蓖麻毒素及其A、B链的提取分离纯化的研究

本文研究蓖麻毒素及其A、B链的提取、分离、纯化,根据B链能与Sepharose-6 B上的半乳糖结合,而A链不具有这一性质,用β-巯基乙醇使蓖麻毒素直接在Sepharose-6B柱上断链,然后分别用Tris-HCl和Tris-HCl-半乳糖溶液洗脱,首次把蓖麻毒素的制备、纯化以及A、B链的断链、分离结合起来,大大简化了工艺。     

蓖麻毒素A链与底物作用的结构基础及其解毒剂的研究进展

蓖麻毒素是从植物蓖麻籽中分离得到的一种Ⅱ型核糖体失活蛋白,其A链（RTA）为效应链,具有N-糖苷酶活性,通过催化28S rRNA在S/R结构域第4 324位脱去一个保守的腺嘌呤,使核糖体60S亚基失活,从而阻断蛋白质合成途径,引起细胞死亡。RTA因其高细胞毒性,常常用于制备免疫毒素药物,尤其在恶性肿瘤的生物治疗上具有诱人的应用前景;或可能被用作恐怖袭击的生物战剂。本文对RTA与底物相互作用的结构信息及其解毒剂进行综述。     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.     

蓖麻毒素在细胞内的运输和转运途径研究进展

蓖麻毒素是一种典型的天然毒蛋白，其A链(RTA)可催化失活核糖体大亚基，故能抑制细胞的蛋白质合成，而导致细胞死亡。近年来，蓖麻毒素已被用来合成肿瘤导向药物——免疫毒素，但有关毒蛋白进入细胞的途径仍不甚清楚。研究RTA在细胞内的转运机理可以揭示毒蛋白运输的普遍规律。对蓖麻毒素的结构和细胞内的转运途径及其临床应用作一综述。     

聚合物修饰的蓖麻毒蛋白A链在荷瘤大鼠体内分布的研究

目的 研究两种不同相对分子质量的单甲氧聚乙二醇(monomethoxy polyethylene glycol,mPEG)与蓖麻毒蛋白A链(ricin A chajn,RTA)偶联后在荷瘤大鼠体内分布情况,探讨聚合物修饰的RTA靶向治疗肿瘤的可能性.方法 荷瘤大鼠动物模型分3组,分别尾静脉注射125I-RTA,125I-RTA-mPEG-MAL和125I-RTA-mPEG-OPSS后,在不同时间点分批处死大鼠,行组织分布测定,并相互比较.结果 RTA-mPEG偶联物的生物半衰期较RTA有明显延长,且随时间的延长RTA-mPEG偶联物的瘤/非瘤组织的放射性比值与RTA比显著增大.在肝、脾脏组织,注射后1 h测得RTA摄取率大于RTA-mPEG偶联物.结论 通过聚乙二醇的修饰,使RTA生物半衰期大大延长,且修饰后能避免肝脏、脾脏的摄取,并靶向到肿瘤组织.     

胃癌单克隆抗体-蓖麻毒素A链结合物的制备及其对肿瘤靶细胞的杀伤作用

作者报道胃癌McAb MGb_2(本室制备)与蓖麻毒素A链(RTA)交联物的制备。交联物对胃癌细胞具有强大的选择性杀伤怍用,胃癌McAbMGb_2对RAT具有导向能力。     

BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能

目的 构建重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并检测其转染肺癌A549细胞后的表达与功能. 方法 通过PCR技术以含B细胞转位基因(BTG2)的cDNA克隆质粒(HsCD00330081)为模板获得BTG2基因片段,将此片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,形成pCDH-BTG2,转染PC3细胞检测BTG2的表达;将重组慢病毒载体质粒pCDH-BTG2包装成重组慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞后,通过蛋白免疫印迹法检测BTG2的表达,细胞计数法检测BTG2对A549细胞生长的影响. 结果 pCDH-BTG2重组质粒构建成功,转染PC3细胞后可检测BTG2蛋白的表达,pCDH-BTG2包装成慢病毒感染A549细胞后,显著抑制A549细胞的生长. 结论 成功构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并发现BTG2抑制A549细胞的生长,为研究BTG2的功能奠定了基础,同时为肺癌的药物研究提供了靶点.     

单克隆抗体-蓖麻毒蛋白A链导向杀伤大肠癌细胞的研究

本研究从湘西野生蓖麻籽中提取了两种植物毒蛋白ricin Ⅰ、ricin Ⅱ,其分子量分别为65、67KD,LD_(50)分别为0.20、0.24ug/小鼠。用本室制备的抗大肠癌单克隆抗体Hb_3作为导向载体,与蓖麻毒蛋白A肽链交联,制备杂交分子Hb_3—RTA。SDS—PAGE分析表明,每个Hb_3上平均结合4.9个RTA。初步细胞毒试验显示,交联物Hb_3—RTA对大肠癌细胞HRT-18具有较强杀伤作用,而对正常人淋巴细胞杀伤作用较小。     

