原位分子杂交检测厩真厉螨经叮刺传播姬鼠型和家鼠型HFRSV的研究

目的用分子生物学方法进一步证明革螨在传播两型HFRS中的作用。方法将叮刺感染姬鼠型（76—118株）HFRSV乳鼠后第10天厩真厉螨270只和家鼠型（UR株）HFRSV后第10天厩真后螨200余只,分别制成组织悬液接种正常乳鼠,用Dig标记HFRSVCDNA探针原位分子杂交检测接种后第9天鼠肺;将叮刺感染乳鼠后螨在适宜条件下饲养至100天以上,分别叮刺4～5日龄正常乳鼠,于第3天取鼠肺冰冻切片,经Dig标记HFRSVCDNA探针原位分子杂交检测。结果叮刺76一118株病毒感染乳鼠螨悬液接种4只乳鼠,3只阳性,UR株接种6只,全部阳性;76—118株组饲养至132天,UR株组102天的螨叮刺正常乳鼠后,也从鼠肺中检出病毒RNA。结论首次用分子生物学方法证明该螨可通过叮刺获得姬鼠型和家鼠型HFRSV,螨群体不但维持76—118株病毒132天以上、UR株102天以上,而且均能经叮刘传播,说明此螨能作为姬鼠型和家鼠型HFRSV的适宜传播媒介和贮存宿主,这一发现为我国的HFRS疫区保存和演变提供了一定的实验依据,有流行病学意义;原位分子杂交可缩短用敏感动物分离革螨体内HFRSV的时间,可用于革螨等媒介昆虫传HFRSV的实验研究和流行病学调查。     

恙螨体内肾综合征出血热病毒结构蛋白的检测分析

目的：为进一步证明恙螨体内HFRSV的存在与否。方法：本文用免疫组化法和套式PCR检测恙螨体内HFRSV结构蛋白（MP、NP）。结果与结论：恙螨幼虫和若虫体内均可检测到HFRSV结构蛋白MP、NP片段；并随着恙螨体内HFRSV滴度的增高其检出强度亦增加，该结果从分子生物学上进一步证明恙螨体内HFRSV的存在。     

原位RT-PCR检测革螨体内HFRSV的实验研究

目的　确定肾综合征出血热病毒 (HFRSV)在革螨体内分布和定位 ,进一步证明革螨作为HFRS传播媒介的意义。方法　采用原位RT -PCR分子杂交技术检测鼠肺组织细胞内和革螨体内的HFRSV -RNA。结果　阳性信号呈弥散分布 ,多见于鼠肺吞噬细胞、血管内皮细胞等组织细胞内 ;革螨体内的阳性信号主要分布于卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞中 ,前体组织细胞较少。结论　地高辛素标记的核酸探针原位RT -PCR分子杂交的阳性信号具有HFRS病毒特异性和RNA特异性     

肾综合征出血热患者外周血单个核细胞中病毒蛋白和病毒核酸动态变化的研究

为进一步研究肾综合征出血热（HFRS）病毒核蛋白（NP）、胰蛋白（MP）及病毒核酸在HFRS患者外周血单个核细胞（PBMC）中的动态变化,揭示HFRSV在患者PBMC中感染、增殖及消亡之规则,应用免疫细胞化学方法测定18例HFRS患者不同病目的95份外周血单个核细胞中的NP和MP抗原。结果表明：第3病日,即可在患者PBMC中检测到Np师和Mp;第3～5病日,病毒结构蛋白表达较强,6～10日明显变弱,第18病目逐渐消失。逆转录-聚合酶键反应（RT－PCR）检测HRFSV－RAN的研究发现,第3病日至14病日均能检测到病毒的存在。RT－PCR技术对临床的早期诊断和流行病学调查提供了一个快速敏感的诊断方法。     

