钩端螺旋体黄疸出血群黄疸出血型型特异单克隆抗体的研究

针对国内流行的黄疸出血群钩端螺旋体的特异性定型,应用杂交瘤技术,获得了一株分泌黄疸出血型特异性抗体的细胞系,V-1。V-1单克隆抗体表现了很高的型特异性,与黄疸出血型以外国内流行钩端螺旋体均不发生反应。V-1单克隆抗体对地方菌株的鉴定中,完全与交叉凝集吸收试验所得结果一致,其特异性优于因子血清,其免疫球蛋白属IgM。     

两株不同毒力株钩端螺旋体37℃培养条件表达谱的差异

目的 钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）与钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）在遗传背景上具有很大的相似性，但毒力却差别很大。本研究利用钩端螺旋体的cDNA芯片在全基因组水平上研究毒力差别的机制。方法 利用钩端螺旋体的cDNA芯片，在37℃培养条件下以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）为测试株，以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）为对照株，测试了芯片表达谱的变化。结果 在37℃培养条件下，毒力株和减毒株的表达谱具有明显的差别。毒力株上调表达的基因有101个，下调表达的有71个。这些差异表达的基因在功能上可分为12类。结论 这些差异表达的基因可能在钩端螺旋体毒力株致病力方面发挥一定的作用。     

福建省北部地区鼠类钩端螺旋体感染状况及分离株分子特征研究

目的 了解福建省北部地区鼠类钩端螺旋体(钩体)感染状况及分子特征。方法 对捕获的鼠类进行信息登记,采集鼠肾进行PCR检测,确定其感染状况。EMJH培养基用于鼠肾标本的钩端螺旋体菌株分离。应用MAT方法对分离株进行血清群鉴定。分别采用16S rRNA、MLST和PFGE的方法对分离株进行分子分型。结果 共捕获鼠类227只,检出感染钩端螺旋体的鼠类27只,检出率为11.89%,野栖鼠检出率高于家栖鼠,雄性鼠检出率高于雌性鼠。共分离到4株钩端螺旋体分离株,分离率为1.76%(4/227)。血清学分群显示4株分离株均为黄疸出血群。基因种分型显示4株分离株均为Leptospira interrogans。MLST分型将4株分离株分为2个ST型,PC29、PC30为ST1型,JY19、JY37为ST17型。4株分离株呈现2种PFGE带型,其中,PC29、PC30与黄疸出血群参考株带型一致,JY19、JY37与波摩那群带型具有较高相似度,聚类关系相对较近。结论 福建省北部地区的鼠类中存在钩端螺旋体感染。黄疸出血群和Leptospira interrogans分别为福建省北部地区钩端螺旋体的优势血清群...     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

波摩那群罗株钩端螺旋体内毒素单克隆抗体的研制

本文报告2株分泌波摩那群波摩那型罗株钩端螺旋体内毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株YL-1和YL-2。YL-1和YL-2单克隆抗体均属IgM,并经MAT证实此等单克隆抗体具有较高的群特异性。YL-1和YL-2体外培养7个月余和冻存3个月后复苏仍能稳定地分泌抗体。     

抗旋毛虫成虫单克隆抗体的制备和保护性免疫的初步研究

目的：获得抗旋毛虫成虫的单克隆抗体（单抗）并初步研究其保护性免疫作用，方法：利用杂交瘤技术，用旋毛虫抗原免疫的Balb/c小鼠脾细胞与小鼠骨瘤细胞SP2／0进行细胞融合。用免疫双扩散鉴定单抗亚类，免疫印迹鉴定单抗的特异性。小鼠尾静脉接种单抗进行被动免疫保护实验。结果：建立了1株稳定分泌抗旋毛虫成虫单抗的细胞株，杂交瘤细胞培养上清液效价为1：6400，诱生腹水ELISA效价达1：204800，经鉴定单克隆抗体类型为IgM,可以识别旋毛虫成虫，肌幼虫及新生幼虫，相对分子质量约为40000蛋白，并且不与猪蛔虫，血吸虫，包虫，囊虫抗原发生交叉反应。单抗被动免疫后的减虫率为55．63％，结论：获得1株具种特异性，保护性的单克隆抗体，为筛选能诱导保护性免疫功能的旋毛虫抗原分子提供了有力的工具。     

