三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养及生物学特性的研究

目的观察三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养的形态学变化,并对其功能进行测定。方法采用改良原位2步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,台盼蓝拒染实验观察细胞活力,利用三明治培养构型培养成年大鼠原代肝细胞,倒置显微镜下连续观察肝细胞的形态学变化,定期收集培养细胞上清液,检测培养肝细胞的分泌及合成功能,并与单层胶原培养肝细胞比较。结果平均每个鼠肝可获取2×108~3×108个肝细胞,活率在(93±3)%;体外肝细胞培养第3天,清蛋白分泌功能、尿素合成能力恢复到最佳状态。三明治构型培养的肝细胞清蛋白分泌功能、尿素合成能力在培养的14d内始终维持较高的水平,并形成肝索样结构,伴胆小管网络形成,肝细胞形态维持达28d以上。结论三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能,三明治构型不仅可以应用于肝细胞的基础研究,而且为肝细胞移植和生物人工肝治疗肝衰竭奠定了一定的基础。     

28℃条件下短期培养新生广西巴马小型猪肝细胞的初步观察

目的对28℃条件下短期培养猪肝细胞的可行性进行初步评价.方法将刚分离的新生广西巴马小型猪肝细胞采用28℃条件下的短期培养1～3 d后,恢复37℃继续培养,观察升温前后肝细胞的形态及LDH、AST的释放量,检测28℃短期培养后肝细胞的氨清除率和尿素合成量.结果在28℃短期培养的肝细胞,用倒置相差显微镜观察到典型的形态特征,细胞未见明显增殖,恢复37℃继续培养后,肝细胞迅速增殖并维持典型的肝细胞形态;经28℃短期培养后的肝细胞和未经28℃短期培养的肝细胞均保持较强的尿素合成和氨清除能力,但在28℃培养2 d和3 d后的肝细胞尿素合成量较在28℃培养1 d后的肝细胞尿素合成量显著降低(P＜0.01);培养期内LDH、AST漏出量较少.结论28℃短期培养能较好地维持猪肝细胞的形态学特征和功能,有望成为一种有效的保存和运输生物人工肝细胞材料的方法.     

三维拟生态培养网片培养猪肝细胞的功能和形态观察

目的通过观察猪肝细胞的功能和形态,探讨一种三维拟生态培养网片用于猪肝细胞培养的可行性。方法两步法分离乳猪肝细胞,接种于培养网片进行培养,观察培养基中各项生化指标、白蛋白以及培养装置进出口氧分压差的变化,分析安定清除率和尿素合成率的变化,观察肝细胞在培养网片中的形态特征。结果以培养时间分组,分为0、2、4、6、8h组,各组培养基中谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素浓度(TBIL)以及培养装置进出口氧分压差的均数无明显差异(P>0.05);以不同时间段分组,分为0-2、2-4、4-6、6-8h组,尿素氮合成率和安定清除率均保持较高水平,组间存在明显差异(P<0.05),随着时间的延长而有所下降;培养结束时可观察到网片中肝细胞生长的典型形态特征。肝细胞在培养网片中的培养密度达到了108/ml以上。结论生长在培养网片中的肝细胞保持了稳定的生化活性、良好的物质转化代谢能力和生物合成能力、典型的细胞生理代谢特点和生长形态学特征,该培养网片实现了肝细胞的高密度和高活性培养。今后可进一步探讨以此培养网片为基础构建一种新的肝细胞培养系统,以及其应用于生物人工肝的研究。     