重组蓖麻毒素A链的表达及其对肿瘤细胞的毒性研究

目的探讨重组蓖麻毒素A链(pKK22.3-RTA)在原核系统中D的表达,以及它对肿瘤细胞HeLa、SKOV3、HEPG2及K562、YAC-1的毒性。方法将构建好的pKK223.3-RTA在大肠杆菌JM109中进行表达,并将表达出的RTA蛋白进行亲和层析。用Bradford法测定蛋白的含量;用MTT法分别测定RTA对肿瘤细胞HeLa、SKOV3、HEPG2及K562、YAC-1的杀伤作用。结果在37℃表达3h情况下得到较多的可溶性RTA。经亲和层析纯化后,对HeLa、SKOV3等肿瘤细胞具有不同的毒性。结论在原核系统中可表达出较多可溶性RTA。在低浓度时,不同肿瘤细胞对RTA的敏感性不同;在高浓度时,对肿瘤细胞的毒性比较相近。     

咖啡因在骨肉瘤顺铂化疗中增效作用的实验研究

目的探讨咖啡因在骨肉瘤细胞株(OS-732)顺铂化疗中的增效作用.方法骨肉瘤细胞株分别经咖啡因、顺铂、咖啡因 顺铂作用72h,采用MTT法体外细胞毒性试验观察三者的细胞毒性;应用流式细胞仪分析咖啡因、顺铂及两者配伍对骨肉瘤细胞株细胞周期的影响.结果骨肉瘤细胞株与浓度分别为0.2、2.0、5.0、10.0、20.0mmol/L的咖啡因作用时,细胞毒性指数(CI)分别为12.50%、27.88%、30.77%、56.73%、84.62%;与浓度为0.1、1.0、10.0、100.0μg/ml的顺铂作用时,CI分别为24.04%、54.80%、65.38%、88.46%;而与低浓度咖啡因与顺铂联合作用,其CI明显增加,随着各自浓度的升高,CI明显增加.流式细胞仪分析显示咖啡因对细胞周期也有明显的影响,使G0与G1期细胞比例明显增加,G2与M期细胞比例明显减少,S期细胞比例无明显改变.结论咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中有显著的增效作用,并能改变骨肉瘤细胞的细胞周期.     

姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨姜黄素诱导HepG2细胞凋亡的作用机制。方法:应用形态学方法、AnnexinV荧光染色和流式细胞仪(FCM)检测HepG2细胞凋亡的发生,应用RT-PCR检测凋亡相关基因P53、bcl-2和Fas的变化。结果:姜黄素对HepG2细胞的生长有明显的抑制作用,并诱导肿瘤细胞发生凋亡。凋亡细胞表现为细胞固缩,核染色质碎裂;流式细胞仪检测凋亡率为11.7%,细胞停在G1和G2期。AnnexinV标记的方法检测凋亡时发现,坏死与凋亡共存。在姜黄素诱导HepG2细胞凋亡过程中,凋亡相关基因Fas转录水平比用药前增强。结论:凋亡为姜黄素抑癌的机制之一,姜黄素诱导HepG2细胞凋亡可能与P53、bcl-2和Fas基因表达有关。     

RTA—RA3是B220特异性的有潜力的抗自身免疫的免疫毒素

将抗B220单克隆抗体分泌克隆RA3注射至SCID小鼠腹腔以获取腹水，抗体经proteinA亲和层析柱提纯，再经SPDP双功能交联剂修饰后，与还原的去糖基蓖麻毒蛋白A链反应生成免疫毒素RTA-RA3．SephadexG150柱层析分离纯化此免疫毒素，在还原状态下可见到免疫球蛋白重链、轻链及另一条带RTA．免疫毒素体内注射，研究MRL/＋和MRL/lpr小鼠脾细胞的淋巴细胞标志．实验表明：RTA－RA3对脾B220＋细胞有显著抑制作用．提示这一免疫毒素可用于治疗自身免疫性疾病。     

白藜芦醇对小鼠肝癌细胞H_(22)的抑制作用

目的 :研究白藜芦醇对体外培养的小鼠肝癌细胞 H2 2 生长的影响。方法 :应用MTT法、流式细胞仪来分析白藜芦醇对 H2 2 细胞生长的影响及细胞周期的变化。结果 :白藜芦醇对 H2 2 细胞的增殖具有抑制作用 ,IC5 0为 6.1 2 mg/L ,流式细胞术证实 ,白藜芦醇能引起 H2 2 细胞 S期阻滞。结论 :白藜芦醇通过改变 H2 2 细胞的细胞周期分布来抑制其生长。     

