荧光定量PCR与RT-PCR技术检测HCV-RNA的比较观察

目的 比较荧光定量ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ（定性）检测不同检材中的ＨＣＶ－ＲＮＡ,评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值。方法 采用荧光定量ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ（定性）技术同时检测了７１例血液透析患者的血清,血浆,淋巴细胞、尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果 血清、淋巴细胞,尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４６．３８％,８０．００％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－Ｐ     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA

利用与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组５＇非编码区保守序列同源的套式引物，建立了检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，由于在引物设计中选择了最保守的区域且避开了与黄病毒属的同源序列，保证了ＰＣＲ检测的灵敏度和特异性。经逆转录和两轮ＰＣＲ扩增，可检出１×１０－３ｕｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。研究了影响ＨＣＶＲＮＡＰＣＲ检测的各种因素，并对ＲＮＡ分离及ＲＴ－ＰＣＲ反应体系进行了优化，在此基础上研制了ＨＣＶ的ＰＣＲ检测试剂盒。     

丙型肝炎病毒RNA非结构区套式聚合酶链反应

目的探讨不同引物对ＨＣＶＲＮＡ检出率的影响，立敏感的ＮＳ５区基因扩增技术。方法选择不同引物，采用非结构５（ＮＳ５）区套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）及联合式［ＨＣ非编码区（５′ＮＣＲ）与ＮＳ５联合］ＰＣＲ技术检测１０例抗ＨＣＶ阳性献血员及３７例输血后丙型肝患者的血清ＨＣＶＲＮＡ。结果１０例抗ＨＣＶ阳性献血员应用联合式ＰＣＲ，以ＮＳ５－３＋ＮＳ５－４、ＳＦ２＋ＮＳ５－４、Ｋ１＋ＮＳ５－４、ＮＳ５－１＋ＮＳ５－４引物及套式ＮＳ５－１＋ＮＳ５－４引物扩增时，其ＲＮＡ检出率分别为５／１０、６／１０、７／１０、８／１０和９／１０；而３７例输血后丙型肝炎患者中３５例ＲＮＡ阳性，检出率为９５％，其中１８例１ｂ型和１９例２ａ型样品的检出率分别为１００％和８９％。结论ＨＣＶＮＳ５区的ＲＮＡ检出率与引物的选择有关     

HCV感染基因型病毒复制程度与肝病关系的研究

采用限制性内切酶Ｓａｕ３Ａｌ和ＨａｅⅢ对５４例ＲＴ－ＰＣＲ法ＨＣＶＲＮＡ阳性的５＇ＮＣ区扩增产物进行酶切分型；ＰＣＲ滴定法半定量分析ＨＣＶＲＮＡ含量。结果显示４种酶切类型：ＨＣＶⅠ型感染３．７％（２／５４），ＨＣＶⅡ型感染７７．８％（４２／５４），ＨＣＶⅢ、Ⅳ型感染１１．１％（６／５４），ＨＣＶⅠ、Ⅱ／Ⅲ、Ⅳ型混合感染７．４％（４／５４），ＨＣＶⅡ型感染阳性率在ＡＨ、ＣＡＨ、ＬＣ三组间无显著差异（     

丙型肝炎病毒RNA非结构区套式聚合酶链反应

目的探讨不同引物对ＨＣＶＲＮＡ检出率的影响，建立敏感的ＮＳ５区基因扩增技术。方法选择不同引物，采用非结构５（ＮＳ５）区套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）及联合式「ＨＣＶ非编码区（５ＮＣＲ）与ＮＳ５联合」技术检测１０例抗ＨＣＶ阳性献赠及３７例输血后丙型肝炎患 血清ＨＣＸＶＲＮＡ。结果 １０例抗ＨＣＶ阳性一献血员应用联合式ＰＣＲ，以ＮＳ５－３＋ＮＳ５－４、ＳＦ２＋ＮＳ５－４、Ｋ１＋ＮＳ５－４、ＮＳ５－１＋ＮＳ     

丙型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增

目的探讨提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）病毒血症的检出率和对变异较大区域的扩增效率的方法。方法分别以ＨＣＶ基因组５＇端非编码区（５＇ＵＴＲ）、非结构基因４区（ＮＳ４）及ＮＳ５ｂ区的引物检测ＨＣＶ，并比较双退火温度与单一退火温度对ＨＣＶ基因扩增效率的影响。结果ＨＣＶ不同基因区（５′ＵＴＲ、ＮＳ４、ＮＳ５ｂ）引物的ＰＣＲ扩增阳性率分别为９２％、６２％、５９％。以双退火温度扩增ＮＳ４区与ＮＳ５ｂ区基因，扩增阳性率分别提高到７７％与７９％。将血清按原血清、１０－１～１０－１０系列稀释后检测，发现２份血清单退火温度ＰＣＲ的检出水平分别为１０－５与１０－７，双退火温度ＰＣＲ检出水平则分别提高至１０－８与１０－９稀释血清。结论５′ＵＴＲ引物对ＨＣＶＲＮＡ的检出率明显高于ＮＳ４区与ＮＳ５ｂ区引物。双退火温度ＰＣＲ可显著提高ＨＣＶＲＮＡ检出的敏感性     

