重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

rhIL-24对黑色素瘤B16细胞的体内外抑瘤作用

目的 研究重组人白细胞介素24（rhIL-24）及真核表达基因重组质粒pcDNA3．0-hIL-24对黑色素瘤B16细胞（B16细胞）及其荷瘤小鼠体内外抑肿瘤作用。方法 用rhIL-24蛋白作用于小鼠B16细胞,检测其对B16细胞的生长抑制作用及诱导凋亡作用,并用rhIL-24蛋白及pcDNA3．0-hIL-24治疗荷瘤小鼠。结果 rhIL-24蛋白对体外培养的B16细胞具有显著的抑制生长和诱导凋亡作用,rhIL-24蛋白及pcDNA3．0-hIL-24对C57／BL6小鼠体内形成的恶性黑色素瘤具有明显的抑瘤作用。结论 rhIL-24蛋白具有生物活性,他及真核表达重组质粒对B16细胞及其小鼠种植瘤生长有抑制作用,并能诱导肿瘤细胞凋亡及促进其分化。     

人IL-24基因在CHO细胞中的表达及其抗肿瘤效应

目的构建人IL-24基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-24的抗肿瘤活性。方法将测序验证的人IL-24基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组真核表达载体pcDNA3-hIL-24,转染CHO细胞进行稳定表达,经RT-PCR鉴定后用MTT法、Ho-echst染色和流式细胞术检测CHO细胞表达的rhIL-24诱导A549人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应,用ELISA检测其刺激免疫细胞分泌IL-6和IFN-γ的功能。结果经双酶切和PCR鉴定,重组真核表达载体构建正确,人IL-24在CHO细胞中获得稳定表达,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达IL-6和IFN-γ的免疫刺激活性。结论人IL-24基因的稳定表达和抗肿瘤效应的实验研究,为进一步研究人IL-24抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

HIV核衣壳蛋白p24在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化

目的 用基因工程方法获得HIVp24蛋白编码区基因片段,构建重组质粒,并在大肠杆菌中高效表达目的 蛋白. 方法 设计带有酶切位点的引物,扩增p24基因,分别连接到pET-11c和pET-16b载体上,将两种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达.选择离子交换层析和分子筛层析纯化p24. 结果 p24在大肠杆菌中高效表达,p24在非还原性电泳中呈单一条带,提示有较好的立体结构,p24-pET-16b的表达量占到总蛋白表达量的30%.经纯化后蛋白纯度达到90%以上.  结论 p24能在大肠杆菌中高效表达.     

EGCG通过调控胱天蛋白酶介导的NLRP3炎症小体激活抑制LPS+Aβ诱导BV2细胞的炎症反应

目的从离体水平研究胱天蛋白酶11介导的NLRP3炎症小体激活在表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对LPS+Aβ诱导的BV2细胞炎症反应的抑制作用及其可能机制。方法应用LPS+Aβ诱导的BV2细胞建立MG活化模型,建立空白对照组,LPS+Aβ组,LPS+Aβ+EGCG组。实时PCR、Western印迹和ELISA检测EGCG对BV2细胞Iba-1表达及相关炎性因子IL-1β,IL-18的转录、表达和分泌水平。与SH-SY5Y进行条件培养,流式细胞术和CCK8检测SH-SY5Y细胞的存活率。Western印迹、免疫荧光等检测EGCG对BV2细胞胱天蛋白酶1与Iba-1的共定位、胱天蛋白酶1活性、胱天蛋白酶1 P20和胱天蛋白酶11 P26的蛋白表达水平。应用胱天蛋白酶11抑制剂wedelolactone处理LPS+Aβ诱导的BV2细胞。结果 (1) EGCG在降低LPS+Aβ诱导的BV2细胞Iba-1表达,抑制炎性因子IL-1β,IL-18的转录、表达和分泌水平,提示EGCG可抑制MG活化及其介导的炎症反应。(2) EGCG显著增加与LPS+Aβ诱导的BV2条件培养的SH-SY5Y细胞的存活率,提示EGCG可通过抑制MG内炎症反应改善神经元存活,发挥神经保护作用。(3) EGCG可显著降低LPS+Aβ诱导的胱天蛋白酶1与Iba-1共定位,胱天蛋白酶1活性及胱天蛋白酶1 P20、胱天蛋白酶11 P26蛋白的表达水平,提示EGCG抑制MG活化与其抑制胱天蛋白酶11表达和NLRP3炎症小体介导的炎症反应有关。(4)与EGCG处理一致,wedelolactone可降低LPS+Aβ诱导的胱天蛋白酶11 P26及胱天蛋白酶1 P20,IL-1β,IL-18和Iba-1的蛋白表达水平,提示胱天蛋白酶11可促进LPS+Aβ诱导的NLRP3炎症小体激活,而EGCG可抑制胱天蛋白酶11介导的NLRP3炎症小体激活。结论 EGCG通过抑制胱天蛋白酶11介导的NLRP3炎症小体激活抑制LPS+Aβ诱导BV2细胞的炎症反应,发挥神经保护作用。     

