基于报告基因的抗CD3×GPRC5D双特异性抗体生物学活性测定方法建立

目的:建立抗CD3×GPRC5D双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)生物学活性的报告基因测定方法。方法:构建Jurkat/NFAT-Luc转基因细胞株作为效应细胞,MM.1R细胞系作为靶细胞,建立和优化抗CD3×GPRC5D双特异性抗体生物学活性检测方法并进行方法学验证。分别用优化后的报告基因法和PBMC杀伤试验评价不同类型的抗CD3×GPRC5D双特异性抗体生物学活性。结果:报告基因法优化后确定靶细胞为MM.1R细胞,细胞铺板密度为2×10⁴个·孔^-1,效靶比1∶1,抗体起始浓度为20μg·mL^-1,2倍稀释1次后,再6倍梯度稀释,共10个浓度点,诱导时间6 h。方法验证结果说明该方法具有良好的专属性,制备50%,75%,100%,150%和200%理论效价样品,进行准确性、精密度和线性验证,结果显示生物学活性回收率在97.85%～106.51%,变异系数均<10%;相对效价理论值与实测值直线回归分析相关系数为0.997 8。同时,该方法适用于各类抗CD3×GPRC5D双特异性抗体,...     

重组人白介素-1α生物学活性测定方法的建立

目的 建立并优化采用D10.G4.1细胞测定重组人白介素-1α(rhIL-1α)生物学活性的方法,并用于rhIL-1α样品的检测.方法 MTT法测定rhIL-1α促进D10.G4.1细胞增殖能力,从而反映rhIL-1α的生物学活性.结果 建立了D10.G4.1细胞增殖法测定rhIL-1d生物学活性的方法.优化后实验条件如下,样品稀释培养基:RPMI1640+10％ FBS+0.5％T-STIM with ConA +0.05mM2-巯基乙醇;样品上板浓度:10ng ·mL-1;细胞密度:4×105个/mL;培养时间:72h;样品梯度稀释倍数4倍.利用优化后的实验条件对rhIL-1α样品活性进行3次测定,评价方法的可重复性.结果 3次实验的变异系数为5.7％,符合方法的要求,表明方法重复性好.结论 建立了D10.G4.1细胞测定rhIL-1α生物学活性的方法,该方法操作简便,重复性好,可应用于rhIL-1α的生物学活性检测.     

A型肉毒抗毒素ELISA方法的建立及验证

目的:建立定量检测A型肉毒抗毒素效价的酶联免疫吸附法(ELISA法),并进行验证。方法:以A型肉毒类毒素为包被抗原包被酶标板，封闭后加入稀释的血清样品，以辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG(IgG-HRP)作为酶标抗体，加入四甲基联苯胺显色剂(TMB)显色10～15 min, 2 mol·L^-1硫酸终止反应，于酶标仪上读取A_{450 nm}值，以标准曲线样品浓度的对数(X)为横坐标，A_{450 nm}值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，将待测血清样品A_{450 nm}值代入曲线方程即可得到血清样品浓度，乘以稀释倍数即为血清样品效价。结果:在优化的条件下，该方法具有较高的特异性，除了与A型肉毒抗毒素血清反应外，对B、C、D、E、F型肉毒抗毒素血清均无交叉反应；在线性范围50～400 mIU·mL^-1时线性关系良好，r>0.990 0;准确度介于80%～120%;精密度(重复性和中间精密度)RSD<20%;采用该方法测定20批A型肉毒抗毒素血清的效价范围在525～2 450 IU·mL     

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16～20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R~2大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10~5个·mL^-1,rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^-1,1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.0...     

重组人源中期因子生物活性测定方法的建立与验证

建立和优化重组人源中期因子(recombinant human midkine, rhMK)活性检测方法,并对其方法进行验证。本文采用细胞计数试剂盒-8 (cell counting kit-8, cck-8)法检测rhMK作用大鼠膝软骨细胞的促增殖活性,并对方法进行专属性、准确性、精密性、线性、耐用性验证。RhMK的缓冲液及重组人源白介素-1受体拮抗剂无明显活性效力,该方法专属性良好;相对活性为50%、75%、100%、125%、150%的样品效价回收率(n=6)统计在80.0%～124.0%之间,各相对效价的相对标准偏差均在20%以内,线性相关系数R²≥0.98,表明方法的准确性、精密性、线性均良好;耐用性相关系数R²≥0.92,量效曲线的最大值与最小值的比值≥1.5,方法的耐用性良好。研究建立的rhMK的生物学活性检测方法,其方法验证良好,为rhMK开发过程中常规样品的生物学活性分析提供了可靠的检测方法。本研究已获得上海南方模式生物科技股份有限公司动物看护与使用委员会批准(批准号:2019-0008-06)。     