血透患者检测抗HCV IgM的临床意义

为探讨丙型肝炎ＩｇＭ抗体测定在血液透析患者中的临床意义,采秀间接ＥＬＩＳＡ法检测抗ＨＣＶ ＩｇＭ。同时采用ＥＬＩＳＡ测抗ＨＣＶ ＩｇＧ,ＲＴ－ＰＣＲ法测ＨＣＶ ＲＮＡ,并进行比较。结果示６２例血液透析病人中,抗ＨＣＶ ＩｇＭ阳性２７例（４３．６％）,抗ＨＣＶ ＩｇＧ阳性２９例（４６．８％）,ＨＣＶ ＲＮＡ阳性３４例（５４．８％）,任一项阳性３７例（５９．７％）;抗ＨＣＶ ＩｇＭ与ＨＣＶ ＲＮＡ检测     

TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５’端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％。凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录。套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率达９３．３％（１４／１５）。ＴｔｈＤＮＡ聚合酶用于ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ５’端非编码序列片段具有敏感性高、特异性强、稳定性好的优点。     

逆转录聚合酶链反应检测脑脊液中肠道病毒RNA

肠道病毒 (ＥＶ)可引起各年龄组感染 ,其中ＥＶ性脑膜炎、脑炎和心肌炎是较严重的感染。因其ＥＶ血清型繁多 ,病原学诊断困难[1] 。本文探讨一种适于临床检测ＥＶＲＮＡ的逆转录聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)方法。1　材料和方法1 1　ＥＶ病毒和脑脊液标本的制备及ＥＶＲＮＡ的提取参考文献[2 ] 。1 2　临床标本　收集 1996年 7月至 10月临床诊断为无菌性脑膜炎和脑炎患儿急性期 (出现症状 <5天 )和恢复期(症状、体征消失 )脑脊液 2ｍｌ,分装后 - 30℃存放。所有脑脊液标本均做细菌培养及常规检查。阳性对照为每毫升脑脊液加 10 0ＴＣＩＤ50 …     

小儿肠道病毒中枢神经系统感染的临床特点

目的探讨小儿肠道病毒（EV）中枢神经系统感染的临床特点。方法采用逆转录聚合酶链反应和病毒基因序列分析方法,对87例无菌性中枢神经系统感染病儿的脑脊液标本进行检测,并对其中61例EV中枢神经系统感染病儿的临床特点和预后进行回顾分析。结果无菌性中枢神经系统感染病儿中EV感染的发生率是70.10%,其中脑膜炎40例（65.57%）,脑炎21例（34.43%）。21例脑炎病儿的脑脊液标本经分型引物检测,17例（80.95%）阳性,其中埃柯病毒12型9例,柯萨奇病毒B3型5例,埃柯病毒7型1例,柯萨奇病毒B5型1例,柯萨奇病毒A9型1例。61例EV中枢神经系统感染均为急性起病,5—10月份高发（85.25%）,发病年龄高峰在3~5岁（44.26%）。EV脑膜炎的主要特征是脑膜刺激症状和脑脊液细胞数增加,主要临床表现为发热、头痛、呕吐,较大儿童可诉有乏力、畏光、肌痛,婴幼儿常伴有腹泻和皮疹。EV脑炎根据主要症状临床分型为昏迷型（3/21）、癫痫型（3/21）、精神障碍型（1/21）、小脑炎型（1/21）、脑干脑炎型（2/21）和混合型（11/21）。常规治疗后脑膜炎和大部分脑炎病儿完全恢复。4例重型柯萨奇病毒B3型脑炎病儿GLASGOW昏迷评分均〈7分,其中1例完全康复;1例运动障碍,经1年康复治疗后生活自理;1例癫痫、1例精神障碍伴癫痫,均可被药物完全控制。结论 EV是小儿中枢神经系统感染最常见的病原体之一;脑膜炎临床症状一般较轻,预后良好;大部分脑炎症状较轻,预后良好,重症脑炎可留有程度不同的后遗症。     

感染中枢神经系统肠道病毒的分子生物学分型

目的探讨小儿肠道病毒（EV）中枢神经系统感染病毒基因VP1序列的分子分型的临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法．应用通用引物和VP1段分子分型引物检测77例临床诊断为无菌性脑膜炎病儿（其中急性期63例．恢复期14例）脑脊液（CSF）的EVRNA，并对VP1分型引物扩增阳性片段进行克隆、测序及分型研究。结果77例无菌性脑膜炎病儿CSF中，采用通用引物经两次PCR在急性期共获得阳性结果47例（占急性期的74．6％），恢复期3例（占恢复期的21．4％）。将EVRNA阳性的50例标本应用分型引物经两次PCR共获得阳性结果31例（占62．0％）。随机抽取27条阳性片段进行克隆测序，测序结果通过BLAST软件与GenBankEV标准毒株进行同源性对比分析，相关序列同源性均在97％以上。结论采用分型引物扩增VP1部分序列并测序．将EV的VP1部分序列与GenBank中的EV标准毒株进行对比，根据基因序列的同源性可以对EV进行型别鉴定．为EV的分型研究提供了新的方法和思路。     