脑死亡状态对巴马小型猪肝脏形态与功能的影响

目的探讨脑死亡状态对巴马小型猪肝脏的影响及其机制。方法巴马小型猪15只,随机分脑死亡组(B组)、灯盏花素处理组(P组)和对照组(C组),每组5只。用颅内加压法建立脑死亡模型。建模成功后,B组不行其他处理;P组分别于初次确认脑死亡后1、12h时灯盏花素按2.5mg/kg,加入100ml生理盐水中,静脉滴注;C组仅开颅麻醉维持。脑死亡3、6、12、18和24h取血清测丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL1β、IL6水平。取脑死亡后6、12和24h点肝组织行HE染色并免疫组化法测蛋白激酶Cα(PKCα)的表达水平并RT PCR法测PKCαmRNA的变化,12、24h点肝组织观察肝脏超微结构变化。结果初次判定巴马小型猪脑死亡后12、18和24h:ALT水平C组分别为33.0±6.7、29.0±1.6和(36.6±5.6)U/L,B组分别为141.8±9.1、191.4±10.9和(238.6±10.4)U/L,P组分别为91.0±4.9、131.6±6.4和(175.6±7.0)U/L;AST水平C组分别为27.4±3.9、29.8±1.6和(29.2±3.4)U/L;B组分别为91.4±8.1、126.6±5.5和(184.4±5.4)U/L;组分别为59.2±6.1、86.8±5.5和(146.2±6.4)U/L;B组血清ALT、AST水平随着脑死亡时间的延长逐渐升高;明显高于C组,P组两者水平亦升高,但升高幅度较B组低。炎症介质在首次判定脑死亡后3、6、12、18和24h的IL1β水平,C组分别为5.91±0.17、5.91±0.10、6.06±0.12、6.08±0.12和(6.10±0.15)pg/ml,B组分别为8.26±0.21、9.17±0.08、10.30±0.11、12.53±0.35和(16.37±0.16)pg/ml,P组分别为7.75±0.12、8.08±0.11、9.25±0.21、11.44±0.19和(15.43±0.36)pg/ml;IL6水平C组分别为17.35±0.59、18.04±0.23、17.99±0.83、17.77±1.05和(17.62±0.67)pg/ml,B组分别为29.50±1.92、37.92±1.69、46.32±1.70、56.62±1.95和(66.68±2.11)pg/ml,P组分别为21.27±1.05、23.65±1.09、31.46±1.91、37.60±1.75和45.16±1.9pg/ml;TNFα水平,C组分别为14.94±0.36、15.03±0.49、14.71±0.46、14.66±0.31和(14.64±0.63)pg/ml,B组分别为19.45±0.16、21.76±0.25、24.31±0.20、27.65±0.27和(31.35±0.16)pg/ml,P组分别为18.45±0.11、20.21±0.41、23.41±0.32、26.17±0.21和(28.36±0.20)pg/ml;B组血清IL1β、IL6和TNFα水平随着脑死亡时间的延长逐渐升高;明显高于C组,P组三者水平亦升高,但升高幅度较B组低。6、12和24h的肝细胞中PKCα蛋白表达水平,C组分别为0.0887±0.0113、0.0950±0.0284和0.0994±0.0113,B组分别为0.1508±0.0108、0.3811±0.0382和0.6209±0.0312,P组分别为0.1091±0.0292、0.1284±0.0142和0.2995±0.0276;6、12和24h肝细胞中PKCαmRNA表达水平,C组分别为5782±594、5501±423和5729±533,B组分别为26789±3059、32877±5526和39869±6548,P组分别为24027±5012、20409±4793和14307±3786。PKCα蛋白在C组肝细胞表达在胞浆内,仅见少量阳性细胞,B组6h可见肝脏中阳性细胞显著增多,P组PKCα蛋白表达阳性细胞较B组低。3脑死亡后肝脏中PKCαmRNA的变化与PKCα蛋白变化趋势相同。肝脏光镜及电镜下肝脏损伤变化B组明显重于C组,P组在脑死亡后12h仅出现细胞水肿。结论脑死亡状态下肝脏出现功能与形态学的损伤性变化;PKCα可能参与了这种损伤机制,灯盏花素能够抑制动物肝脏中PKC-α的活化,灯盏花素处理可以减轻肝脏这种损伤。     

