基因芯片技术筛选辛伐他汀作用K562细胞的差异表达基因

0引言研究证实辛伐他汀能抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖并诱导其凋亡,但其作用机理尚不明确.本实验采用基因芯片技术筛选辛伐他汀作用K562细胞的差异表达基因,以探讨其作用机制.     

cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术，研究cyclin E基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclin E mRNA设计siRNA序列，经PCR方法体外扩增，得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物．以Lipofectamine^TM 42000脂质体法转染K562细胞，分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组，转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测，观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比，活细胞计数减少约80％，G1期细胞百分比增高30％，细胞基本停止增殖。干扰组cyclin E mRNA表达明显减弱，相对阴性对照组及空白对照组，干扰组mRNA表达下降70％。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclin E基因的表达，并进一步抑制细胞的生长，但对于干扰的长期有效性尚无实验结论，需通过长效表达载体实验验证．     

cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术,研究cyclinE基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclinEmRNA设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,以LipofectamineTM2000脂质体法转染K562细胞,分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组,转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比,活细胞计数减少约80%,G₁期细胞百分比增高30%,细胞基本停止增殖。干扰组cyclinEmRNA表达明显减弱,相对阴性对照组及空白对照组,干扰组mRNA表达下降70%。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclinE基因的表达,并进一步抑制细胞的生长,但对于干扰的长期有效性尚无实验结论,需通过长效表达载体实验验证。     

辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制

目的:探讨不同剂量的辛伐他汀处理裸鼠体内K562细胞的信号通路的分子变化,以说明辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的分子机制.方法:体外培养K562细胞并经皮下接种Balb/c-nu/nu裸小鼠K562细胞,构建裸小鼠的K562细胞动物模型.采用缺口末端标记技术TUNEL法检测辛伐他汀诱导K562细胞早期凋亡的变化.采用RT-PCR检测K562细胞中Ras分子和PI3K-AKT信号通路的n-ras,pi3k,akt1,nf-κb1 mRNA的差异表达.结果:不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞凋亡,并随剂量的增加凋亡率逐渐增高(P＜0.01);不同剂量的辛伐他汀能够引起n-ras,pi3k,akt1,nf-κb1 mRNA的表达差异(P＜0.01).结论:辛伐他汀能够引起参与K562细胞凋亡的Ras 分子和PI3K-AKT信号通路的基因变化,从一定的角度说明辛伐他汀在体内能够诱导K562细胞凋亡.     

辛伐他汀通过Caspase-12活化途径诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的 探讨Caspase-12在辛伐他汀诱导K562细胞凋亡中的作用.方法 在K562细胞培养液中分别加入毒胡萝卜素(阳性对照组)和辛伐他汀10、20、30μmol/L(辛伐他汀组)培养72 h,采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率.激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内Ca2 抖浓度,RT-PCR检测GRP78、Calpain基因mRNA表达水平,Western blot检测GRP78、Caspase-3,-6,-7,-9,-12蛋白水平.结果 10、20、30μmol/L辛伐他汀作用K562细胞72 h后,细胞出现典型的凋亡形态,凋亡率分别为12.41%士0.32%、19.08士0.26%、23.41士0.36%;细胞内Ca2 浓度增加,荧光强度分别为43士2.9、54士2.7、64士2.6:GRP78、Calpain基因mRNA表达上调;Western blot检测显示:Caspase-3,-6,-7,-9,-12剪切活化,GRP78表达增强.结论 Caspase-12作为细胞凋亡的重要途径参与了辛伐他汀诱导K562细胞的凋亡.     

K562细胞7种珠蛋白基因 mRNA水平的研究

目的研究K562细胞α、β、Gγ、Aγ、ζ、ε、δ珠蛋白基因mRNA水平。方法采用RT-PCR在相同条件下同时扩增成功7种珠蛋白mRNA,比较K562细胞内各珠蛋白mRNA水平。结果α基因簇中α-mRNA水平明显高于ζ-mRNA,B基因簇mRNA表达水平依次为Gγ、Aγ、ε、δ,K562细胞不表达B-珠蛋白mRNA。结论转录后水平的调控可能在k562细胞α基因簇的表达中起重要作用,B基因簇各珠蛋白mRNA水平和蛋白质水平基本相符。     