人CD137L在肿瘤细胞的表达及其对肿瘤细胞分泌IL-8的影响

目的 :检测人CD137L在肿瘤细胞的表达及其功能。方法 :采用RT PCR、FACS方法检测人CD137L在肿瘤细胞的表达 ,用ELISA方法检测CD137L对肿瘤细胞分泌IL 8的影响。结果 :9种不同来源的人肿瘤细胞系均不同程度表达CD137L ,其中 ,BEL 74 0 2、HL 6 0、A2细胞系呈高水平表达 ;HepG2 .2 .15、L 78、HT 2 9细胞系中度表达 ;U937、H6、HLE细胞系低表达。胚胎细胞系ECV 30 4中度表达 ,而新分离的正常外周血单个核细胞不表达。CD137L的表达水平与肿瘤细胞系的来源无关 ,同一组织来源的细胞系 ,有的高表达 ,有的低表达。肿瘤细胞上的CD137L对肿瘤细胞本身IL 8的分泌可产生不同的影响 :可使HepG2 .2 .15分泌IL 8的水平增加 ,但对HLE、A2 ,只能微弱地增强肿瘤细胞释放IL 8。结论 :CD137L在肿瘤细胞上的表达是普遍现象 ,其表达可能与细胞的快速生长有关 ;肿瘤细胞的CD137L可增强某些细胞系分泌IL 8。     

声动力学治疗对宫颈癌细胞的体外效应

目的:研究声动力学治疗对宫颈癌细胞的体外效应。方法:应用超声激活血卟啉,采用四甲基偶氮唑蓝法、克隆形成率方法检测声动力学治疗对宫颈癌细胞的生长抑制作用。结果:血卟啉单独应用对细胞无明显生长抑制作用。单纯应用超声有一定的细胞杀伤作用,血卟啉和超声联合作用时,有明显的超声增敏作用。随着血卟啉浓度的升高和超声辐照时间的延长,血卟啉联合超声对细胞的生长抑制作用明显增强穴P<0.05雪,克隆形成率也明显降低穴P<0.05雪。结论:声动力学治疗能明显抑制宫颈癌细胞的生长增殖。     

γδ表型T淋巴细胞的抗肿瘤效应研究

目的：研究小鼠脾脏中的γδT淋巴细胞体外抗肿瘤活性。方法：用固相抗体体外扩增获γδT淋巴细胞,体外观察γδT淋巴细胞的抗肿瘤作用。结果：经γδT淋巴细胞免疫的小鼠肿瘤体积明显缩小,存活时间明显延长。结论：γδT淋巴细胞参与机体的抗肿瘤免疫应答。     

用逆转录多聚酶链反应法检测多药耐药基因（mdr1）的表达

以长春新碱诱导的耐药细胞Ｋ５６２／ＶＣＲ和阿霉素诱导的耐药细胞Ｋ５６２／ＤＯＸ及敏感细胞Ｋ５６２作为检测对象，采用逆转录多聚酶链反应法，并且以β２－微球蛋白（β２ｍ）基因作为内参照，检测和比较了上述细胞的多药耐药基因ｍｄｒ１表达。经过３０个循环扩增，耐药细胞检测出ｍｄｒ１和β２ｍ基因的扩增产物，而敏感细胞无ｍｄｒ１扩增产物。结果提示，本方法可用以区分耐药和敏感细胞，有希望成为临床个体化疗敏感性预测的重要指标之一。     

胃癌血清、体外培养液拉曼光谱量效特征及构成的研究

目的分析胃癌血清及胃癌细胞培养液可见区激光拉曼光谱谱线特点,分析其量效特征,探讨特异性拉曼峰的来源。方法利用激光拉曼光谱仪对25份胃癌血清,10份功能性消化不良（FD）患者血清;不同时间点成组对照的SGC7901胃癌细胞培养液及裂解液进行检测。结果以230为最小峰高计算机自动判读,在583,633,656,674,707,773和799nm7个波长上胃癌患者均可以检测到重复性好的拉曼峰,其中在633,656,674nm3波长处仅胃癌患者出现重复性较好的拉曼峰,而FD患者血清则未检测到可识别拉曼峰。在余下4个波长上胃癌血清荧光强度（96．5±6．0,76．9±4．7,63．7±4．5,285．7±18．6）均明显高于FD对照组（40．3±1．8,27．9±1．9,22．9±1．4,113．2±7．7,均P〈0．01）;以100为最小峰高判读,在633,656,674nm3处胃癌细胞培养液可以检测出拉曼峰,而在1640培养基则不能检出;在583,707,773和799nm4处胃癌细胞培养液拉曼峰高显著高于1640培养基,且胃癌细胞培养液在上述7个波长拉曼峰高与培养时间呈正相关（Pearson相关系数分别为0．845,0．875,0．875,0．873,0．805,0．891,0．880,均P〈O．01）;胃癌细胞裂解液和培养液拉曼光谱在583,633,656nm3处两者的拉曼峰值差异均有统计学意义（11．1±3．2,5．0±0．9,3．3±0．5,均P〈0．05）。结论胃癌患者血清具有特异的,重复性较好的激光拉曼光谱谱像。激光拉曼光谱技术可以检测到不同浓度胃癌细胞代谢产物及裂解产物存在的差异。胃癌细胞凋亡后所释放的细胞内容物如DNA、RNA物质可能直接参与胃癌血清拉曼光谱的形成。