三明治羊膜代心包防止粘连的实验效果

探讨人三明治羊膜替代心包防止粘连的临床效果，并与硅橡胶进行了比较。方法：选用１２只山羊，切除部分心包，以人羊膜和硅橡胶替代心包，观察防止粘连的效果。结果术后所有羊恢复良好，无切口感染及其它并发症。     

新生小鼠肝细胞的体外培养

目的：探讨体外培养新生小鼠肝细胞的方法。方法：采用肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法培养新生小鼠肝细胞，并比较两种方法，结果：运用这两种方法成功地培养出原代肝细胞，并能够传代，光镜证实培养细胞为肝细胞，结论：这两种方法为广泛开展肝细胞培养奠定了基础。     

脑死亡状态下巴马小型猪肝脏功能和形态的变化

目的:观察脑死亡状态下肝脏功能和形态的变化.方法:巴马小型猪10只,随机等分为脑死亡组和对照组.脑死亡组应用改进的缓慢间断颅内加压法建立脑死亡模型,通过呼吸、循环支持维持脑死亡状态24 h;对照组维持麻醉24 h,不建立脑死亡模型.分别测定脑死亡后3 h、6 h、12 h、18 h和24 h各组动物血清中ALT、AST水平,并与对照组相应时点比较.观察各时点肝脏组织学变化及超微结构变化.结果:脑死亡组12 h、18 h、24 h血清ALT、AST水平均高于对照组相应时点和脑死亡组前一时点(P均＜0.05).脑死亡组12 h可见肝细胞轻度浊肿,胞浆疏松化,12 h电镜发现肝细胞内出现轻微线粒体肿胀,24 h可见线粒体肿胀,嵴消失,甚至线粒体部分膜溶解、内质网扩张呈池状等改变.对照组光镜及电镜下未见明显的损伤性变化.结论:脑死亡状态导致肝脏出现功能和形态的损伤性变化,随着脑死亡维持时间的延长而加重.     

小型猪及医学实验应用概述

猪和人在解剖学、生理学方面极其相似。在心血管系统、消化系统、生殖系统、老年病学、血液学、营养学、内分泌系统、皮肤、牙科、眼科、放射生物及免疫学研究中常用猪作为实验动物。近年来异种组织器官移植已受到医学界广泛重视,猪作为组织器官供体已显示出诱人的美好前景。因此,实验猪越来越受到生命科学领域的关注。但是普通猪体型大,饲育费用高,不便于实验操作和术后管理。小型猪体型小,饲料消耗低,操作管理方便,成为更理想的实验动物材料。在国外,二次大战以后已将猪作为实验动物广泛应用于生物医学研究,并且已培育     

实验用小型猪营养需要研究进展

随着小型猪实验动物化研究的不断进步 ,小型猪作为生命科学研究的实验动物越来越受到人们的重视,因此生产标准化的小型猪至关重要,而对小型猪营养需要的了解和饲料标准的制定是生产标准化小型猪的重要基础之一.本文就小型猪的国内、外品种,小型猪的消化代谢特点以及对能量、蛋白质、矿物质及粗纤维营养需要的研究进展进行综述.     

大鼠原代肝细胞的形态和功能

目的 :对分离培养的原代大鼠肝细胞进行形态学观察和功能研究 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态 ,以便更好地用于肝细胞移植或生物人工肝 .方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法灌注SD雄性大鼠肝脏 ,获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行培养 .台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率 ;光镜下直接或HE染色后动态观察细胞形态学改变 ,透射电镜观察其超微结构 ;并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能 .结果 :每只大鼠肝平均可获取 1 .2 1× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 % .光镜下可见肝细胞呈多角形生长 ,有双核 ,连接成片状或岛状 .电镜下可见内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞连接及胆小管 .肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1wk内出现波动性变化 ,第 3日LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好 .结论 :离体培养的 3d原代肝细胞具有较好的功能 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机     