汉坦病毒基因分型方法的建立及其核苷酸序列特征分析

目的使用RT—nested PCR分型检测方法及核苷酸序列测定技术，对来源于福建省内HFRS监测点的鼠肺标本及病人血清进行基因分型并对部分标本的核苷酸序列进行分析比较。结果24份阳性鼠肺标本中检出率为95．8％；20份病人血清标本中仅11份扩增阳性，检出率分别为：83％（≤1周），12．5％（〉1周）。扩增阳性标本中仅1份RT—PCR分型为HTN型，其余均为SEO型。这与核苷酸序列分型结果相一致。结论近年福建省流行的汉坦病毒仍以SEO型为主。核酸序列比较分析发现，福建省内同一地区流行的SEO型汉坦病毒核苷酸的同源性很高，大于99％，而不同地区病毒间核酸序列变异比较大。尤其是永春和松溪这两个地区的毒株差异达到20％左右，可能是SEO型中两个新的亚型。     

原位分子杂交检测上海真厉螨与柏氏禽刺螨体内肾综合症出血热病毒的研究

目的：提供革螨传播肾综合征出血热病毒（HFRSV）的分子生物学证据。方法：用上海真厉螨与柏氏禽刺螨叮咬HFRSV接种乳小鼠，取叮咬后d10及d100以上的上海真厉螨与柏氏禽刺螨冰冻切片，用地高辛标记HFRSVcDNA核酸探针原位分子杂交检测其体内病毒RNA。结果：叮咬野鼠型（76－118株）接种乳小鼠后d10上海真厉螨检出病毒RNA，在细胞浆、细胞核中及核膜上呈细密颗粒状或全浆阳性，见于生殖器官细胞、胃及支囊上皮细胞及脑皮质细胞；叮咬家鼠型（UR株）病毒接种乳小鼠后d12螨亦检出病毒RNA，病毒的细胞组织分布与野鼠型相同；分别检测野鼠型螨31 只和家鼠型23 只, 其中阳性分别为17 只和10 只; 叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠后d132, 家鼠型d102螨仍能检出病毒RNA。柏氏禽刺螨叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠d10, 检测螨20只, 其中阳性12 只, 病毒RNA 主要分布于生殖器官细胞内。结论: 上海真厉螨与柏氏禽刺螨均可经叮咬获得HFRSV , 上海真厉螨可分别感染野鼠型和家鼠型HFRSV , 野鼠型在螨群体内至少可维持132 d, 家鼠型102 d, 具有贮存两型病毒的作用, 是HFRSV 的适宜媒介和贮存宿主, 在动物宿主间交叉传播两型HFRSV 中起重要作用。     

福建省1株登革Ⅱ型病毒的鉴定

目的对2005年福建省分离的1株登革病毒(DV)进行鉴定,并从分子水平追踪其可能的传染源。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测疑似登革热患者血清中DV(IgM、IgG抗体;同时应用C6/36细胞、单克隆抗体间接免疫荧光(McAb-IFA)、逆转录(套式PCR法分别进行病毒的分离和鉴定,并对分离株的部分基因进行核苷酸序列分析。结果患者血清登革病毒特异性IgM抗体阳性、IgG抗体可疑,表明该患者在近期感染过登革病毒。患者血清接种C6/36细胞,观察到登革病毒特有的CPE。受感染的C6/36细胞能与登革病毒Ⅱ型单克隆抗体反应,表明分离的病毒株为登革Ⅱ型病毒。分离株的核酸提取物经RT(PCR扩增,登革病毒通用引物可扩增出511bp的特异性条带,型特异性引物扩增出119bp的特异性条带,进一步证实分离的病毒株为登革Ⅱ型病毒。分离株RT(PCR扩增产物的核苷酸序列与30株不同地域来源的登革Ⅱ型病毒相应序列构建的系统发生树表明,此毒株与东南亚地区的毒株比较接近。此次分离株的序列与1999年登革Ⅱ型病毒福建株的对应序列在亲缘关系上有一定程度距离。结合流行病学调查资料,进一步确定此病例为输入性感染病例。结论福建省首次从输入性登革热患者血清中分离出登革Ⅱ型病毒,该病毒来源于东南亚地区。     

用原位RT-PCR分子杂交定位检测螨(革螨、恙螨)原代培养细胞内HV-RNA的研究(Ⅱ)

