中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1 第16- 17 区基因和MSP2 基因的分子克隆与鉴定

目的: 为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供理论依据。方法: 根据MAD20 株裂殖子表面蛋白1 (MSP1) 和FC27 株裂殖子表面蛋白2 (MSP2) 基因编码区高度保守碱基设计并合成两对引物, 应用多聚酶链反应(PCR) 技术对5 例脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕分离株CMH/YN 和云南省盈江县农场CYJ/YN 分离株基因组DNA MSP1 第13- 17 区基因和MSP2 基因进行扩增, 并将扩增产物分别经EcoRI 和KpnI, BamHI 和HindIII 双酶切后, 分子定向克隆M13mp18 和M13mp19 载体, 转染大肠杆菌(E. coli) TG1, 从含X-gal 和IPTG 的LB平板上, 将随机筛选得到的单个无色噬菌斑经E. coli JM 103 扩增, 用碱裂解法抽提重组子复制型DNA (RFDNA ) 后, 再分别经EcoRI 和KpnI, BamHI 和HindIII 双酶切鉴定。结果: 证实重组子为编码脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN 和CYJ/YN 分离株MSP1 第16- 17 区基因和MSP2 基因分子克隆M13 载体。结论: 首次报道确证脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN 和CYJ/YN 分离株MSP1 第16- 17 区基因和MSP2 基因分别与MAD20 株MSP1 和FC27 株MSP2 相应基因完全一致。这些发现对研究预防人脑型疟疫苗和建立一种新型脑型疟恶性疟原虫检测方法具有重要意义。     

中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16-17区基因和MSP2基因的分子克隆与鉴定

目的 :为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供理论依据。方法 :根据 MAD2 0株裂殖子表面蛋白 1( MSP1)和 FC2 7株裂殖子表面蛋白 2 ( MSP2 )基因编码区高度保守碱基设计并合成两对引物 ,应用多聚酶链反应 ( PCR)技术对 5例脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕分离株 CMH/ YN和云南省盈江县农场 CYJ/ YN分离株基因组 DNA MSP1第 13- 17区基因和MSP2基因进行扩增 ,并将扩增产物分别经 Eco RI和 Kpn I,Bam HI和 Hind III双酶切后 ,分子定向克隆 M13mp18和 M13mp19载体 ,转染大肠杆菌 ( E.coli) TG1,从含 X- gal和 IPTG的 LB平板上 ,将随机筛选得到的单个无色噬菌斑经 E.coli JM10 3扩增 ,用碱裂解法抽提重组子复制型DNA ( RFDNA)后 ,再分别经 Eco RI和 Kpn I,Bam HI和 Hind III双酶切鉴定。结果 :证实重组子为编码脑型疟患者恶性疟原虫 CMH/ YN和 CYJ/ YN分离株 MSP1第 16- 17区基因和 MSP2基因分子克隆 M13载体。结论 :首次报道确证脑型疟患者恶性疟原虫 CMH/ YN和 CYJ/ YN分离株MSP1第 16- 17区基因和 MSP2基因分别与 MAD2 0株 MSP1和 FC2 7株 MSP2相应基因完全一致。这些发现对研究预防人脑型疟疫苗和建立一种新型脑型疟恶性疟原虫检测方法具有重要意义。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白疟疾疫苗的研究进展

疟疾是一种危害严重的虫媒传染病，在疟原虫对抗疟药物的耐药性及媒介蚊对杀虫剂耐药性日益增强的今天，寻求一种新型，高效，安全的抗疟途径－抗疟疾疫苗的研制备受科研人员的关注。本对恶性疟原虫裂殖子表面蛋白抗疟疾疫苗的研究进展作一概述。     

恶性疟原虫中国海南株裂殖子表面蛋白1 基因的序列分析

目的:测定恶性疟原虫中国海南分离株MSP1 基因的全序列,并进行多态性分析。方法:来自海南省保亭县2 例恶性疟患者的血样(分别滴在滤纸上)直接制备基因组DNA 后,用MSP1 基因特异的5 对寡核苷酸引物在体外扩增目的基因,用ABIPRISMTM末端标记循环测序试剂盒进行直接测序,并将测序结果与已知的等位基因型进行比较分析。结果:获得了2 个恶性疟原虫中国分离株MSP1 基因的全序列,与已知的MSP1 等位基因型进行序列比较,证实其属于MAD20 型。推导其氨基酸序列除了第2 区、第4 区和第8 区以外,其余序列完全一致。其中HN2 的第4 区含K1 型序列。结论:两株恶性疟原虫海南株的MSP1 基因属于MAD20 型,与MAD20 等位基因比较,其推导的氨基酸序列存在一些小差异。本文首次提供了恶性疟原虫中国(海南)分离株MSP1 基因多态性的依据     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP1-42基因的合成及其表达