辛伐他汀诱导裸鼠体内K562细胞凋亡过程中NF-κB通路的分子变化

目的:探讨辛伐他汀在裸鼠体内引起的K562细胞NF-κB信号通路的分子变化,以说明辛伐他汀是否依赖NF-κB信号通路参与K562细胞凋亡发生.方法:体外培养慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞,接种于18只BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下,构建移植瘤模型.随机分为3组,每组6只.对照组腹腔注射生理盐水0.2 ml,两个处理组分别注射0.2 g/L的辛伐他汀0.25 ml(0.05 mg)和0.4 ml(0.08 mg).均隔日注射,连续6次.采用TUNEL法检测K562细胞早期凋亡的变化,RT-PCR检测K562细胞中NF-κB信号通路IKK-β、IκB-α、NF-κB1 mRNA的差异表达.结果:不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞发生明显的凋亡,且高剂量组凋亡率高于低剂量组(P＜0.01);不同剂量的辛伐他汀能够引起 IKK-β、IκB-α、NF-κB1 mRNA的表达下调(P＜0.01).结论:辛伐他汀可诱导K562细胞凋亡,可能与NF-κB通路基因的表达下调有关.     

辛伐他汀诱导裸鼠体内K562细胞凋亡过程中NF κB通路的分子变化

目的：探讨辛伐他汀在裸鼠体内引起的K562细胞NFκB信号通路的分子变化，以说明辛伐他汀是否依赖NFκB信号通路参与K562细胞凋亡发生。方法:体外培养慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞，接种于18只BALB/cnu/nu裸小鼠皮下，构建移植瘤模型。随机分为3组，每组6只。对照组腹腔注射生理盐水0.2 ml，两个处理组分别注射0.2 g/L的辛伐他汀0.25 ml（0.05 mg）和0.4 ml（0.08 mg）。均隔日注射，连续6次。采用TUNEL法检测K562细胞早期凋亡的变化，RTPCR检测K562细胞中NFκB信号通路IKKβ、IκBα、NFκB1 mRNA的差异表达。结果:不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞发生明显的凋亡，且高剂量组凋亡率高于低剂量组（P<0.01）;不同剂量的辛伐他汀能够引起 IKKβ、IκBα、NFκB1 mRNA的表达下调（P<0.01）。结论:辛伐他汀可诱导K562细胞凋亡，可能与NFκB通路基因的表达下调有关。     

K562细胞影响BMSCs生长及MIP-1α表达的实验研究

目的　研究K5 62细胞在与正常骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs)接触和隔离培养条件下对BMSCs生长特性及造血负调因子MIP 1α表达的影响。方法　加入K5 62细胞与BMSCs直接接触与用隔离膜两种方式培养 ,第 2、4、7、12天观察BMSCs生长增殖情况 ;检测培养上清的MIP 1α含量和BMSCs中MIP 1αmRNA的表达 ;TUNEL法检测BMSCs的凋亡。结果　加入K5 62细胞培养后BMSCs在第 12天时数量显著减少 ;接触培养BMSCs的凋亡在第 4天后显著高于对照组 (P <0 .0 1) ;MIP 1α水平升高到 4d与对照组有显著差异 (P <0 .0 1) ;BMSCs胞浆MIP 1αmRNA阳性率升高到第4天后与对照组有显著差异 (P <0 .0 1)。结论　K5 62细胞可抑制正常BMSCs生长 ,促进其凋亡 ,上调其MIP 1α的表达 ,可能是造成正常造血的抑制和白血病细胞导致造血微环境损伤的主要原因之一。     

RNAi技术沉默K562细胞中c-myc基因的初步研究

目的运用RNAi技术，设计针对c-myc的小干扰RNA(siRNA)，研究其干扰效果。方法针对c-myc mRNA的第1357靶位点设计siRNAs，经Lipofectamine^TM 2000脂质体法转染K562细胞，进行RT-PCR、细胞计数和MTT法及流式细胞仪检测，观察其干扰效果。结果转染组与阴性对照组和空白对照组相比，c-myc mRNA表达明显减弱．细胞计数和MTTD(λ)值均有显降低，并有明显的凋亡率。结论运用RNAi技术，可以有效地干扰c-myc的表达．并进一步诱导细胞凋亡。     