近效期末抗PD-1单克隆抗体药物使用过程中稳定性研究

目的：评价近效期末抗程序性死亡受体1(Programmed Cell Death Protein Ligand 1,PD-1)单克隆抗体药物的使用中稳定性。方法：模拟临床实际使用条件将近效期末抗PD-1单抗药物稀释至1.0mg·mL^-1和5.0 mg·mL^-1,制备使用中稳定性样品,并对不同取样点下样品的外观、可见异物、不溶性微粒、蛋白质浓度、纯度、配体竞争抑制活性、生物学活性进行分析和比较。结果：1.0 mg·mL^-1和5.0mg·mL^-1 2个浓度点在不同时间取样点样品均为无色澄清溶液且无明显可见异物,不溶性微粒符合要求;蛋白质浓度分别为0.9 mg·mL^-1和4.3～4.5 mg·mL^-1;SEC-HPLC单体的峰面积百分比均为99.3%,聚体峰面积百分比为0.7%～0.8%;配体竞争抑制活性为95%～110%,生物学活性为74%～89%。结论：研究表明近效期末抗PD-1单抗药物使用中稳定性良好。     

时间分辨荧光免疫分析法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用时间分辨荧光免疫分析系统建立人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法。方法:以CHO-INSRB1284转基因细胞2.5×10~5个·mL^-1作为靶细胞,以400 pmol·mL^-1作为初始浓度对人胰岛素进行3倍系列稀释,随后药物与靶细胞作用20 min,通过时间分辨荧光免疫分析系统,进行生物学活性检测,对该方法进行关键参数的优化,并依据2020年版《中华人民共和国药典》四部通则9401和ICH指导原则Q2(R1)、Q6B进行验证。结果:人胰岛素在本方法中存在良好的量效关系,符合四参数方程：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。本方法专属性强,5个效价水平(64%、80%、100%、125%及156%)的相对生物学活性(n=8)的几何平均值分别为(55.8±2.06)%、(82.1±5.52)%、(94.4±5.46)%、(121.4±5.94)%、(154.4±8.37)%,相对偏倚及其90%置信区间分别为-12.8%(-16.3%,-9.9%)、2.6%(-4.4%,9.5%)、-5.6%(-11.2%,-0.3%)、-2...     

基于报告基因的抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立

利用Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa转基因细胞系作为效应细胞,WIL2-S细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(Bio GloTM Luciferase Assay System)进行抗CD20单抗的ADCC生物学活性检测,并对实验条件进行优化及方法学验证。结果显示抗CD20单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。方法经优化确定靶细胞为WIL2-S细胞,抗体稀释浓度为18 000 ng·m L-1,1∶5倍的稀释倍数,效靶比为6∶1,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性,8次独立实验的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验;4个不同稀释组回收率样本经3次测定,相对效价分别为(44.39±3.93)%、(72.74±2.78)%、(128.28±7.01)%和(168.19±2.70)%,变异系数均小于10%,对应回收率分别为(88.78±7.85)%、(96.99±3.70)%、(102.63±5.61)%和(112.12±1.80)%。本研究利用转基因细胞法成功建立抗CD20单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。     

基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例方法的建立

目的：建立基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例分析方法并进行方法学验证。方法：对硼酸亲和色谱做方法优化和方法学验证,通过对流动相的盐组成、NaCl和Tris浓度的优化,建立能够有效定量单抗糖化比例的BAC分析方法,并对该方法进行方法学验证和应用评价。结果：NaCl和Tris浓度的变化会影响单抗糖化比例的检测,通过参数优化,最终确定在NaCl和Tris浓度分别为300 mmol·L^-1和25 mmol·L^-1时,可以对单抗糖化比例进行准确定量。根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》2020年版对建立的方法进行了方法学验证,结果表明该方法具有良好的特异性、准确性、精密度和耐用性。单抗糖化比例在2%～90%有良好的线性,R²大于0.99,回收率在87.04%～115.29%;非糖化比例在10%～98%具有良好线性,R²大于0.99,回收率在99.69%～109.79%。精密度结果表明,该方法整体的RSD值小于18.26%。最后,利用建立的方法对利妥昔单抗原研药和生物类似药进行了糖化比例检测,发现同...     

