人胚植入后全胚胎体外培养初探

全胚胎培养(whole embryo-culture,WEC)技术广泛应用于发育生物学、胚胎学、畸胎学、毒理学及药理学等学科的研究,人们已经成功地进行了鸟、鸡、蝾螈、大、小鼠、豚鼠、蛙、兔等的全胚胎培养。用体外整体活胚胎培养方法来揭示哺乳类动物胚胎在子宫内发育的奥秘足一种行之有效的研究手段,而人类早期胚胎发育过程的在体及离体研究由于技术所限尚有一定困难,人们更多地借助于动物模型来丰富自己     

全胚胎体外培养技术的建立及评价

全胚胎体外培养技术是近年来发展起来的一项难度较大的新的实验方法,在胚胎学、畸胎学和毒理学等研究领域具有重要的应用价值.本文详细讨论了此项技术的建立及评价.     

小鼠胚胎心脏心外膜细胞体外培养模型的建立

背景：胚胎心脏心外膜细胞是最近被发现的具有分化为心肌细胞和血管平滑肌细胞潜能的心脏干细胞,可分化为心脏三系细胞,为心脏损伤的再生提供了新的细胞来源,但其定向分化机制及调控因素仍不清楚。目的：体外建立小鼠胚胎心脏心外膜细胞培养模型。方法：解剖显微镜下分离11.5-12.5 d小鼠胚胎心脏,剪除肺静脉血管、心房组织及左心室,移至6孔板(或35 mm培养皿)培养,24 h后移走胚胎心脏组织继续培养。相差显微镜观察胚胎心外膜细胞生长特点;使用免疫荧光技术对细胞进行胚胎心外膜细胞特异性抗体Wt-1、Tbx18染色。结果与结论：胚胎心外膜单层细胞从组织块边缘长出,呈鹅卵石样,并围绕组织块向外延伸。移去胚胎心脏后细胞继续生长,且增殖迅速,三四天后长至融合。所有细胞均强阳性表达胚胎心脏心外膜细胞特异性抗体Wt-1及Tbx18。结果表明,胚胎心脏心外膜细胞生长迅速、形态单一,均表达心外膜细胞特异因子,细胞纯度高,成功构建了体外胚胎心脏心外膜细胞培养模型,为研究其定向分化的分子机制提供了新的 思路。     

毫米波辐射对植入前小鼠胚胎及早期胚胎的影响

本文报道小鼠受精卵体外及在体受毫米波辐照后一些改变。毫米波源为36.11GHz固态微波连续发生器,波长8mm,功率密度为10mW/cm~2、8mW/cm~2、4mW/cm~2及2mW/cm~2。结果发现2-4mW/cm~2毫米波辐照即可使体外培养之受精卵细胞表面微绒毛减少、脱落,细胞表面形成许多囊泡。透射电镜下可见细胞间隙扩大、胞浆中线粒体膨胀、空化,用FITC-ConA试验可见细胞表面结合荧光减少。酶试验证明辐照后卵胚细胞表面AKP,ATPase,5′-Nase均有降低。在体受精卵细胞经辐射后证明,辐射可使胎儿体重增长减慢,囊胚形成数量下降,植入率降低,而表面酶下降不明显。     

小鼠胚胎整体原位杂交实用技术的建立

目的 优化小鼠胚胎整体原位杂交及数据分析方法。方法 小鼠胚胎用4％多聚甲醛4％固定过夜,10mg／L蛋白酶K(PK)室温消化30min,预杂交2h后,加入探针63℃反应16～18h,用盐溶液高温洗涤多次,RNA酶37℃消化1h,封闭4h后加入地高辛抗体4℃过夜。抗体反应后反复洗涤并在水平摇床上振摇,NBT和BCIP显色系统避光显色。提取图像灰度值,扣除背景、对照等假阳性信号。结果 KIAA1708探针在脑、脊髓等8个区域有杂交信号,对图像数据分析结果表明,只有1个区域的信号在95％可信限范围内,为阳性信号。结论 通过控制蛋白酶K消化时间、探针和地高辛抗体浓度,以及洗涤、显色过程,得到了低本底、着色清晰的杂交结果,结合图像的数据分析步骤,消除假阳性结果。建立了一套实用的小鼠胚胎整体原位杂交方法。     