目的　研究革螨、恙螨在传播肾综合征出血热病毒 (Hemorrhagicfeverwithrenalsyndromevirus,HFRSV)中的媒介作用。方法　采用革螨、恙螨饲养繁殖的子代幼虫、若虫和成虫 ,消化后作螨细胞原代培养制螨细胞片 ,用原位RT -PCR分子杂交法检测HV -RNA在螨组织细胞内分布和定位。结果　HV -RNA多分布于螨消化系统的上皮细胞 ,卵巢组织细胞内 ;革螨子 4代、子 3代和恙螨若虫组织细胞内HV阳性颗粒较革螨子 2代、子 1代和恙螨幼虫多且密集。结论　革螨、恙螨作为HFRS的生物学媒介有细胞分子水平的直接证据。     

安徽三界地区啮齿动物感染恙虫病东方体调查

目的调查安徽三界地区啮齿动物自然感染恙虫病东方体分离株,并确定其基因型别。方法流行季节在野外用鼠笼捕鼠并鉴定鼠种、携螨率;巢式PCR对鼠脏器进行恙虫病东方体56kD基因片段检测;将鼠脏器接种小自鼠进行病原体分离,PCR扩增分离株0t56kD基因片段,并将目的片段进行测序,基因序列同源性及进化分析。结果捕获啮齿动物数及其携螨率,黑线姬鼠60％（15／25）;褐家鼠45．5％（5／11）;东方田鼠和购睛各2只,均阴性。40只野鼠脏器有3只恙虫病东方体PCR扩增阳性,阳性率为7．5％;从黑线姬鼠标本中分离到1株恙虫病东方体Sanjie,56kD基因片段测定该株与台湾TT071la和NT0511b分离株同源性最高（98％）,系统发生树分析也显示与Kawasaki型共处于同一分支。结论安徽三界地区存在鼠类恙虫病东方体自然感染,黑线姬鼠为其主要宿主,当地恙虫病东方体属Kawasaki基因型。     

利什曼原虫中国分离株SSU rDNA多变区序列分析

目的分析我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株的SSUrDNA多变区序列差异。方法nDNA进行PCR扩增，将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于pGEMR-TEasyVector上，采用通用引物M13进行PCR扩增，全自动测序仪测序。结果序列分析显示本文报道的荒漠、山丘疫区的2株利什曼原虫（L.d.XJ771、L.d.SC6）的SSUrDNA序列大小均为392bp；序列差异发生在两个独特序列区（UQ-Ⅰ和UQ-Ⅱ），无移码突变；与GeneBank中的利什曼原虫比较分析，同源性在98%以上。结论我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株之间的SSUrDNA多变区的碱基序列有差异；荒漠疫区分离株L.d.XJ771与国际标准株L.d.DD8的SSUrDNA多变区的碱基序列完全相同。     

东莞市肾综合征出血热疫源地调查报告

东芙市位于广州与深圳之间，是物资出口东南亚的交通要道。自1986年以来，我市时有临床诊断的肾综合征出血热（HFRS）病例报告，为了进一步了解和证实本地HFRS疫源地情况，1996年9月，我们选择首例确诊、无明确外出史的本地HFRS病例发病所在地开展了疫源地调查，结果如下：l材料和方法1．l鼠密度调查：室内统一用中号鼠铁夹，花生米作诱饵，晚放晨收。1．2鼠种带肾综合征出血热毒（HFRSV）的调查：在大朗镇长塘管理区范围内捕捉活鼠送实验室，进行分类、鼠种鉴定、编号登记，剖取鼠肺放入大试管内、置液氮罐中备检，同时，从鼠股动脉…     

登革病毒2型广东省分离株的鉴定及NS1基因序列分析

目的 明确广东省南海市1998年夏、秋季一批发热、出疹患者的诊断,并从基因水平分析其流行株的来源。方法 收集疑似登革热（DF）患者 血清52份,应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、病毒分离和间接免疫荧光技术分别进行了病原学和血清学检测;同时采用分子克隆技术将PCR扩增产物克隆到T载体,并进行序列测定。结果 从25份发病早期患者血标本中分离病毒10份,经用单克隆抗体间接免疫荧光检测和RT－PCR检没让实为登革病素2型感染。基因序列分析表明,1998年广东分离的登革2型病毒与ThNH-P28/93、C0166`16681`NGC`JAM`04`GD06/93和S1株核苷酸的同源性分别是：98％、97％、96％、93％、92％、91％。结论 此次南海市登革热暴发流行为 登革病毒2型感染所致。基因序列分析提示：1998年广东省南海市分离的登革病毒2型可能来源于泰国。     

