四环素诱导调控的腺病毒载体系统的构建及其应用

目的构建四环素诱导调控基因表达的腺病毒载体系统,评估该载体系统的高效性。方法利用PCR、限制性内切酶酶切、连接等分子生物学手段构建四环素诱导调控体系中调节因子序列、应答元件序列的穿梭载体。通过同源重组的方法将载体上的四环素调控因子以及应答元件序列整合于腺病毒基因组。利用RT-PCR检测病毒载体上四环素调节因子（rtTA和tTA）在Hela细胞中的转录水平;荧光素酶活性测定分析腺病毒载体系统的效率。在不同浓度强力霉素的诱导下,检测荧光素酶报告基因活性变化,分析可诱导调控腺病毒系统的有效性和敏感性。结果调控性腺病毒AdrtTA^Tet-on与Ad-tTA^Tet-off分别感染Hela细胞,逆转录PCR检测鉴定腺病毒载体Ad-rtTA^Tet-on与Ad-tTA^Tet-off的表达克隆用于调控应答性腺病毒Ad-TREmod/minCMV△-LUC、Ad-TREmod/U6-shLUC。在强力霉素的诱导下调控性腺病毒Ad-rtTA^Tet-on与Ad-tTA^Tet-on能够开启或关闭应答性腺病毒Ad-TREmod/minCMinCMV△-LUC、Ad-TREmod/U6-shLUC的表达,从而达到调控荧光素酶的表达或RNA干扰荧光素酶基因的目的。结论构建可诱导调控的腺病毒载体系统,该系统能够在强力霉素的调控下开/关目的基因、特异性干扰目的基因shRNA片段的表达。     

Tet-on系统诱导esp1基因表达对A549细胞染色体的影响

目的观察肺腺癌Am细胞经Tet-on系统诱导表达espl基因后其染色体数目的改变。方法利用PTet—on基因表达调控系统,先后将调控质粒Ptet-on和反应质粒PTK-Hyg与PTRE-EGFP-espl以合适的比例用FuGENE6脂质体共转染入A-细胞,经G418和潮霉素筛选成活并带有绿色荧光的细胞为转染成功细胞,挑选8个单细胞克隆并扩增培养,加入强力霉素诱导espl表达。用RT-PCR检测不同浓度强力霉素诱导以及强力霉素诱导不同时间的espl的表达量,并采用传统秋水仙素方法以及流式细胞技术检测诱导不同时间段A549／Ptet-on／TK-Hyg／PTRE-EGFP-espl细胞克隆染色体数目的改变。结果100～200ng／ml浓度范围的强力霉素诱导espl表达量最高,诱导1h即可有espl基因的表达,至48h表达量到达高峰之后逐步减少。在诱导24h后逐步出现染色体数目减少。结论上调espl基因对肿瘤细胞异常染色体有一定的抑制作用,对肿瘤治疗有潜在的应用价值。     

四环素治疗纳米细菌感染的Ⅲ型前列腺炎疗效观察

目的观察四环素治疗纳米细菌感染的Ⅲ型前列腺炎的临床效果。方法 86例纳米细菌感染的Ⅲ型前列腺炎患者分为观察组和对照组,每组43例。观察组患者给予四环素治疗,对照组患者给予左氧氟沙星治疗,连续用药1个月后,观察2组患者前列腺炎症状指数(NIH-CPSI)评分、前列腺液卵磷脂小体及纳米细菌再培养情况。结果治疗前2组患者NIH-CPSI、疼痛、排尿症状、生活质量及卵磷脂小体级别评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组患者治疗后NIH-CPSI、疼痛、排尿症状及生活质量评分显著低于治疗前,卵磷脂小体级别评分显著高于治疗前,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组患者治疗前后NIH-CPSI、疼痛、排尿症状、生活质量及卵磷脂小体级别评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后观察组患者NIH-CPSI、疼痛、排尿症状及生活质量评分显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗后观察组卵磷脂小体级别评分显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组和对照组患者治疗后前列腺液再培养后纳米细菌阳性例数分别为9例(20.9%)和43例(100.0%),观察组患者纳米细菌的阳性率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论四环素治疗纳米细菌感染的Ⅲ型前列腺炎效果显著,可作为治疗此类疾病的一线药物。     

转基因表达的四环素调控系统

上世纪70年代．Jaenich等将SV40的DNA导入小鼠囊胚，并在子代小鼠组织中检测到了SV40 DNA，证明了外源性基因导入胚胎细胞并实现整合是可能的；80年代，Gordon等又建立了显微注射转基因动物技术。此后，该技术迅速发展，先后出现了多种建立转基因动物的方法，其应用渗透到多个研究领域，成为人们深入了解生物的遗传物质、研究基因功能、建立人类疾病的动物模型以研究疾病的诊断与治疗的一个有力工具。     