国内首次检获塔拉索夫群Moldaviae型钩体

<正> 1979年,我们对东川市进行钩端螺旋体病流行病学调查,从患者杨XX血液培养中分离出一株新型钩端螺旋体。经上海生物制品研究所提供的国内参考株13群15型作显微镜凝集试验,检定为塔拉索夫群。与塔拉索夫群19个血清型菌株作交叉凝集,     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的表达及单克隆抗体的制备

目的表达CJPEB1重组蛋白,制备并鉴定CJ PEB1蛋白的单克隆抗体。方法诱导培养工程菌E．co-liBL21（DE3）表达CJPEB1重组蛋白,以PEB1蛋白溶液与等体积的佐剂完全乳化作为免疫原常规免疫BALB／C小鼠,制备单克隆抗体。无菌取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,建立杂交瘤细胞株。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水制备抗体,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测腹水中抗体的效价,应用Western-blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性。结果得到高纯度的CJPEB1重组蛋白,蛋白质分子量大小与预计的理论值相符。获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株杂交瘤细胞诱生的腹水,经间接ELISA法检测,腹水中的抗体效价分别为8×10^4和5×10^4,经双向琼脂扩散试验检测效价均为1：16。通过Westem-blot鉴定,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均与PEB1蛋白特异性地结合;其诱生的腹水与CJ菌液混合出现凝集现象,而与大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等菌液混合均未出现凝集现象。结论成功建立了两株稳定分泌抗CJPEB1重组蛋白抗体的杂交瘤细胞株并制备了抗CJPEB1蛋白的单克隆抗体,为今后研究多种检测CJ的方法创造了条件。     

抗波摩那型109株钩端螺旋体外膜抗原单克隆抗体的研制

本文用波摩那型109株钩体外膜抗原免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,获得3株分泌抗波摩那型钩体外膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株,定名为LS_(15)、LS_(22)和LS_(28)。经酶标(ELISA)和显微镜凝集试验(MAT)证实LS_(22)和LS_(28)McAbs为波摩那型109株钩体特异的抗体;LS_(15)McAb为针对存在于一定钩体群型中共同抗原的非凝集抗体。杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔可诱生含高效价McAbs的腹水。经鉴定LS_(15)、LS_(22)和LS_(28)McAbs均属IgG_2亚类。     

江西省致病性钩端螺旋体血清学和分子流行病学研究

目的 对2013年以来江西省致病性钩端螺旋体进行血清学、基因分型分析,以了解江西省钩端螺旋体血清学和分子流行病学特征。方法 对27株钩端螺旋体进行暗视野显微镜凝集试验确定血清群。PCR扩增16S rRNA基因、测序,确定基因种。利用MLST(multilocus sequence typing)研究进行基因分型分析,并应用BioNumerics (Version5.10)软件进行聚类分析。结果 血清群鉴定:27株菌株隶属于4个血清群,其中黄疸出血群为主要优势血清群,占59.26%,其次依次是爪哇群25.92%、澳洲群7.41%和巴达维亚群7.41%。基因种鉴定:27株菌株隶属于L. interrogans和L. borgpetersenii 2个致病性基因种,L. interrogans为江西省主要优势型别,占77.78%。MLST研究显示27株菌株隶属于5个ST型别,其中ST1为主要基因型,占59.26%。BioNumerics软件分析:27株菌株分为5个Clusters对应于5个ST型,MLST基因型别具有明显的地域性特征,而年代间变化不明显。结论 黄疸出血群为江西省主要流行血清群,L. interrogan为主要致病基因种,ST1为主要基因型,充分了解江西省钩体病血清学和分子流行病学特征将对钩体病防控和疫苗制备有一定的指导意义。     

单克隆抗体检测砂鼠利什曼原虫的研究

应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备出高特异性、高效价的抗砂鼠利什曼原虫单克隆抗体,选择其中2株对我国西北荒漠地区大砂鼠体内的分离物给予检测。从IFA,斑点-ELISA的实验结果,均证明为砂鼠利什曼原虫,同时以抗杜氏利什曼单克隆抗体测定则为阴性。从而进一步阐明砂鼠利什曼原虫为大砂鼠体内特有的一种亲皮肤但对人不致病的原虫。     