2007年浙江丽水地区汉坦病毒的分离与型别鉴定

目的对2007年从浙江省丽水地区肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫区鼠肺分离的汉坦病毒进行型别鉴定和分子生物学特性研究。方法将汉坦病毒抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离汉坦病毒。提取病毒总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒S基因全片段,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析,应用DNA STAR软件分析比较,确定病毒型别。结果从疫区7份阳性鼠肺中分离到2株汉坦病毒,经汉坦病毒单克隆直接荧光血清检查和基因序列测定,结果为汉滩型(HTN)病毒,2株病毒与国际标准株76-118(HTN型)和80-39(SEO型)S片段核苷酸的同源性分别为84.7%、84.6%和64.2%、64.0%。结论浙江省丽水地区可能存在以HTN型病毒为主的肾综合征出血热自然疫源地。     

从太平洋无前恙螨幼虫和若虫分离到恙虫病立克次体

目的为寻找山东恙虫病疫区有无其它季节次要媒介,于１９９５年５月～１９９７年１１月对山东费县地区大仓鼠体外的太平洋无前恙螨幼虫及孵出的若虫自然感染恙虫病立克次体（Ｒｔ）情况进行了实验研究。方法采用病原分离和间接免疫荧光法（ＩＦＡ）。结果从４批鼠体外太平洋无前恙螨幼虫分离到２株Ｒｔ;从３批该螨饱食幼虫孵出的若虫体内分离到２株Ｒｔ。分离株均属弱毒株,与标准株（Ｋａｒｐ型）间有交叉免疫保护力。结论太平洋无前恙螨幼虫和若虫能自然感染Ｒｔ,提示该螨有充当Ｒｔ媒介的可能,需进一步研究。     

1株汉坦病毒的分离及其S基因片段的克隆和序列分析

目的对浙江省肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)疫区-龙泉,新分离到的毒株的S基因片段进行克隆并进行序列测定及分析,以确定毒株的型别和基因变异程度,为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。方法采用直接免疫荧光检测疫区鼠肺HV抗原。将HV抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离病毒。参考GenBank发表的汉坦病毒核蛋白基因序列,设计合成一对引物,提取分离株细胞培养物的总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增新毒株S片段基因,并克隆入载体,纯化后进行核苷酸序列测定及分析。结果成功分离到的新毒株S片段的全基因序列共1 700个核苷酸,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。新毒株与HTN型毒株比较,核苷酸同源率为85.7%~91.9%。与SEO型毒株比较,核苷酸同源率为71.2%~75%,表明该毒株为HTN型毒株。结论浙江HFRS疫区新分离汉坦病毒株可以定型为HTN型毒株,可能为新的亚型。     

野生型及跨膜型肿瘤坏死因子真核表达载体构建及其对心肌细胞凋亡的影响

目的构建鼠野生型肿瘤坏死因子（Wild type tumornecrosis factor—alpha,wtTNF—α）和跨膜型肿瘤坏死因子（Transmembrane tumor necrosis factor—alpha,tmTNF—α）基因真核表达载体,转染心肌细胞,比较两型TNF—α对心肌细胞凋亡的影响。方法应用RT—PCR方法从小鼠腹腔臣噬细胞中扩增wtTNF—α基因编码区,根据小鼠TNF氨基酸序列设计缺失肿瘤坏死因子转化酶（TNF alpha converting enzyme,TACE）作用位点（缺失1-12位氨基酸）的突变引物,通过重叠PCR得到构建不被TACE剪切的TNF-α突变体,即跨膜型肿瘤坏死因子tmTNF—α,扩增得到的wtTNF-α,tmTNF—α PCR产物经EcoRI＋BanH I双酶切后克隆到pIRES2-EGFP真核表达载体中并转染入大鼠H9c2（2—1）心肌细胞,用RT—PCR及Western Blot方法鉴定转染效率及不同表达载体对心肌细胞凋亡的影响。结果成功构建pIRES2-eGFP—wtTNF和pIRES2-eGFP-tmTNF真核表达载体并转染大鼠H9c2（2—1）心肌细胞,tmTNF—α对心肌细胞无明显促凋亡作用,而wtTNF—α可以诱导心肌细胞凋亡。结论由于wtTNF—α可被酶解产生sTNF-α,提示sTNF—α,而并非跨膜型TNF-α对该心肌细胞株具有诱导凋亡的作用。     