目的 利用大肠杆菌表达系统表达可溶性的恶性疟原虫(3D7株)裂殖子表面蛋白1C末端MSP1-42蛋白.方法 采用两步PCR法拼接合成全长msp1-42基因,将测序正确的msp1-42基因构建至pET32a(+)表达载体,获得pET32amsp表达质粒,热激转化至宿主菌Rosetta gami(DE3)中进行诱导表达,用免疫印迹法检测表达产物.结果 全合成了恶性疟原虫3D7株msp1-42基因,合成基因在Rosetta gami(DE3)中以可溶性形式高水平表达,所表达的重组蛋白能与识别MSP1-19构象表位的单克隆抗体mAb5.9、PfCP2.9兔血清及恶性疟患者血清发生免疫反应.结论 合成的msp1-42基因能在大肠杆菌表达系统中以可溶性的形式表达,所表达的重组蛋白MSP1-42具有抗原性.     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1—17区基因的原核表达,纯化及表？…

为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１的１７区基因,本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１的１７区基因,并纯化及鉴定了表达蛋白。方法将ＭＳＰ１－１７基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１,形成ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＭＳＰ１－１７,ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－４５－１／ＭＳＰ１－１转化的ＢＬ２１菌,纯化并用ＭＳＰ１－１７特异性生有达产物。结果成功地构建了ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＭＳＰ１－１７,转化菌经诱导表     

恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（FCC－1／HN）裂殖子表面抗原2（MSA2）基因片段的重组真核表达质粒pBK/MSA2。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG/MSA2中分离出经过测序鉴定的MSA2基因片段,将其亚克隆入真核表达载体pBK-CMV,构建重组真核表达质粒pBK/MSA2。经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）及免疫印迹（Western-blot)分析。结果 从pBCG/MSA2中分离出MSA2基因片段,成功构建pBK/MSA2重组质粒;SDS－PAGE及Wetern-blot分析结果显示,特异性蛋白条珲的分子质量约为31ku。结论 恶性疟原虫MSA2可在大肠杆菌中成功表达。     

中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16—17区基因的分子克隆及序列分析

目的 :为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供进一步科学依据。方法 :应用多聚酶链反应 ( PCR)技术对中国 5例脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕 CMH/YN分离株和云南省盈江县农场 CYJ/YN分离株基因组 DNA裂殖子表面蛋白 1( MSP1)第 13— 17区基因进行扩增 ,将扩增产物分别经 Eco RI和 Kpn I双酶切后 ,回收的 MSP1第 16— 17区基因分子定向克隆M13mp18和 M13mp19载体 ,按 Sanger双脱氧链终止法进行 DNA序列测定 ,并与 MAD2 0、K1和Wellcome株原型基因进行同源性分析比较。结果 :发现脑型疟患者恶性疟原虫 CMH/YN和 CYJ/YN分离株 MSP1第 16— 17区基因之间的序列完全相同 ,全长为 918bp,编码 30 6个氨基酸 ,含 12个半胱氨酸组成的 2个表皮生长因子 ( EGF)单体结构域 ;除了在核苷酸第 4 869位缺失 1个碱基和散在分布 5个碱基点突变之外 ,与 MAD2 0、K1和 Wellcome株相应基因之间的核苷酸同源性分别为 98.6%、2 3.3%和 2 2 .8%。结论 :本研究在世界上首次报道脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP1第 16— 17区 DNA序列测定分析结果 ,确证该基因与 MAD2 0株高度同源性 ,并发现在1691— 170 1位氨基酸存在 TCTEEDSGSSR表位。     

疟原虫裂殖子主要表面蛋白1（MSP1）的研究进展

本文简述了疟原虫殂了主要表面蛋白１（ＭＳＰ１）的分子结构、功能以及在人群中诱导的免疫应答。对恶怀疟原虫ＭＳＰ１疫苗的动物和人体试验结果进行了分析，对ＭＳＰ１知诊断抗原分子和疟疾疫苗候选抗原的应用前景进行了探讨。     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