新生儿病房进行肠道病毒筛查的意义

目的 探讨新生儿病房患儿入院时即进行肠道病毒筛查的意义.方法 在2009年5月～2010年5月对每位新人患儿首先进行隔离,然后进行咽拭子及粪便采样,采样用RT-PCR方法检测肠道病毒通用型、肠道病毒71型、柯萨奇A16型.对采样检测阳性的个体及密切接触人群进行系统的流行病学研究.结果 新生儿存在肠道病毒宫内感染、产时感染和生后感染几种方式,感染率分别为2.72%、6.28%、15.76%.结论 预防新生儿肠道病毒感染在院前及院内同样重要.     

新生儿病房进行肠道病毒筛查的意义

目的 探讨新生儿病房患儿入院时即进行肠道病毒筛查的意义.方法 在2009年5月～2010年5月对每位新人患儿首先进行隔离,然后进行咽拭子及粪便采样,采样用RT-PCR方法检测肠道病毒通用型、肠道病毒71型、柯萨奇A16型.对采样检测阳性的个体及密切接触人群进行系统的流行病学研究.结果 新生儿存在肠道病毒宫内感染、产时感染和生后感染几种方式,感染率分别为2.72%、6.28%、15.76%.结论 预防新生儿肠道病毒感染在院前及院内同样重要.     

肠道病毒中枢神经系统感染病儿免疫功能紊乱与神经元损害的相关性

目的通过检测肠道病毒（EV）中枢神经系统感染病儿脑脊液中白细胞介素-10（IL-10）、γ-干扰素（IFN-γ）及神经元特异性烯醇化酶（NSE）的水平,探讨EV引起病儿免疫功能紊乱的机制。方法收集2008年1月—2009年1月青岛大学医学院附属医院和滨州医学院附属医院临床诊断为无菌性脑膜炎、脑炎病儿的急性期脑脊液标本100例。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,检测标本中的EV RNA;应用双抗体夹心ELISA法检测EV感染组和对照组脑脊液中IL-10、IFN-γ及NSE的表达水平。结果 100例急性期病儿脑脊液中,经RT-PCR和二次PCR共获得阳性结果78例（78.0%）;EV感染组IFN-γ的表达水平高于对照组（t=4.24,P〈0.01）,重症组高于轻症组（t=4.13,P〈0.01）;IL-10表达水平低于对照组（t=7.89,P〈0.01）,重症组低于轻症组（t=2.97,P〈0.01）;NSE表达水平高于对照组（t=7.02,P〈0.01）,重症组高于轻症组（t=2.79,P〈0.01）。EV感染组NSE与IFN-γ水平呈正相关（r=0.673,P〈0.05）,与IL-10水平呈负相关（r=-0.587,P〈0.05）。结论 IL-10和IFN-γ参与EV对中枢神经系统免疫损害的过程,并与神经元的损害程度密切相关。     

The diagnostic value of PCR for the detection of enteroviral infections

The applicability of the polymerase chain reaction (PCR) for the diagnosis of enteroviral infections is evaluated in this study. A general primer-mediated enterovirus specific PCR was used for the detection of enteroviral RNA in cerebrospinal fluid (CSF) samples from six patients with meningitis, 56 biopsy specimens from 16 patients with congestive heart failure, and two patients with a systemic enteroviral infection. Samples from three patients with meningitis were found positive and in each of eight patients with heart disease, enteroviral RNA was detected in at least one biopsy specimen. From both patients with a systemic enteroviral infection several different organs and tissues were found positive. After reviewing the literature, we concluded that the PCR might become a useful tool for the diagnosis of persistent enteroviral infections and enteroviral-induced meningitis, but that the applicability of PCR for the routine diagnosis of acute enteroviral infections is questionable.     

湖北省宜昌市2013年急性脑炎/脑膜炎症候群监测结果分析?

目的：了解湖北省宜昌市急性脑炎/脑膜炎的流行病学和病原学特征,分析病原谱构成。方法在湖北省宜昌地区开展急性脑炎/脑膜炎病例哨点监测,对纳入的监测病例开展流行病学调查,对血清和脑脊液标本开展实验室检测。结果总共监测病例299例,监测病例以大于45岁年龄组患者居多,夏季为高发季节。实验室检测确诊的病毒性病原构成比居前两位的为腮腺炎病毒(55.17%)和肠道病毒(32.76%);细菌性病原构成以流感嗜血杆菌检出率最高(42.86%),其次为肺炎链球菌(35.71%)。急性脑炎/脑膜炎实验室确诊病例与临床诊断病例符合率较低,临床上存在很大程度的误诊。结论急性脑炎/脑膜炎防控应集中在夏季,高年龄组是脑炎/脑膜炎的高危人群,开展脑炎/脑膜炎的早期病原学检测,可明确诊断、提高治愈率、减少并发症。