四环素双表达调控表达载体的构建、鉴定

目的：构建在同一载体中可用四环素调控表达目的基因的载体。方法：以pcDNA4^TM/TO为模板,用PCR法扩增含四环素调控表达序列的片段TO（位于NdeⅠ和SacⅡ之间）,插入pUC118载体中测序,选择测序正确的序列取代pVITRO3载体中相应的片段,构建成pVITRO3-TO。用相同的方法以pcDNA6/TR为模板扩增四环素阻遏蛋白基因（TR）,经测序证实后插入pVITRO3-TO载体的一个多克隆位点。结果：用PCR成功扩增出四环素调控表达序列片段和四环素阻遏蛋白基因片段,亚克隆后各选2个克隆测序,均找到了序列正确的克隆,经内切酶双切后插入pVITRO3中,完成了目的载体的构建。结论：初步构建了四环素双表达调控表达载体（pVITRO3-TO-TR）。     

四环素混悬剂稳定性的研究

本文应用数理统计方法和稳定性升温加速试验研究了一些辅料及工艺对四环素混悬剂稳定性的影响,筛选和设计了该混悬剂的新处方。新处方混悬剂的贮存期(t_(0.9))经预测从原产品的19个月提高到24.7个月。并从实验结果和理论上说明:四环素在混悬剂液相介质中的溶解度是与其稳定性有关的重要因素之一;四环素复合物在混悬剂中的降解是伪零级速度过程;在均相溶液中的降解可以近似地用一级速度过程表示,降解的表观活化能是27.73千卡/克分子。     

四环素离子选择电极的研制

本文报道以四苯硼四环素和硅钨酸四环素为电活性物质,邻苯二甲酸二丁酯为增塑剂,制备聚氯乙烯(PVC)膜电极和石墨涂膜电极的方法,在10~(-5)mol/L～10~(-2)mol/L浓度范围内均符合Nernst方程,电极可直接应用于原料药与片剂的含量测定,操作简便、迅速。     

HBV-S基因四环素调控双表达载体的构建及其调控表达研究

目的:构建在同一载体中含乙肝病毒表面抗原基因(Hepatitis B virus surface gene,HBV-S)和四环素阻抑蛋白基因的双表达载体,研究在真核细胞中四环素对S基因表达的调控。方法:在双表达载体pVITRO3一个启动子后的多克隆位点插入四环素阻抑蛋白基因,用含四环素操纵子的启动子取代另一个启动子,并在其多克隆位点插入S基因,在同一载体中构建成S基因的四环素调控表达系统。用脂质体将重组质粒转染HepG2细胞,潮霉素400μg/ml进行抗性筛选,20 d形成抗性克隆,建立在四环素诱导下能稳定表达S基因的细胞系。以不同浓度的四环素(0.5、1.0、2.0、3.0μg/ml)进行诱导,用逆转录PCR和微粒子酶免疫分析法检测S抗原的表达,以确定四环素的最佳浓度。结果:转染了重组质粒的HepG2细胞,在无四环素环境下,表达HBsAg水平极低,72 h时S/N值平均为1.57,在不同浓度的四环素诱导下,HBsAg表达量明显增加,72 h时S/N平均值分别为4.24、4.23、4.18、4.20,未发现与四环素的浓度之间有剂量关系。结论:成功构建了在同一质粒中表达HBV-S基因和四环素阻抑蛋白基因的双表达...     

严密型四环素调控系统转基因首建鼠的建立

目的 制备ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠1,为严密型四环素调控系统的体内研究提供调控部分的转基因小鼠,以便与反应部分小鼠交配得到双转基因小鼠.方法 重组构建含目的 基因的质粒pApoE-rtTA-tTS,应用显微注射法将其注入母鼠的受精卵,再植入代母输卵管,出生小鼠经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA标本进一步鉴定.结果 产生了2只整合ApoE-rtTA-tTS基因的首建鼠.结论 成功制备了ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠,为下一步建立严密型四环素调控系统的双转基因小鼠模型奠定了基础.     

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

以PAC和BAC克隆为探针筛选cDNA文库

目的建立噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC）和细菌人工染色体（BAC）筛选人正常肝cDNA文库的方法,并期望分离到与肝癌相关的新基因。方法用位于17p13.3肝癌杂合性缺失区内的PAC579和BAC1529克隆为探针,以噬菌斑杂交筛选法筛选人正常肝cDNA文库,并对分离出的cDNA阳性克隆进行部分测序和计算机序列比较及Southern杂交分析,进一步确定可能与肝癌相关的新基因。结果以PAC579为探针,筛选出78个阳性克隆,经初步分析,其中18个为可能的肝癌相关新基因。以BAC1529为探针,筛选出8个阳性克隆,经初步分析,其中5个为可能的肝癌相关新基因。结论以PAC和BAC克隆为探针筛选cDNA文库是一种有效的表达序列分离法,将有助于疾病特别是肿瘤的病因研究。     