UPLC-MS/MS测定人血浆中长春西汀和阿朴长春胺酸的含量及其应用

目的 建立和验证UPLC-MS/MS测定人血浆中长春西汀和阿朴长春胺酸的方法，并用于临床样品检测。方法 以长春西汀-d5、阿朴长春胺酸-d4为内标，人血浆样品经蛋白沉淀法沉淀处理，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC^?BEH C₁₈(2.1 mm×50 mm,1.7μm)，流动相为乙腈-水(含0.05%甲酸)，梯度洗脱，流速0.35 mL·min^-1；电喷雾离子化源正离子监测模式。结果 长春西汀和阿朴长春胺酸线性范围分别为0.04～20.0 ng·mL^-1(r=0.999 7)、0.50～250 ng·mL^-1(r=0.999 6)，检测限分别为0.01,0.10 ng·mL^-1，待测物与内标提取回收率均为94.81%～105.0%，基质效应为94.51%～105.0%,RSD均<5%；批内、批间精密度RSD均<10%。结论 本法特异性强、快速、准确，重复性好，适用于长春西汀临床生物样品检测及生物等效性研究。     

流式细胞术测定食蟹猴血清中抗间充质干细胞抗药抗体及其应用

目的 建立一种准确、快速且灵敏度高的流式细胞法检测食蟹猴血清中抗间充质干细胞抗药抗体。方法 取间充质干细胞悬液,离心、洗涤后,加入阳性质控样品溶液或待测样品溶液与间充质干细胞孵育后,加入荧光标记的Protein L-PE溶液进行孵育,洗掉未结合的Protein L-PE,流式方法检测PE平均荧光强度。结果 该方法灵敏度为115.54 ng·mL^-1,远高于非临床研究要求的250～500 ng·mL^-1。批内和批间的精密度<20%,其他方法验证考察项结果均符合相关接受标准。结论 该方法灵敏度高,特异性强,样品操作简单,可用于快速检测食蟹猴血清中抗间充质干细胞的抗体,适用于间充质干细胞在食蟹猴体内的免疫原性研究。     

ELISA法测定大鼠血浆中抗体偶联药物浓度及药代动力学研究

目的:建立检测大鼠血浆中抗体偶联药物(ADC006M)[重组抗人表皮生长因子受体2(HER2)结构域Ⅱ人源化单克隆抗体-单甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶联剂]浓度的酶联免疫吸附分析法(ELISA),并用于研究单次静脉注射的药代动力学特征。方法:基于ELISA的检测原理，在96孔板上预先包被抗MMAE抗体，加入待测样品，用HRP标记的抗体B1G7(B1G7-HRP)进行检测，加入TMB底物显色，终止反应后，在酶标仪450 nm/630 nm波长处读取吸收度(A),并参考相关法规进行方法学验证。同时，单次静脉注射给予SD大鼠5 mg·kg^-1ADC006M测定其血浆浓度，对测定结果进行曲线拟合并计算药代动力学参数。结果:确定方法的线性范围为31.25～2 000 ng·mL^-1,定量限为31.25 ng·mL^-1;方法批内、批间准确度RE分别在-14.6%～12.6%和-13.1%～-0.7%,批内、批间精密度RSD均≤12.6%;方法的选择性(基质效应)、特异性、稀释线性与钩状效应以及各项稳定性考察结果均良好。通过对SD大鼠...     