改构型酸性成纤维细胞生长因子对体外培养肝细胞增殖活性的影响

目的 探讨改构型酸性成纤维细胞生长因子(MaFGF)对体外培养大鼠肝细胞增殖的影响.方法 采用“0.25％胰酶+0.1％胶原酶”消化法分离培养大鼠肝细胞并传代纯化扩增,取第3代细胞鉴定后实验:①形态学法观察在不同浓度MaFGF组中细胞的形态变化;②将实验随机分为对照组和MaFGF组,MaFGF组加入一系列浓度的MaF-GF,MTT法测定不同浓度MaFGF组作用于肝细胞24、48、72h的促增殖活性;③MTT法筛选出最适的MaFGF浓度,用此浓度和不加生长因子2种方式培养细胞,并绘制细胞生长曲线.结果 ①MaFGF对体外培养的肝细胞有一定的促增殖作用,但是与浓度不成正比;且实验表明24 h的增殖率较其它时间点显著增高(P＜0.05);比较对照组和各组(4.68×10-3 ～7.80×10-3 mg/L MaFGF组)均差异有统计学意义(P＜0.05),但各组间对肝细胞的促增殖作用的差异无统计学意义;②最适浓度(6.24×10-3 mg/L) MaFGF的第4天细胞数量较对照组明显增加(P＜0.05);MaFGF组的第10天细胞数(12.4×104)是对照组(6×104)的2.1倍(P＜0.05).结论 在适宜浓度和时间内,MaFGF对肝细胞具有一定的促增殖作用且不具有浓度依赖性.     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

猪肝细胞的分离与原代培养

目的：建立稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。 方法:应用改良Seglen法进行肝脏原位胶原酶灌流分离猪肝细胞,进行平面培养,动态观察细胞生长过程中的形态结构变化。 结果：平均每只猪可获得2×10¹⁰个肝细胞,细胞活率达到92.5%。在平面培养过程中维持了正常肝细胞的形态。 结论：原位胶原酶灌流法是获得大量高活率的猪肝细胞的首选方法,猪肝细胞原代分离培养是目前解决组合型生物人工肝脏（HBLSS）应用中细胞来源问题的主要途径。     

HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究

目的通过HBV体外感染22周龄原代培养人胎肝细胞,比较常用检测指标的敏感性和特异性.方法利用HBV阳性血清感染体外培养的原代人胎肝细胞.应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中cccDNA.结果胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2天出现阳性,培养上清和细胞中HBVDNA定量自第4天起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6天出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9天出现阳性.结论HBV在原代培养人22周龄的胎肝细胞中能够稳定复制和表达,各种检测指标的灵敏性和特异性不一,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg敏感性好,特异性可.     

体外培养树鼠句肝细胞的初步观察

目的 探讨体外培养的树Qu肝细胞形态结构与生物合成功能。方法 采用体外两步灌流法分离肝细胞,以L15培养基予以培养,光电镜下动态观察细胞形态结构,同时检测不同时相点培养上清中蛋白及甲胎蛋白含量。结果 采用简易体外两步灌流法分离的肝细胞,经台盼蓝拒染试验证实肝细胞的存活率为90％,体外培养的肝细胞在第3－10天具有良好的增殖分化功能,维持此形态和功能至培养第18天。结论 体外培养的树Qu肝细胞具有良好的形态结构和生物合成能力,能够满足肝炎病毒体外研究培养的需要。     

Restoration of cell polarity and bile excretion function of hepatocytes in sandwich-culture