非融合rIL-24蛋白的制备及活性鉴定

目的制备非融合的rIL-24蛋白,鉴定其体外诱导肿瘤细胞凋亡活性。方法为制备非融合IL-24蛋白,将IL-24基因插入到pET32a(+)上KpnⅠ与BamHⅠ之间,构建表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coliBL21(DE3)中表达。洗涤后的包涵体溶解在2 mol/L尿素(pH9.0)中,采用镍离子亲和色谱和凝胶分子筛的二步法纯化,肠激酶酶切(肠激酶与蛋白1∶400,pH7.5处理36 h),再用亲和柱色谱纯化制备非融合的rIL-24。MTT法和形态学观察分析rIL-24体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。结果重组工程菌以包涵体形式表达出相对分子质量约为35 000的融合蛋白。包涵体经洗涤、溶解及二步纯化得到纯度大于95%的Trx-IL-24。融合蛋白用肠激酶酶切之后,经亲和色谱制备得到纯度大于98%的非融合蛋白rIL-24。rIL-24显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05),而对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。结论IL-24基因在E.coli中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的非融合蛋白rIL-24,预示其具有肿瘤治疗应用的前景。     

IL-10基因克隆化与原核重组IL-10蛋白制备的实验研究

目的克隆化人IL-10基因及重组蛋白的制备为IL-10基因表达在小儿炎症性、过敏性疾病中的作用及治疗等提供有力的证据。方法采用过敏症患者发作时期的外周血,提取总RNA。以总RNA为模板,特异性引物进行反转录,RT-PCR进行IL-10基因筛选。PCR产物经酶切分析和DNA序列测定后,构建重组质粒pTrchHis2B-hIL10原核高效表达载体,通过大肠杆菌(工程菌)JM109经IPTG诱导表达重组hIL-10蛋白,并经与Ni-NTA树脂中的6×His配体结合进行亲和层析纯化,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果DNA测序显示克隆化人IL-10全长开放读框准确,表达读码框正确。SDS-PAGE分析显示,原核表达系统表达的重组蛋白量和纯度满意。结论采用以总RNA为模板的RT-PCR一步法,能简便、可靠地获得hIL-10基因产物,所构建的原核表达载体pTrcHis2B-hIL10,能够快速、高效制备rhIL-10蛋白,为细胞因子hIL-10功能的进一步研究及临床应用奠定了基础。     

人白细胞介素4剪接变异体的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获取一株重组人白细胞介素4选择性剪接变异体(IL-482)蛋白的高效表达菌株,为研究变态反应性疾病的发病机制以及阻滞IL-4的生物学效应奠定基础。方法:分离人外周血琳巴细胞,提取mRNA,RT- PCR获得人IL-482基因后,克隆入大肠杆菌表达载体,构建高效表达人IL-482的重组菌株。结果:成功构建了人IL-482的高效表达菌株(TNFHis-hIL-482),序列测定与文献报道一致。SDS-PAGE分析显示此菌株所表达的目的蛋白产物的相对分子质量为3．4×104,与预期结果相符。光密度扫描重组hIL-482蛋白质占细菌总蛋白的30％。结论:在大肠杆菌中成功地表达了hIL-482基因。     