重复加热对肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期蛋白D1的影响

目的探讨多次热疗后残存下来的HepG2细胞增殖速度的变化及与此相关的可能原因。方法HepG2细胞43℃加热，每次80分钟，每天两次，共10个循环后，分析细胞倍增时间，检测细胞周期及细胞周期素D1的表达。结果热处理后的HepG2细胞增殖加快，细胞周期中S期和G2期的比率增高，细胞周期素D1的表达增强。结论热处理后的HepG2细胞增殖加快与其完成DNA复制而进入分裂的细胞比率高、细胞周期素D1的表达增强有关。     

TGFα对胃癌细胞cyclin E和cyclin D1表达的影响

目的 探讨TGFα对胃癌细胞cyclinE和D1表达的促进作用，为研究TGFα促胃癌发生发展机制提供重要信息。方法 ①细胞体外培养，用无血清RPMI-1640阻断法进行G0／G1期同步化，用碘化丙啶染色和流式细胞术，检测其同步化率；②细胞经G0／G1期同步化后，给予2.5％低浓度血清＋RPMI-1640培养处理，以及在此基础上分别加入10、30、50μg／L TGFα处理，均作用5h；用免疫荧光染色及流式细胞术，检测细胞cyclinE和D1的表达情况。结果 细胞经无血清RPMI-1640阻断法处理，其G0／G1期的百分率由常规培养的54％上升到72％；加入TGFα处理后，细胞cyclinE和D1表达均显著高于单用低血清培养（均P〈0.001），并随TGFα剂量的增加而增加；当TGFα浓度为50μg／L时，两者的表达与单用低血清培养比，分别增加了25.18％和27.52％（均P〈0．001）。结论 TGFα可显著促进胃癌细胞cyclinE和D1的表达，从而发挥其促细胞周期进程的作用。     

胶质瘤中端粒酶逆转录酶、c-myc、cyclin D1表达与预后的相关性

目的 探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)、c-myc、cyclin D1基因在胶质瘤中的表达与预后的关系.方法 收集56例手术切除的胶质瘤标本,应用原位杂交技术和免疫组化S-P法分别检测胶质瘤组织中hTERT和c-myc、cyclinD1基因的表达;6例正常脑组织作为对照.并对检测结果 与随访结果 进行综合分析.结果 56例胶质瘤中,30例表达hTERT,阳性率为53.6%;33例表达c-myc基因,阳性率为58.9%;32例表达cyclin D1基因,阳性率为57.1%.正常脑组织不表达hTERT、c-mye、cyclin D1.随着胶质瘤分级的升高,hTERT和c-myc、cyclin D1基因表达增强(P＜0.05).hTERT与c-myc、cyclin D1基因的表达两两成正相关关系(P＜0.05),三者的表达均与患者生存时间成负相关关系(P＜0.01).结论 hTERT、c-myc、cyclin D1基因的过表达与胶质瘤细胞的恶性变和过度增殖有关,三者联合检测可作为临床判断胶质瘤患者预后的重要指标.     

胃肠道间质瘤中E2F1和p16INK4α蛋白的表达与预后的关系

目的探讨E2F1和p16^INK4α胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors,GISTs）中的表达及两者的相关性,为GISTs的临床治疗和预后判断提供新的病理学依据。方法应用免疫组化EnVision法检测52例GISTs中p16^INK4α和E2F1的表达情况,分析二者表达与Fletcher分级、进行性疾病（progressive disease,PD）及CD117和PKC-θ表达之间的关系,并对二者与GISTs预后的关系进行统计学分析。结果E2F1蛋白阳性率73.1%,与Fletcher分级呈显著正相关（P〈0.001）;E2F1阳性表达与CD117阳性表达之间有显著性差别（P〈0.05）;E2F1阳性细胞数大于75%的病例与小于75%的三组（〈10%,10%-50%,50%-75%）之间PD发生率有显著性差异（P〈0.05）。p16^INK4α 52例GISTs中均有不同程度的阳性表达,与Fletcher分级呈显著负相关（P〈0.001）;p16^INK4α性细胞数小于50%的病例与大于50%的两组（50%-75%,〉75%）PD发生率之间差异有显著性（P〈0.05）。结论E2F1、p16^INK4α达与GISTs预后有关,可作为GISTs预后的标记物。     