Glu^47缺失造成的常染色体显性遗传垂体性尿崩症的家系分析

目的寻找常染色体显性遗传垂体性尿崩症（ADNDI）的基因突变位点。方法在一临床确诊的ADNDI家系，提取外周血的基因组DNA，PCR扩增精氨酸加压素前体基因（AVP－NPⅡ），并进行全长测序，亚克隆测序确认突变位点。结果本家系中所有患者在AVP－NPⅡ基因2号外显子的1824－1829位AGGAGG存在一个AGG密码子的缺失，而其他表型正常的成员测序结果正常。结论AVP－NPⅡ基因1824-1829位AGGAGG中的一个AGG的缺失导致NPⅡ第47位谷氨酸（Glu）的缺失，可能影响NPⅡ蛋白对AVP的运输，进一步造成AVP降解增加，发生尿崩症。     

利什曼原虫中国分离株SSUrDNA多变区序列分析

目的：分析我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株的SSUrDNA多变区序列差异。方法nDNA进行PCR扩增,将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于pGEM^R-T Easy Vector上,采用通用引物M13进行PCR扩增,全自动测序仪测序。结果：序列分析显示本文报道的荒漠、山丘疫区的2株利什曼原虫（L.d.XJ771,L.D.SC6)的SSUrDNA序列大小均为392bp;序列差异发生在两个独特序列区（UQ－Ⅰ和UQ-Ⅱ）,无移码突变;与GeneBank中的利什曼原虫比较分析,同源性在98％以上。 结我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株之间SSUrDNA多变区的碱基序列有差异;荒漠疫区分离株L.d.XJ771与国际标准株L.d.DD8的SSUrDNA多变区的碱基序列完全相同。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因的体外扩增克隆及序列分析

目的 分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区（VH）基因并测定其序列。方法 根据鼠免疫球蛋白重链可变区基因FR1和FR4序列的保守性，化学合成体外扩增Ig重链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板，扩增VH基因，将其克隆入pUC19载体，重组子用Sanger′s双脱氧链终止法测定序列，将序列与GeneBank中已发表的抗体序列比较。结果 VH基因全长357bp，属鼠免疫球蛋白重链第Ⅱ亚类，由种系基因V、Dsp2．8与JH4重排而来。该VH基因序列已被GeneBank收录（accession No AF282622）。结论 该VH基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因。     

速生薄口螨成螨的形态观察和系统进化分析

目的了解速生薄口螨成螨扫描电镜下形态特征，并探讨该物种与粉螨中其他螨种之间的亲缘关系。方法从纯培养的速生薄口螨中分离出成螨，使用扫描电子显微镜观察其外部形态。提取该螨的DNA, PCR扩增细胞色素氧化酶亚基1 (cox1)基因和内转录间隔区（ITS）并测序，与GenBank上8种粉螨的ITS序列和cox1序列进行比对，采用最大似然法构建系统进化树。结果 扫描电镜下可见速生薄口螨的腹面表皮内突较发达，足Ⅰ表皮内突愈合成胸板，足Ⅱ表皮内突伸达中央，未连接；腹面有2对几丁质环，雄螨位于足Ⅱ～Ⅳ基节之间；雌螨前对几丁质环位于足Ⅱ～Ⅲ之间，后对几丁质环位于足Ⅳ基节水平；雄螨可见生殖褶、叶状瓣及阳茎等结构。PCR扩增和测序结果显示，cox1序列长539 bp, ITS基因片段序列长1 633 bp，与预期一致。ITS序列比对结果显示，速生薄口螨与热带无爪螨（GenBank登录号为KC215362）序列相似性最高为90.41%，与其他粉螨序列相似性为83.33%～89.73%。cox1序列比对结果显示，速生薄口螨与害嗜鳞螨（GenBank登录号为MT075728）序列相似性最高，为83.55%，与其...