）基因表达水平,探讨其在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用价值。方法应用FQ-PCR法,并以β2-微球蛋白为内对照测定15例健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者外周血中CCND1的表达量。结果CCND1表达水平在健康对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学意义（P〉0．05）,乳腺癌组均高于前2组（P〈0．05）,β2-微球蛋白在3组间差异无统计学意义（P〉0．05）。81例乳腺癌患者阳性率为45．7％,良性乳腺疾病组为0。结论FQ-PCR技术是高度灵敏、高度特异的快速定量检测CCND1方法,可有效监测乳腺癌的诊断：疗效、转移,评估其预后。     

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的探讨优化实验反应条件,使实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果.方法建立质粒标准品作为外参照;以管家基因GAPDH作为内参照,并对Mg2+、引物与探针比例、Buffer等进行优化.结果优化条件后,RT-PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致,保证了方法的稳定性和可靠性.结论为了获得可靠、重复性好的实时RT-PCR绝对定量结果,应对实验方法进行优化.     

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的　探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法　建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果　优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论　为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。