Vitamin C Inhibits Benzo[a]pyrene-lnduced Cell Cycle Changes Partly via Cyclin D1/ E2F Pathway in Human Embryo Lung Fibroblasts

Objective To study the molecular mechanism of the inhibitory effects of vitamin C on benzo[a]pyrene （B[a]P）-induced changes of cell cycle in human embryo lung fibroblast （HELF） cells. Methods The stable transfectants, HELF transfected with antisense cyclin D1 and antisense CDK4, were established. Cells were cultured and pretreated with vitamin C before stimulation with B[a]P for 24 h. The expression levels of cyclin DI, CDK4, E2FI, and E2F4 were determined by Western blot. Flow cytometric analysis was employed to detect the distributions of cell cycle. Results B[a]P significantly elevated the expression levels of cyclin D 1, E2F1, and E2F4 in HELF cells. Vitamin C decreased the expression levels of cyclin D 1, E2F1, and E2F4 in B [a]P-stimulated HELF cells. Dose-dependent relationships were not found between the different concentrations of vitamin C （10, 100, 500, 1000, and 5000 lamol/L） and the expression levels of cyclin D 1, E2F1, and E2F4 in HELF cells. The expression levels of cyclin D1, E2FI, and E2F4 in B[a]P-treated transfectants were lower than those in B[a]P-treated HELF cells. The expression levels of cyclin DI and E2F4 treated with vitamin C and antisense cyclin D1 were decreased compared with those treated with antisense cyclin DI alone. The effects of vitamin C combined with antisense CDK4 on the expression levels of cyclin DI and E2FI/E2F4 were similar to those of antisense CDK4 alone. B[a]P progressed HELF cells from GI to S phase. Both vitamin C and antisense cyclin DI suppressed the changes of cell cycle progressed by B[a]P. However, antisense CDK4 did not attenuate the above changes. Vitamin C combined with antisense CDK4 markedly suppressed B[a]P-induced changes of cell cycle as compared with antisense CDK4. But the inhibitory effects of vitamin C combined with antisense cyclin DI on B[a]P-induced changes of cell cycle were similar to those of vitamin C alone or antisense cyclin DI alone. Conclusions B[a]P progressed HELF cells from G1 to S phase via intracellular signaling pathway of cyclin D I/E2F. Vitamin C may modulate this signaling pathway to protect cells from injury caused by B[a]P.     

P14ARF和E2F1在结直肠肿瘤中的表达及意义

目的:观察P14ARF、E2F1蛋白在结直肠肿瘤的表达,明确其对肿瘤发生及侵袭发展的影响.方法:应用免疫组化方法检测尸检正常结直肠组织6例,结肠腺瘤30例,不伴淋巴结转移(无LNM)结直肠癌35例,伴有淋巴结转移(有LNM)结直肠癌30例,后者再分为手术切缘组织、结直肠癌组织、淋巴结转移癌组织,共6组的P14ARF、E2F1蛋白表达情况,采用半定量和图像分析定量测定含量.结果:①结直肠正常黏膜组织、腺瘤组织、癌组织P14ARF、E2F1的表达阳性率逐渐减少,差异存在统计学意义(P<0.05).②P14ARF、E2F1在伴有淋巴结转移、肝转移的癌组织内表达阳性率与不伴转移的癌组织之间差异无统计学意义(P>0.05).③P14ARF、E2F1蛋白表达在不同临床病理特征的关系之间差异无统计学意义(P>0.05). 结论:①P14ARF、E2F1具有抑制癌发生作用,蛋白异常仅是结直肠癌癌变早期事件,与淋巴结、远处器官转移等侵袭活动无关,与临床病理特征无关.②P14ARF、E2F1相互协同抑制细胞生长和诱导凋亡,因而可以作为治疗结直肠癌的新靶点.     