人血管内皮细胞生长因子基因克隆、表达与纯化

目的研究人血管内皮细胞生长因子121(hVEGF121)基因在pET-24a(+)中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的rhVEGF121。方法提取人原髓白血病细胞(HL60)总RNA,RT-PCR扩增hVEGF121基因,经DNA序列分析后,克隆于高效原核表达载体pET-24a(+),并转化到大肠杆菌B121(DE3)中,经IPTG诱导表达,超滤复性,DEAESephamseFastFlow阴离子交换和SephacryS-100分子筛色谱纯化后,以HUVEC测定其生物学活性。结果SDS-PAGE结果显示,目的蛋白质以包涵体形式存在,表达量达菌体总蛋白质的20%,纯化后rhVEGF121纯度达95%以上,生物学活性检测证实,具有刺激HUVEC增殖的功能。结论在原核系统中实现了hVEGF121的高效表达。     

rhIL-6表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

通过PCR技术扩增出约0.5kb的IL-6基因片段,并且采用含有P_RP_L串联启动子及SD区的高效表达载体pBV_220,经DNA重组技术,成功地构建了rhIL-6的基因工程菌E.coli DH_5a/pBV_220IL-6。所表达的IL-6经SDS-PAGE证明约17.5kD,表达量占菌体总蛋白的30%以上。以IL-6依赖细胞株MH_60·BSF_2检测,表达产物粗提物1:100复性后效价可达到5×10~8u/ml,每升发酵菌液可获10~12u IL-6粗品。     

pCEP4/hIL-17真核表达载体的构建及表达

目的构建pCEP4/hIL-17载体及在真核细胞中表达hIL-17/mFc融合蛋白;初步研究IL-17生物学特性。方法采用RT-PCR的方法克隆hIL-17CDS段基因序列;将测序正确的hIL-17序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/IL-17真核表达载体,转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞后,筛选阳性表达细胞株;并用RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定IL-17基因的mRNA和蛋白表达;流式细胞术分析纯化的蛋白对Raji细胞表达的hIL-17受体的结合能力;以体外实验验证其促炎症作用。结果成功构建了pCEP4/hIL-17重组载体,并在CHO细胞中稳定表达;所获得hIL-17重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17受体;体外刺激HeLa细胞,能明显促进IL-6等炎症因子的分泌。结论稳定表达hIL-17重组蛋白的CHO细胞系的建立,为进一步研究hIL-17的生物学功能奠定了良好的基础。     

R2细胞用于测定人白介素6受体的生物活性

目的　确定可靠的筛选小分子人白介素 6(IL 6 )受体拮抗剂先导化合物的细胞模型。方法分别用间接免疫荧光法和MTT检测法检测了R2细胞的人IL 6受体蛋白表达水平和对重组人白介素 6(rhIL 6 )的反应性。结果　检测到R2细胞具有高丰度的人IL 6受体蛋白表达并对rhIL 6具有极为灵敏的反应性和极高的亲和力 ;用R2细胞检测抗人IL 6单克隆抗体对rhIL 6的拮抗活性 ,发现单抗在 2 0mg·L- 1浓度下对rhIL 6所引起的R2细胞的增殖有很强的抑制作用 ,抑制率达 92 %。结论　R2细胞是可靠的筛选人IL 6受体拮抗剂的细胞模型     

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大肠杆菌中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌(E.coli)中表达广西眼镜蛇(黑眼镜蛇)蛇毒神经生长因子(NGF)成熟蛋白并检测其生物活性。方法将天然广西眼镜蛇蛇毒的NGF蛋白基因克隆至融合表达载体pET-40b(+)中,以C端融合了6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达NGF蛋白。超声破菌后,将上清液经Ni~(2+)-NTA柱纯化,收集并冻干NGF融合蛋白,用蛋白印迹法分析其NGF抗原活性,并通过促PC12细胞生长法观察其生物活性。结果经蛋白印迹分析可知在38 ku处的条带具有NGF抗原活性。加入天然蛇毒NGF,生长轴突的PC12细胞为(83±3)%,重组品为(21±3)%,表明经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,但活性弱于天然蛇毒NGF。结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的蛇毒NGF蛋白。     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。