胚胎体外培养及胚胎干细胞系的建立

背景：人类胚胎干细胞体外建系成功,对人类胚胎发育机制和发育生物学研究、细胞和组织移植治疗某些疾病等领域都有重大意义。目的：综述近年来关于胚胎体外培养及建立胚胎干细胞系的研究进展,重点探讨胚胎体外培养影响因素、人废弃胚胎培养分离内细胞团建立胚胎干细胞系的方法及建立胚胎干细胞系的条件。方法：以“胚胎(embryo),胚胎干细胞(embryonic stem cell),共培养(co culture),序贯培养(sequential culture)”为检索词,由第一作者检索2000至2014年CNKI数据库和SCI数据库,获取有关胚胎体外培养、移植及胚胎干细胞建系的相关文献,并进行系统评价,最终保留58篇文献进行分析。结果与结论：胚胎体外培养条件是影响胚胎移植结局的重要因素,其中包括培养液的成分和培养体系。在过去的研究过程中,培养液的构成及应用已经发生了很大的变化,培养体系也从单一培养发展到共培养、序贯培养。伦理问题及胚胎来源的限制束缚着人胚胎干细胞系的建立,利用临床废弃的低质量的胚胎可作为建立人胚胎干细胞系的材料来源之一,有效的缓解了建立人胚胎干细胞系过程中胚胎缺乏的问题,并减少其中的伦理学纷争。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

小鼠胚胎干细胞植入大鼠脑内分化的研究

观察小鼠胚胎干细胞植入大鼠隔区和海马内之后的分化状况。以 SD大鼠为宿主 ,将胚胎干细胞移植入宿主隔区和海马内 ,移植后在 l、2、3、4和 8周取脑 ,冰冻切片 ,进行 Nissl染色和 M6、NSE、GFAP免疫组织化学反应。胚胎干细胞移植入大鼠隔区和海马之后 ,从第 2周开始表达 M6、GFAP、NSE等抗原 ,持续至第 4周 ,主要位于移植区内 ,较少迁移。小鼠胚胎干细胞移植入大鼠隔区和海马内之后 ,分化为神经元和神经胶质细胞     

小鼠胚胎干细胞体外培养的新方法

正维持胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)增殖同时抑制其分化倾向,才能保持ES分化全能性~([1-4])。小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)是研究细胞增殖分化等领域的有效手段~([5-6])。mESCs体外培养有无饲养层法和有饲养层法。无饲养层法是加入抑制mESCs分化的白血病抑制因子(1eukemia inhibitory factor,LIF),但LIF价格昂贵,培养代价     

小鼠胚胎体外培养方法的改良

目的改进胚胎培养系统以进一步提高胚胎质量与发育潜能。方法采用内径0.21mm、外径0.28mm的塑料毛细管培养胚胎,将吸有胚胎的毛细管浸在盛有蒸馏水的烧杯内,再将烧杯放置在培养箱里的磁力搅拌器上,允许胚胎在微小的空间内发育并伴随着水的旋转而摆动,更好地模拟了胚胎在输卵管中的运动环境。结果分别对85枚、82枚2-细胞胚胎进行毛细管及微滴培养,其中毛细管培养胚胎的囊胚率以及胚胎细胞数(85.4%,57.0)显著高于微滴培养(36.5%,20.6),囊胚率差异显著(P0.05)。且接种在Matrigel基底膜上形成的内细胞团集落显著增大。结论小鼠胚胎体外培养方法的改良——毛细管培养,促进小鼠植入前胚胎的体外发育。     

用足孕期畸形学指标评价毫米波辐射对小鼠植入后胚胎生长发育…

本实验用频率３６．１１ＧＨＺ，功率密度为１０．０ｍＷ／ｃｍ＾２的毫米波，在小鼠怀孕６－１５ｄ时进行２ｈ／ｄ的照射，在孕期终了用足孕期畸形学指标进行分析。结果显示，毫米波照射可导致足孕期孕期体重，体重增加数和胎鼠体重的明显降低，胎盘重明显减轻，足孕时胎仔身长及尾长均减短，照射未导致孕鼠脑，肝，肾，卵巢等及肝器重量及脏器／体重比值，活胎数，死胎数，吸收数等指标发生明显变化，亦未导致胎鼠外表发生畸形，内     