四环素致BALB/c小鼠肝脏毒性的基因表达谱研究

目的利用毒理基因芯片技术研究四环素肝脏毒性效应的分子机制.方法利用本室构建的小鼠毒理基因芯片和四环素致BALB/c小鼠肝毒性动物模型,观察不同剂量和时相点小鼠肝脏基因表达谱变化,利用Gene OntologyConsortium分析系统并结合层次聚类对差异表达基因进行初步功能分析.结果四环素作用后引发肝脏多种基因表达改变,聚类分析发现高、低剂量四环素作用的表达谱明显差异,高剂量各时相点差异基因聚类分为4类,涉及的分子机制包括能量代谢抑制,蛋白质合成和降解增加,抗氧化体系受损,信号转导基因表达改变促进凋亡发生,以及药物代谢相关酶系基因抑制等.结论毒理基因芯片技术能够为我们在分子水平上提供四环素对小鼠肝脏毒性损伤机制的众多线索,为进一步生物学效应研究奠定基础.     

在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中四环素诱导表达恶性疟原虫MSP1-31片段基因

目的:用含PLtetO启动子的pZE11质粒在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中表达恶性疟原虫MSP1-31片段基因.方法:构建受四环素诱导调控的重组质粒pZE11/MSP1-31,将该重组质粒用电穿孔转化法转化入减毒伤寒杆菌CVD908/tetR疫苗株中,用免疫印迹反应检测MSP1-31在CVD908/tetR株中的四环素诱导表达.结果:构建了重组的pZE11/MSP1-31质粒,免疫印迹反应显示该MSP1-31基因在CVD908/tetR株中得到有效表达,且依赖于四环素的存在.结论:成功地构建了由四环素诱导的、表达恶性疟原虫MSP1-31的减毒伤寒杆菌疫苗株.     

强力霉素抑制鼠眼化学伤角膜新生血管形成

[目的]观察强力霉素对鼠眼化学伤角膜新生血管形成的影响.[方法]取SD大鼠42只,制成眼碱性化学伤模型,随机分为强力霉素治疗组与对照组,每组21只大鼠(右眼),治疗组强力霉素30mg/(kg·d)灌胃给药,对照组等量生理盐水灌胃.裂隙灯观察角膜新生血管、角膜水肿、上皮缺损愈合及眼前段情况,分别于3、7、14、21、28、35 d裂隙灯照相并计算新生血管面积及新生血管抑制率.[结果]两组大鼠伤后第1天角膜缘血管网扩张充血,3d时血管开始侵入角膜,7～14 d时新生血管达到高峰,14～21 d后新生血管逐渐回退;两组角膜新生血管长度、新生血管面积及角膜水肿程度存在差异P<0.05);各时间点角膜新生血管抑制率为35.8%～53.3%,随时间推移呈上升趋势.[结论]强力霉素能有效地抑制眼化学伤诱导的角膜新生血管形成.     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白基因在减毒伤寒杆菌诱导株中的表达

目的 用含ＰＬｔｅｔＯ启动子的ｐＺＥ１１质粒在减毒伤寒杆菌ＣＶＤ９０８疫苗株中表达恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白。方法 将克隆有恶性疟原虫裂殖子表面蛋白Ｃ末端基因（ＭＳＰ１－４２）的重组ｐＺＥ１１质粒用电穿孔转化法转化入减毒伤寒杆菌ＣＶＤ９０８／ｔｅｔＲ疫苗株中,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹反应和免疫荧光反应检测ＭＳＰ１－４２在ＣＶＤ９０８／ｔｅｔＲ株中的体内外四环素诱导表达。结果 构建了ＣＶＤ０８     

乙型肝炎病毒S基因四环素调控体系的构建及其在真核细胞中的表达

目的:构建乙型肝炎病毒S基因的四环素调控表达载体,并研究在真核细胞中四环素对S基因的调控表达,以期用于基因治疗实验.方法:将乙型肝炎病毒S基因插入启动子内含有2个四环素超纵子(TO)的质粒pcDNA4,并用脂质体将重组质粒pcDNA4-S和含有四环素抑制基因的质粒pcDNA6共转染入真核细胞HepG2中,用Zeocin(400μg/ml)及Blasticidin(10μg/ml)进行抗性筛选,约20天形成抗性克隆,建立在四环素诱导下能稳定表达S基因的细胞系.以不同浓度的四环素(0.5μg/ml,1.0μg/ml,2.0μg/ml,3.0μg/ml)进行诱导,用微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测S抗原的表达,以确定四环素的最佳浓度.结果:转染了重组质粒的HepG2细胞,在无四环素环境下HBsAg表达量很低,当加入不同浓度的四环素诱导后,HBsAg表达量明显增加,但所测HBsAg的S/N值无明显差异.结论:成功构建了乙型肝炎病毒S基因四环素调控表达载体,并在真核细胞中进行了四环素的调控表达.