恶性疟原虫海南分离株(FCC1／HN)裂殖子表面蛋白2(MSA2)真核表达载体的构建

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（ＦＣＣ１／ＨＮ）裂殖子表面蛋白ＭＳＡ２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＭＳＡ２,为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。方法 采用ＰＣＲ技术对ＦＣＣ１／ＨＮ基因组ＤＮＡ ＭＳＡ２基因进行扩增,扩增产物经纯化后用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切,然后定向克隆入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３,连接产物转化大肠杆菌ＴＧ１,再用相同的内切酶酶切和ＰＣＲ扩增对重组子进行鉴定。结果 筛选出的     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因体外扩增、克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因原核表达质粒pET28α-Pf12,测定Pf12基因序列,并为FCC1／HN株Pf12的体外表达奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增出Pf12基因,扩增产物经纯化,用BamHI XhoI双酶切,定向克隆入pET28α质粒,转化大肠杆菌DH5α,再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用PCGENE软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果：筛选出编码FCC1／HN株Pf12基因的原核表达质粒pET28α－Pf12重组质粒的构建,为恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因的体外表达奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8％,但与人的4型HK的同源性只有23.2％~26.6％。 结论 获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。     

恶性疟原虫FCC1／HN株特异基因片段的克隆及部分序列分析

本研究通过分离、培养恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ分离株，提取、纯化其基因组ＤＮＡ，用ＢａｍＨ１部分酶切，并克隆ｐＵＣ１８载体，转化受体菌株大肠杆菌ＪＭ１０３，用基因组ＤＮＡ探针筛选转化子，对杂交信号最强的克隆片段ｐＨＦ１作部分序列分析，在国内首次明确恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ特异ＤＮＡ部分序列。ｐＨＦ１克隆片段约１．２ｋｂ，两端分别测定了３２８和２７１个碱基。Ｇ＋Ｃ含量为２６．８％，并有较多的酶切位点，便于作亚克隆，该序列还可用作ＤＮＡ探针或ＰＣＲ扩增模板有较大实用价值。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的　克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)侧翼核酸内切酶 1(FEN 1)基因序列,比较 FCC1/HN株与国外分离株FEN 1基因序列的差异。　方法　根据 FEN 1 基因已知序列设计合成 1 对引物,应用 PCR技术从 FCC1/HN株基因组DNA中扩增出FEN 1基因,构建重组质粒PMD18 T FEN 1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN 1基因序列的同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的 FCC1/HN株FEN 1基因序列,基因全长1 947 bp,A+T含量为56%,G+C含量为44%。酶切鉴定获得了正确的PMD18 T FEN 1重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN 1基因序列有较高的同源性。结论　成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株FEN 1基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外已报道各株的FEN 1基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫Fcc-1/HN株MSP1_(19)基因的体外扩增及鉴定

本文根据恶性疟原虫ＭＳＰ１１９已知序列，自行设计一对用于特异扩增ＭＳＰ１Ｃ端１９肽基因的引物Ｐ１、Ｐ２，在Ｐ１引物中引入ＳａｌⅠ酶切位点及ＡＴＧ起始密码子，在Ｐ２引物中引入ＸｂａⅠ酶切位点及终止密码子，经ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ大小片段，与预期大小相符。采用“压碎与浸泡法”纯化回收ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物经套式ＰＣＲ及酶切鉴定证实与预期大小相符，说明所获确为ＭＳＰ１１９基因。为进一步将该基因与ＰｆＣＭＲ基因进行重组表达复合抗原和免疫接种奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株EBA-175基因克隆及序列分析

目的　将恶性疟原虫 FCC1/ HN株 175 ku的红细胞结合抗原 (EBA- 175 )基因克隆入测序载体 ,测定其序列 ,为以后研究其结构与功能奠定基础。　方法　利用 PCR扩增技术 ,分两个片段从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中 ,特异扩增 EBA- 175全基因编码序列。扩增产物经纯化回收后 ,T- A克隆入测序载体 p MD18- T,转化大肠杆菌 (E.coli) DH5 α,筛选阳性克隆 ,并进行双酶切及 PCR扩增鉴定 ,获得含有编码 EBA- 175基因的重组质粒 p MD18- T- EBA。用Sanger双脱氧链终止法进行 DNA序列测定。　结果　FCC1/ HN株 EBA- 175基因序列与 Camp株基本一致 ,全长 430 8bp,编码 1435个氨基酸 ,含有与 Camp株相似的 C片段。利用计算机软件对其 RII区的 F2亚区以及 4肽进行抗原表位分析 ,结果显示这些区域可能含有抗原表位。　结论　EBA- 175全基因编码序列的测定 ,为以后其结构与功能的研究奠定基础     

恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.