Development of a duplex-polymerase chain reaction for rapid detection of pathogenic Leptospira

A duplex-polymerase chain reaction (PCR) for the rapid detection of pathogenic leptospires was developed by using two sets of newly designed primers which amplified in the same reaction two different DNA fragments simultaneously: 279-bp of LipL32 and 430-bp of 16S rRNA. For DNA extraction from bacterial cultures, the silica-based spin column method was found to be more suitable and was selected for the extraction of DNAs from all 92 bacterial strains including 56 strains of pathogenic Leptospira, 15 strains of non-pathogenic Leptospira and 21 other strains of bacteria. The PCR products were analyzed by agarose gel-electrophoresis with confirmation by Southern and dot hybridization using synthetic DNA probe prepared from LipL32 gene of a pathogenic reference strain, L. interrogans serovar pyrogenes. The duplex-PCR allowed detection of two products of 279 bp and 430 bp in all pathogenic Leptospira. Non-pathogenic Leptospira generated a single product of 430 bp. Other bacterial strains failed to reveal any amplification products. As little as 1 pg of pure DNA corresponding to 100 cells could be detected by agarose gel-electrophoresis, and 1-10 fg of pure DNA by hybridization.     

Isolation of Salmonella enterica and serologic reactivity to Leptospira interrogans in opossums (Didelphis virginiana) from Yucatán,México

The presence of Salmonella enterica and serologic evidence of infection by Leptospira interrogans, were detected in the opossum Didelphis virginiana in a semi-urban locality of the Yucatán State, México. Ninety-one opossums were captured during the period April 1996 and May 1998. From a total of 17 feces samples, four Salmonella enterica subsp. enterica serotypes (Sandiego, Newport, Anatum, and Minnesota), and one Salmonella enterica subsp. arizonae serovar O44:Z4,Z23:- were isolated. Some opossums presented mixed infections. From 81 sera samples, four (4.9%) were positive to antibodies to Leptospira serovars pomona and wolfii. Both animals infected with Salmonella enterica and those serologically positive to Leptospira interrogans were captured in peridomestic habitat. Opossums infected with Salmonella enterica, were captured in dry season, and those seropositive to Leptospira interrogans during the rainy season. The implications of infection and reactivity of these zoonotic pathogens in D. virginiana in the Yucatan state are briefly discussed.     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

问号钩端螺旋体溶血素基因特征分析

目的　预测问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株致病因子———溶血素基因 ,并对其编码蛋白结构特征进行深入分析。方法　使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株溶血素基因诠释 ,所编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果　确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株 9个溶血素基因 ,分为两大类 :鞘磷脂酶类溶血素基因和非鞘磷脂酶类溶血素基因。并对溶血素基因编码蛋白二级结构、结构域、跨膜区域、信号肽及进化等进行了分析。结论　多种类型多条溶血素基因同时存在于钩端螺旋体菌中 ,暗示溶血素基因和钩端螺旋体致病性之间有密切的关系 ,可能在致病过程中起重要作用     

脂质体作为钩端螺旋体抗原载体、佐剂的研究

自黄疸出血群赖型70091株钩体提取了红细胞致敏物(ESS)和脂多糖(L-LPS)两种抗原成分。将它们分别与脂质体组装,形成新的钩体免疫制剂。通过金地鼠的保护力试验和家兔的抗体反应的检测,研究两种抗原的免疫原性和脂质体的免疫增强作用。结果表明,DPPC:Chol:DCP 脂质体能显著增强ESS的免疫原性。单纯ESS在每只地鼠40μg剂量时,只获36.7％的存活率,而脂质体-ESS则达到96.6％,并且这一活性依赖于ESS与脂质体在结构上的组装。该制剂还能增强家兔的抗体反应。此外,经脂质体-ESS制剂保护的存活金地鼠作肾培养,未发现有钩体带菌者。在本实验条件下,无论用单纯的或与脂质体组装的钩体LPS,直接免疫金地鼠,均未获得良好的保护力;然而用L-LPS免疫的兔血清对金地鼠则有良好的被动保护作用。