动态浊度法测定人参多糖注射液中细菌内毒素的含量

目的建立测定人参多糖注射液中细菌内毒素含量的方法。方法建立动态浊度法测定细菌内毒素标准曲线,通过测定供试液中外加内毒素的回收率进行干扰试验,确定样品检测浓度线性范围,并定量测定样品中的细菌内毒素。结果内毒素检测浓度线性范围为0.031 25².0 EU·mL-1(r=-0.998 9);样品在稀释36倍及以下时,对试验无干扰作用,细菌内毒素回收率在50%2.0 EU·mL-1(r=-0.998 9);样品在稀释36倍及以下时,对试验无干扰作用,细菌内毒素回收率在50%²00%范围内,样品中的内毒素含量可定量测定。结论动态浊度法可用于人参多糖注射液中细菌内毒素的定量检测。     

基于细胞代谢组学的柴胡皂苷b2对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用研究

目的 研究柴胡皂苷b2(SSb2)对皮质酮(CORT)诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法 (1)将细胞分为细胞对照组(RPMI-1640培养基培养24 h),CORT(100～800μmol·L^-1孵育24 h)组和SSb2(1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50和100μmol·L^-1孵育24 h)组,MTT法检测细胞存活率。(2)将细胞分为细胞对照组(RPMI-1640培养基培养24 h),模型组(CORT 400μmol·L^-1孵育24 h)和模型+SSb2组(SSb2 1.5625,3.125,6.25,12.5和25μmol·L^-1预处理3 h,去上清,然后加入CORT 400μmol·L^-1及对应浓度SSb2共孵育24 h)。MTT法检测细胞存活率,微板法检测PC12细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率。(3)将细胞分为细胞对照组、模型组和模型+SSb2 12.5μmol·L^-1组,采用AnnexinV-FITC/PI流式...     

紫背万年青调控非小细胞肺癌A549细胞凋亡活性成分筛选和含量测定标准研究

目的 对紫背万年青中的化学成分进行非小细胞肺癌A549细胞凋亡活性测定,并以筛选出的活性成分为指标建立含量测定方法,用以评价该植物的功效。方法 将A549细胞和不同浓度的紫草素、木犀草素、补骨脂素(8、16、32μg·mL^-1)孵育后,使用Western-Blot法检测caspase-3蛋白表达,对所得结果进行统计分析,研究各成分对A549细胞凋亡的调控活性;选择紫草素为含量测定指标,使用Agilent TC C₁₈(柱长25 cm,内径0.46 cm,填料直径5μm)色谱柱,乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相,梯度洗脱,程序为0～10 min, 20%～20%A;10～20 min, 20%～80%A;20～30 min, 80%～20%A;30～35 min, 20%～20%A;流速1.0 mL·min^-1,检测波长274 nm,柱温25℃,进样量10μL;测定10批紫背万年青样品中补骨脂素的含量。结果 3个待测成分中,补骨脂素对caspase-3蛋白表达存在明显的调控效果,提示该成分具有较强的促进A549细胞凋...     

ELISA法测定小鼠血清中流脑抗体效价

目的采用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)测定流脑疫苗效价,同时为提高效价测定的准确度,选定包被抗原最佳工作浓度及待测血清最佳稀释比,为疫苗效价测定提供科学依据。方法分别以不同浓度C群多糖抗原液为包被抗原,以稀释过的免疫小鼠血清为待测抗体,采用ELISA间接测定法测定抗体效价,寻求包被抗原最佳工作浓度;然后包被抗原在其最佳工作浓度下包被酶标板,以不同稀释比的免疫小鼠血清为待测抗体,测定血清中抗体效价,寻求待测血清最佳稀释比;最后在包被抗原最佳工作浓度及待测血清最佳稀释比下,测定小鼠血清中流脑抗体的效价。同时检测该方法的特异性、稳定性和重复性。结果 ELISA测定流脑疫苗效价的包被抗原最佳工作浓度及待测血清最佳稀释比分别为160μg/mL和1∶4,同时该浓度下测定的免疫小鼠血清中流脑疫苗抗体效价为(1.274±0.003),阳转率为100%。说明该批疫苗产品合格(判定标准:阳转率≥90%)。批内批间变异系数均<7%,表明该测定技术具有良好的稳定性和重复性。结论建立了一种灵敏、特异、简便易行的ELISA法检测流脑疫苗效价,为流脑的预防、控制和诊断提供了一种技术手段。     