Objective： To investigate the nature of the restoration of cell polarity and bile excretion function in Sandwich-cultured hepatocytes. Methods ： Freshly isolated hepatocytes from male Sprague-Dawley rats were cultured in a double layer collagen gel Sandwich configuration. Morphological changes were observed under a inverted microscope. The domain specific membrane associated protein DPP IV was tested by immunofluorescence, and the bile excretion function was determined by using fluorescein diacetate. Hepatocytes cultured on a single layer of collagen gel were taken as control. Results.. Adult rat hepatocytes cultured in a double layer collagen gel sandwich configuration regained its morphological and functional polarity and maintained polygonal morphology for at least 4 weeks. Immunofluorescence studies using antibodies against DPP IV showed polarity restoration as early as 48 h. After cultured in the double layer collagen gel Sandwich configuration for 96 h the hepatocytes began to excrete bile; while hepatocytes cultured on a single layer collagen gel had no bile excretion. Conclusion.. Hepatocytes cultured in a double layer collagen gel Sandwich configuration are able to regain their morphological and functional polarity given certain conditions. Hepaotcyte culture is a useful tool for the study of polarity restoration.     

维生素E对培养肝细胞抗脂质过氧化作用的影响

目的：观察维生素E对体外培养大鼠肝细胞抗脂质过氧化影响,探讨维生素E抗肝纤维化作用。方法：以TBA反应法观察4种不同浓度的维生素E对培养大鼠肝细胞上清丙二醛的影响;细胞计数观察合适浓度维生素E对肝纤维化大鼠肝细胞的保护作用。结果：不同浓度维生素E抗脂质过氧化作用不一,浓度过大或太小,其抗脂质过氧化作用均降低;合适浓度的维生素E对大鼠肝细胞有一定的保护作用。结论：在合适浓度下,维生素E对体外培养肝细胞有较强的抗脂质过氧化及保护作用。     

培养肝细胞在蛋白质组学研究中的应用

目的研究一种简便的肝细胞培养方法以培养出足够量的单一类型细胞，从而获得尽可能多的蛋白量进行细胞蛋白质组学分析。方法采用肝组织块贴壁法培养并传一代(目的是去组织块及其他间质细胞)。收集细胞蛋白并进行SDS—PAGE及双向凝胶电泳。结果本实验方法可获得高密度、高纯度、高活力的肝实质细胞，细胞裂解后得到的蛋白质电泳图谱效果好。结论实验方法操作简单、经济、高效，能够满足一般实验室进行细胞蛋白质组学分析。     

大鼠肝细胞的分离及原代长期培养

目的 :研究大鼠肝细胞分离的简易方法及长期培养过程中肝细胞形态变化过程。方法 :采用体外胶原酶二步灌注法分离大鼠肝细胞 ,TB染色法计算细胞数及细胞活率。 MTT法观测新生牛血清对大鼠肝细胞增殖的影响。在含 1 0 %新生牛血清及其他附助因子的 Williams′E条件培养基中原代长期培养 ,并进行形态学的动态观察。结果 :平均每只大鼠可获取 2 .2 6× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 95.6%。新生牛血清浓度与大鼠肝细胞增殖有明显的量效关系 (P<0 .0 1 )。在 Williams′E培养基中可存活 5～ 6周并保持正常形态。结论 :本方法分离的肝细胞有较高的获取率和活力 ,适合体外长期原代培养     

长爪沙鼠肝细胞体外分离培养体系的建立

目的：建立长爪沙鼠原代肝细胞分离培养体系。方法：以雄性长爪沙鼠肝细胞为供体,采用组织消化法和Seglen两步灌流法分离肝细胞,以台盼蓝染色检测细胞得率和活率,PAS法鉴定肝细胞,倒置显微镜观察肝细胞形态变化,并使用含有多种细胞因子的培养基维持培养。结果：组织消化法和Seglen两步灌流法平均每只长爪沙鼠肝脏分离获得肝细胞分别为(1.33?.34)?07个、(3.97?.15)?07个,细胞活率分别为(29.4?.05)%、(80.3?.56)%,这两种方法在细胞得率及活率方面存在显著差异。肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS法染色后被染成红色。结果表明肝细胞在贴壁后72h内,肝细胞形态发生显著变化。结论：采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种高效获得肝细胞的方法。各种细胞因子有利于维持肝细胞在体外的生长分化,长爪沙鼠原代肝细胞分离培养体系的建立将为肝脏相关疾病研究和防治药物的开发提供技术支持。