小鼠胚胎生殖细胞的建立及其印记状态

目的 成功建立小鼠胚胎生殖细胞（EGCs）系,并初步分析小鼠胚胎生殖细胞的印记状态。方法 建立交配后12.5d（12.5dpc）原始生
殖细胞 (PGCs）来源的小鼠EGCs,通过碱性磷酸酶（AKP）染色、免疫荧光细胞化学、体内分化及体外分化等方法检测EGCs的多能性,并以小鼠
胚胎干细胞（ESCs）为对照,应用Real-time PCR检测EGCs中与发育相关的Ins2、Lgf2、H19、Lgf2r等11个父源与母源印记基因的表达情况。结果
成功建立小鼠EG细胞系,EGCs克隆AKP染色显示有高水平的AKP活性,免疫荧光细胞化学方法显示克隆表达小鼠ESCs多能性标记物Oct4及细胞表面
标记SSEA-1。核型分析检测显示,小鼠EGCs为正常的40条染色体,体内可分化出3个胚层来源的组织,说明小鼠EGCs具有多能性;Real-time PCR
结果显示EGCs的印记基因表达量显著高于ESCs。结论 12.5dpc PGC来源的EGCs的印记基因处于擦除状态。     

用足孕期畸形学指标评价毫米波辐射对小鼠植入后胚胎生长发育的影响

本实验用频率36.11GHz、功率密度为10.0mW/cm~2的毫米波,在小鼠怀孕6～15d时进行2h/d的照射,在孕期终了用足孕期畸形学指标进行分析。结果显示,毫米波照射可导致足孕期孕鼠体重、体重增加数和胎鼠体重的明显降低,胎盘重明显减轻,足孕时胎仔身长及尾长均减短,照射未导致孕鼠脑、肝、肾、卵巢等脏器重量(右肾除外)及脏器/体重比值、活胎数、死胎数、吸收数等指标发生明显变化,亦未导致胎鼠外表发生畸形、内脏发生畸形,或骨骼畸形增多。     

小鼠胚胎培养在新建胚胎实验室的质量控制研究

目的通过小鼠胚胎的生长情况,对新建体外受精(IVF)实验室的质量控制进行验证,为人类辅助生殖技术的开展提供理论依据。方法将体内受精与IVF方式得到的2细胞期胚胎放入不同培养箱中培养,观察胚胎生长情况。结果进行了15个周期的体内受精体外培养实验,共获得225个2细胞及以上胚胎,培养后形成囊胚204个囊胚,囊胚率为90.7%。进行了15个周期的体外受精实验,共获得315个卵母细胞。体外受精后集合培养,获得289个2细胞。培养后形成囊胚229个囊胚,囊胚率为79.3%。两组间差异有统计学意义(P0.05)。结论小鼠卵母细胞体内受精和体外受精后均有高的成胚率,体内受精后进行体外培养优于体外受精后培养,鼠胚实验可对新建胚胎培养室的培养体系进行评估。     

用生后精神生理学指标分析毫米波辐射对小鼠植入后胚胎生长发…

用频率３６．１１ＧＨｚ，功率密度为１．０ｍＷ／ｃｍ２的毫米波，在小鼠怀孕６－１５ｄ时进行２ｊ／ｄ的照射，胎仔出生后用精神生理学指标进行分析。结果显示，毫米波辐射可导致生后仔鼠三项反射指标形成时间明显延迟，可导致成年子鼠学习和记忆成绩降低，表现在Ｙ型电迷宫被动逃避条件反射实验中，需要较对照组鼠更多训练及次数才能达到规定标准。     

不同条件下培养小鼠胚胎干细胞

胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细胞 )是从早期胚胎中分离出来的全能细胞系[1,2 ] 。当将这种细胞注入受体胚胎时 ,能参加各种组织器官的发育 ,形成嵌合体而后杂交至纯合体。通过ＥＳ细胞进行基因打靶[3 ] ,将外源基因定点整合产生基因剔除或基因修复从而制备转基因动物模型 ,故ＥＳ细胞可以用于研究基因的结构、功能及调控、医学疾病模型建立以及生殖细胞基因治疗等研究。利用ＥＳ细胞可以研究哺乳动物的分化和发育等基本问题 ,还可以通过研究ＥＳ细胞在体外定向诱导为特殊组织类型细胞为将来临床提供器官组织的原材…     