胡柚提取物抑制硝苯地平肝微粒体酶代谢的研究

目的:探讨胡柚不同部位提取物对体外小鼠肝微粒体酶代谢活性的抑制效应。方法:在小鼠肝微粒体孵育体系中加入硝苯地平和胡柚不同部位的提取物后,应用HPLC法测定体系中硝苯地平的剩余含量。结果:硝苯地平的标准曲线方程为Y=2.136×10⁴X+2.334×10⁴（r=0.999 3）,线性范围:0.15～240 mg·L^-1。含有相同浓度硝苯地平及3种胡柚提取物的小鼠肝微粒体孵育体系中,柚汁、果肉、柚皮中剩余硝苯地平浓度分别为8.802,7.497,4.227mg·L^-1。结论:胡柚不同部位提取物对小鼠肝微粒体酶活性有抑制作用,尤其是柚汁和果肉部分活性较强。     

猪苓多糖联合硼替佐米促进多发性骨髓瘤U266细胞的凋亡和自噬

目的研究猪苓多糖(PPS)联合硼替佐米(BTZ)对人多发性骨髓瘤U266细胞的影响。方法 (1)PPS 12.5～400μmol·L^-1或BTZ 10～80 nmo·L^-1处理U266细胞48 h,PPS 50μmol·L^-1+BTZ 10～80 nmol·L^-1处理U266细胞48 h,CCK-8法检测细胞存活率。PPS 12.5～50μmo·L^-1+BTZ 10～80 nmol·L^-1处理U266细胞48 h,Calcusyn软件分析计算联合用药指数(CI),并确定联合用药的浓度。(2) U266细胞分为细胞对照组、PPS 20μmol·L^-1组、BTZ 25 nmol·L^-1组和PPS 20μmol·L^-1+BTZ 25 nmol·L^-1组,孵育48 h。流式细胞术检测细胞凋亡率,Western印迹法检测细胞Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶3、自噬...     

奈比洛尔对血管内皮细胞胰岛素抵抗的影响

目的 观察奈比洛尔改善人主动脉内皮细胞(HAEC)胰岛素抵抗(IR)的作用及机制。方法 HAEC分为空白组(正常培养,胰岛素不刺激),对照组(正常培养,胰岛素刺激),不同浓度奈比洛尔+对照组(对照组基础上加奈比洛尔0.1,1,10μmol·L^-1),IR组(高糖33.3 mmol·L^-1+胰岛素1×10^-7 mol·L^-1),不同浓度奈比洛尔+IR组(IR基础上加奈比洛尔0.1,1,10μmol·L^-1)。48 h后,细胞无血清饥饿处理12 h。以噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,以葡萄糖氧化酶法测HAEC葡萄糖消耗量,以硝基还原酶法检测上清液一氧化氮(NO)水平,以蛋白质印迹法测定蛋白表达。结果 与对照组(100%)比较,IR组细胞活性无显著性改变(95.13±2.10)%,且不同浓度奈比洛尔(0.1、1、10μmol·L^-1)预处理对IR组和对照组细胞活性均无显著性影响。IR组的细胞葡萄糖消耗量和上清液NO水平分别为(0.53±0.17) mmol·L<...     

淫羊藿苷通过抑制Nod样受体家族蛋白3炎症小体相关蛋白表达抑制BV2小胶质细胞炎症反应

目的 研究淫羊藿苷(ICA)靶向Nod样受体家族蛋白3(NLRP3)炎症小体抑制BV2小胶质细胞炎症反应的作用机制。方法 用细菌脂多糖(LPS)+干扰素γ(IFN-γ)诱导小鼠BV2小胶质细胞,构建拟神经炎症反应的小胶质细胞模型。BV2细胞用DMEM高糖培养基培养,分为细胞对照组、ICA 10μmol·L^-1组、模型组及模型+ICA 5,10和20μmol·L^-1组。细胞对照和模型组加入DMEM高糖培养基培,ICA组加入ICA 10μmol·L^-1,模型+ICA组分别加入相应浓度的ICA,孵育24 h;随后模型和模型+ICA组加入LPS100μg·L^-1和IFN-γ 20μg·L^-1,细胞对照和ICA组用等体积培养基代替,孵育18 h;最后模型+ICA组加入相应浓度的ICA,其他各组加入等体积培养基,继续孵育24 h。用Luminex法检测细胞上清中白细胞介素3(IL-3)、IL-5、IL-17和单核/巨噬细胞趋化因子11(CCL11)含量;用细胞免疫荧光染色法检测CD16/C...