鼻咽癌CNE1细胞株中EB病毒LMP1胞外肽段稳定性的研究

目的 检测鼻咽癌CNE1细胞株潜伏膜蛋白1(LMP1)胞外肽段表达的稳定性.方法 运用免疫组化的方法检测CNE1细胞LMP1的表达情况,通过RT-PCR技术扩增CNE1细胞中含有LMP1三段胞外段的序列并测序.结果 免疫组化显示CNE1细胞高表达LMP1, 扩增LMP1胞外段的序列并测序,测序结果显示与已知序列相同,连续传代的CNE1细胞LMP1胞外段表达稳定.结论 证实LMP1胞外段表达稳定,为进一步研制LMP1胞外段特异性单克隆抗体,并为其在确定鼻咽癌放疗靶区的功能显像的研究奠定基础.     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

EB病毒LMP1 C端原核表达质粒的构建

目的 通过巢式PCR技术扩增EB病毒LMP1 C端,并构建其原核表达重组质粒,经诱导获得EB病毒LMP1C端蛋白.方法 用巢式PCR技术,从B95-8细胞中扩增EBV-LMP1 exon c DNA,克隆至pET-32a载体,转化入原核表达菌BL21,IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定.结果 巢式PCR扩增的LMP1exon c DNA长度为801 bp,测序结果与LMP1 C端cDNA序列吻合,诱导pET-32a-LMP1c重组原核表达菌株获得大小约48×103的LMP1 C端融合蛋白,Western blot表明重组蛋白能与LMP1单克隆抗体特异结合.结论 通过巢式PCR成功构建了原核表达载体,获得的EB病毒LMP1 C端融合蛋白为制备国产LMP1单克隆抗体,研究LMP1致瘤机制奠定了基础.     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备

目的: 制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒. 方法: 采用RT- PCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGW中. 经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体. 在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-LMP1导入病毒包装细胞293FT, 荧光显微镜检测基因的表达,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩,PCR鉴定. 结果: 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合; LMP1准确克隆入FUGW的多克隆位点. 慢病毒的3种质粒可高效转染入293FT细胞,荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光. 绿色荧光位于细胞的胞膜及胞质. 结论: 成功制备了LMP1与GFP融合基因慢病毒,为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.     

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的　研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法　用反义LMP1DNA的真核表达载体anti—pcDNA3．1—LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2，G418筛选抗性克隆;Western-blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达；用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义CNE2细胞克隆；转染后LMP1蛋白表达降低；转染后细胞活力和生长速度均有下降，集落形成能力显降低。结论　将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长，逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

人TLR1胞外段的克隆及测序分析

目的构建人Toll样受体1(TLR1)胞外段原核表达质粒。方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从人外周血单个核细胞(PBMC)mRNA中扩增人TLR1胞外区cDNA;将扩增的目的基因与原核表达载体pET30a(+)质粒经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后连接,转化E.coli BL21(DE3),筛选转化子,菌落PCR及测序验证克隆序列的正确性。结果测序结果表明,成功构建pET30a(+)-TLR1胞外区基因重组质粒,并转化感受态E.coli BL21(DE3)。结论 TLR1胞外段在大肠杆菌BL21中正确克隆,为TLR1信号通路的进一步研究打下了基础。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的　构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法　通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果　扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论　成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 ,研制生物抗癌药物奠定基础     

EB病毒LMP1蛋白CTAR23结构域的原核表达及纯化

目的 获得纯化的LMP1 CTAR23结构域蛋白。方法 用RT—PCR方法从B95—8细胞中扩增EBV LMP1 CTAR23结构域的cDNA，将其克隆至PGEM-T easy载体后进行测序鉴定。亚克隆至原核表达载体PGEX-6P-3，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组菌株表达。用SDS—PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定，用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化，PreScission Proteas酶对融合蛋白进行解离。结果 扩增的LMP1 CTAR23长度为357bp，测序结果与已知序列吻合。获得PGEX-6P-3-CTAR23原核表达菌株，Western blot表明重组蛋白能被LMPI单克隆抗体特异结合。获得约42000u的PGEX-6P-3-CTAR23融合蛋白，分离纯化出约13000u的LMP1 CTAR23蛋白。结论 成功获得EBV LMP1 CTAR23蛋白，为研究LMP1致瘤机制，研制生物抗癌药物奠定基础。     

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1 的构建与鉴定

[目的]构建能在酵母中表达EBV潜伏膜蛋白1(LMPl)的穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1.[方法]RT-PCR方法扩增EB病毒LMP1全外显子片段,利用DNA重组技术将其定向插人细菌-酵母穿梭质粒pGBKT7的T7启动子下游.[结果]限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合;LMP1准确克隆人pGBKT7的多克隆位点,未改变读码框架.[结论]成功构建了穿梭质粒pGBKT7-LMP1.     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX,RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞,G418筛选后,观察和检测转基因细胞的形态学特点,在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化;用pLNSX,pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞,检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比,CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态,相对迁移明显增大（n=3,P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失;随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2,0、6,1．0μg）,对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加,呈明显浓度依赖性;LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型,对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一,位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。     

小鼠A20RS样细胞模型的初步建立

目的：研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)转染小鼠B淋巴瘤细胞A20能否诱导出霍奇金淋巴瘤H／R-S样细胞．方法：采用RT-PCR方法获得LMP1全外显子片段，使之克隆到真核表达载体PLXSN中，限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体；运用脂质体介导转染技术，将LMP1的真核表达重组质粒和空载体质粒导入．420细胞．结果：扩增的LMP1cDNA长度为1．1kb，测序结果与已知序列吻合，重组真核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子；经G418筛选获得稳定整合了LMP1和空载体的亚克隆细胞，Western Blot印迹鉴定PLXSN-LMP1组有LMP1蛋白的表达，出现了H／R—S样细胞形态改变．结论：建立了小鼠A20RS样细胞模型，为下一步建立霍奇金淋巴瘤动物模型，研究其发病机制奠定了基础．     

胰高糖素样肽-1基因荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆大鼠胰高糖素样肽-1（GLP-1）的编码基因，构建荧光真核表达载体，为研究GLP-1与糖尿病的相关性奠定实验基础。方法：用RT-PCR方法从大鼠胰腺组织中扩增GLP-1的编码基因，克隆至PMD18-T载体并测序，结果正确后亚克隆至荧光真核表达载体pEYFP-N1中。结果：测序证实从胰腺中扩增出的GLP-1编码基因的序列及读框全部正确，重组质粒pEYFP-GLP-1经酶切后产生与理论预期长度相符的片段。结论：克隆了大鼠GLP-1的编码基因，成功构建了荧光真核表达载体pEYFP-GLP-1。