胃癌中细胞周期调控因子D1、E的表达及其意义

目的 探讨细胞周期调控因子（cyclyin D1、cyclyinE）在胃癌中的表达及其意义。方法 用免疫组化检测胃癌、不典型增生及正常胃黏膜中cyclyin D1、cyclyinE的表达状况。结果 cyclyin D1在同病变组织中的表达率：进展期胃癌65．00％（26／40）、早期胃癌60．00％（12／20）、Ⅱ、Ⅲ期不典型增生45．00％（9／20）差异正常胃黏膜组织15．00％（3／20）。而cyclyinE的表达率分别为：进展期胃癌60．00％（24／40）、早期胃癌55．00％（11／20）、Ⅱ、Ⅲ期不典型增生35.00％（7／20）及正常胃粘膜组织20．00％（4／20）。胃癌和胃黏膜不典型增生组织的cyclyin D1、cyclyinE的表达与正常胃黏膜组织相比差异有显著性（P〈0．01及P〈0．05）；cyclyinD1在胃癌中的表达与分化及TNM分型无关，而cyclyinE与肿瘤分化程度、浸润深度及肿瘤分期相关。结论 细胞周期调控因子cyclyinD1、cyclyinE的过度表达与胃黏膜上皮组织的过度增生及胃癌的发生有密切关系．检测cyclyinE作为胃癌的进展程度的一个指标。     

组织芯片研究胃肠道间质瘤中E2F1、MDM2及P53的表达及意义

目的 探讨E2F1、MDM2及P53在胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)中的表达及与GIST临床病理特征和预后的关系.方法 利用组织芯片技术及免疫组化EnVision法检测123例GIST中E2F1、MDM2及P53的表达情况,分析三者表达与临床病理特征的关系,并对三者与GIST预后的关系进行统计学分析.结果 123例GIST中108例有三种蛋白均可评估,108例中E2F1、MDM2及P53蛋白三者阳性表达率分别为62.0%,43.5%和57.4%.三者表达均与NIH分级呈显著正相关(均P＜0.001);在不同发生部位、是否坏死及有无转移复发之间差异均有显著性意义(均P＜0.05),且三者表达在肠道发生的GIST明显高于胃和肠道外部位(P＜0.05),胃和肠道外相比差异无统计学意义(P＞0.05);而在不同发生年龄及不同细胞类型间相比差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 E2F1、MDM2及P53表达与GIST预后有关,三者对评价GIST预后是非常有意义的标记物.     

逆转录病毒载体介导的RNAi对MCF-7细胞E2F1 mRNA表达的影响

目的:采用逆转录病毒载体介导的RNAi技术靶向抑制乳癌细胞MCF-7E2F1mRNA的表达。方法:构建重组的表达E2F1siRNA的逆转录病毒载体。将重组载体和空载体转染入MCF-7细胞中,共分9组:空载体组、未转染组和7个转染组。筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养。应用RT-PCR方法检测转染细胞和未转染细胞E2F1mRNA的表达情况。结果:筛选出7个转染逆转录病毒载体的单克隆,命名为SIR1~7,其E2F1mRNA表达量分别为0.857±0.015,0.850±0.037,0.907±0.029,0.878±0.021,0.900±0.021,0.912±0.031,0.913±0.023;转染空载体和未转染的细胞E2F1mRNA表达量分别为1.563±0.031和1.544±0.018;SIR1~7E2F1mR-NA表达量低于空载体及未转染组,差异有统计学意义(P<0.05),SIR1~7E2F1mRNA表达均受到抑制;SIR1~7之间以及空载体转染与未转染组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:逆转录病毒载体介导的RNAi技术特异、高效抑制靶基因的表达,为肿瘤基因治疗提供了新的思路和工具。     

尿脱落细胞E2F3 mRNA检测在膀胱癌诊断中的价值

目的探讨检测膀胱癌患者尿液脱落细胞中E2F3 mRNA的表达及意义。方法采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测58例膀胱癌患者,15例泌尿外科非肿瘤患者以及10例健康志愿者尿液脱落细胞E2F3mRNA的表达,并与尿脱落细胞学检查相对照。结果用RT-PCR法检测尿脱落细胞E2F3 mRNA用于诊断膀胱癌的敏感性为81.03%,高于尿脱落细胞学检测(41.38%)(χ2=19.206,p<0.05),两种方法诊断膀胱癌的特异性无统计学差异(p>0.05)。不同分化程度及不同临床分期膀胱癌患者之间尿脱落细胞E2F3 mRNA的阳性表达率的差异无统计学意义(χ2=0.517,p>0.05;χ2=0.132,p<0.988)。结论RT-PCR法检测膀胱癌患者尿液脱落细胞中E2F3 mRNA的方法可以作为诊断膀胱癌的无创性方法。