小鼠胚胎干细胞来源的心肌细胞系的建立

目的 建立模拟细胞微环境、促进细胞分化的三维培养体系,以体外诱导和培养小鼠胚胎干细胞 (mES-D3)来源的心肌细胞。方法 将mES细胞通过悬浮培养获得拟胚体（EBs）后转入Matrigel? Matrix 3D培养体系中培养。用形态学观察计数收缩集落的数量和频率;用免疫组织化学和RT-PCR检测心肌细胞分化相关基因的表达。结果 在Matrigel?中培养5d左右,可观察到自发节律收缩的EBs,频率约为40～50次/min;继续培养3d左右,频率约为80～90次/min;到45d左右大部分集落最终收缩。分化为心肌细胞所表达的特异性蛋白cTnT, Desmin, Actin表达呈阳性,并表达心肌特异性基因cTnT, NKX2E, GATA-4和MLC-2v。结论 mES细胞来源的EBs在Matrigel?培养体系中能够分化为心肌细胞,籍此我们建立了一株细胞系。     

运用全染色体探针FISH技术进行罗伯逊易位携带者胚胎植入前诊断

目的运用全染色体探针荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization ,FISH)对14/21罗伯逊易位携带者的胚胎进行植入前遗传学诊断,达到优生目的.方法应用FITC、Texas标记的21/14全染色体探针对14/21罗伯逊易位携带者的胚胎活检后的单个卵裂球进行遗传学检测,选择正常信号或携带者信号核型胚胎进行移植.结果常规单精子显微注射-胚胎移植(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后获取胚胎12个,活检优质胚胎11个,杂交后有信号胚胎7个,其中1个正常胚胎,1个携带者胚胎;1个14单体胚胎,1个21单体胚胎,1个21三体胚胎,另2个胚胎活检后均为21号二体,无14号信号.结论运用14/21全染色体探针荧光原位杂交技术对14/21罗伯逊易位携带者的胚胎进行植入前遗传学诊断是能够将正常核型胚胎挑选出来进行移植,从而达到优生目的.     

GRIM-19在小鼠植入前胚胎中的表达及其作用

目的 通过研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因 (GRIM-19)在小鼠植入前胚胎中的表达及其与胚胎质量之间的相关性,探讨GRIM-19在小鼠植入前胚胎发育中的作用。方法 采用实时定量PCR,检测小鼠植入前胚胎（2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚和囊胚）中GRIM-19 mRNA水平 (n =16);将小鼠8 细胞期胚胎按卵裂球大小、形态、透明带、胞质碎片分为优胚组和非优胚组,分别检测两组胚胎GRIM-19 mRNA水平,并分析其相关性 (n =13);制作假孕鼠（23只）,并随机分为A组（12只）和B组（11只）,采用移植器将优质和非优质8-细胞期胚胎移入假孕鼠的子宫内,观察两组雌鼠妊娠率及产仔率。结果 GRIM-19在小鼠植入前各期胚胎中均有表达,其mRNA水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势。优质8-细胞胚胎的GRIM-19 mRNA水平明显高于非优胚组（P <0.05）。两组8-细胞胚胎移植后,A组雌鼠妊娠率及产仔率显著高于B组雌鼠（P<0.05）。 结论 小鼠植入前胚胎中GRIM-19的表达量随发育时程的改变而变化,且与胚胎质量密切相关。     

阻断交感神经对小鼠胚胎植入和子宫局部免疫的影响

目的探究交感神经对小鼠妊娠早期胚胎发育作用的机制。方法利用组织学、免疫组织化学和酶联免疫吸附（ELISA）方法观察化学阻断剂6．羟多巴胺（6．OHDA）损毁交感神经对小鼠妊娠早期子宫局部免疫水平和早期胚胎发育的影响。结果化学损毁交感神经后，小鼠受孕率下降，胚胎植入数减少约64．4％；妊娠鼠子宫内膜固有层不发达，微血管分布少；子宫CD4^＋T细胞略有增多，而CD8^＋T细胞明显增加，特别在E3和E5，与对照组比较差异极显著（P〈0．01）；细胞因子IL-2含量升高，尤其E5升高最明显，达3．6倍，而IL-4含量仅在E5有明显升高，1L-2，1L-4比值显著升高。结论交感神经对孕小鼠子宫内膜组织学结构和子宫CD4^＋／CD8^＋T细胞与Th1／Th2细胞比值的影响可能是调控胚胎植入和早期发育的机制之一。