小鼠快、慢肌卫星细胞的分离培养及β肌动蛋白的表达

目的体外分离培养和纯化小鼠快、慢肌卫星细胞,观察细胞内β肌动蛋白(β-actin)的表达情况。方法采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法及差速贴壁法纯化ICR小鼠后肢骨骼肌腓肠肌(快肌)和比目鱼肌(慢肌)卫星细胞,免疫荧光抗体细胞化学染色法鉴定。取第2代快、慢肌卫星细胞提取总RNA,以GAPDH作为内参行RT-PCR,半定量分析快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量。结果体外分离及传代培养快、慢肌卫星细胞的快、慢肌肌浆蛋白表达阳性,细胞生长和增殖情况良好。快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量分别为3.71072和2.106028,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论小鼠快肌卫星细胞内β-actin表达高于慢肌,提示骨骼肌卫星细胞内β-actin表达可能与肌纤维类型有关。     

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的 探讨2型重组腺相关病毒（rAAV2）能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组（n=4）和未转染组（n=2）,经X射线照射后,分别移植入经rAAV2 β-珠蛋白病毒转染（MOI=50）或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠（n=2）和未转染受体小鼠（n=1）。采用 RT-PCR、等位基因特异性PCR（ASPCR）法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果 ①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-珠蛋白基因表达。③移植后第70天处死的转染小鼠外周血中人β链/α链分别为0.328和0.325,相对未转染组0.135的比值,两者的增加百分比高达144.78%和142.54%。结论 经rAAV2介导基因修饰后的重型β-地中海贫血患者造血细胞在体内可长期稳定表达正常人β-珠蛋白基因,而其分化产生的外周血人红系细胞内β-珠蛋白肽链的合成增加。     

兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

目的建立高纯度、高丰度的兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养方法,并对培养的肌卫星细胞体外增殖和成肌特性进行观察。方法采用改良I型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法结合差速贴壁培养以分离、纯化1周龄幼兔小腿三头肌来源的骨骼肌卫星细胞。镜下观察肌卫星细胞生长形态,结蛋白(Desmin)免疫组化染色鉴定体外培养的肌卫星细胞,MTT法绘制细胞生长曲线,并对分离培养的肌卫星细胞成肌特性进行诱导培养观察。结果差速贴壁后的悬浮肌卫星细胞折光性强,呈透亮球形,数量较多,贴壁生长后逐渐变为长梭形;免疫组化染色检测分离培养的细胞高表达Desmin,证明为肌卫星细胞,纯度高达95%;传代培养的肌卫星细胞24 h后开始增殖,第3~7天处于对数生长期,第8天后进入平台期;不经诱导分化培养基培养的肌卫星细胞也可融合形成肌管,但形成肌管速度不及诱导分化培养组快速。结论成功建立了具有操作简便、不易污染和纯度高的兔骨骼肌卫星细胞分离、培养方法,为采用肌卫星细胞为种子细胞的再生医学研究奠定实验基础。     

壁虎骨骼肌卫星细胞的原代培养与鉴定

目的:建立一种有效的壁虎骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定体系。方法:取壁虎后肢肌,采用I型胶原酶消化法获得细胞悬液,经差速贴壁法纯化骨骼肌卫星细胞,通过Pax7免疫细胞化学方法鉴定骨骼肌卫星细胞。用此法也分离到小鼠骨骼肌卫星细胞。结果:(1)分离到的细胞呈小圆形,培养2天后可见纺锤形细胞。(2)免疫细胞化学染色显示,分离得到的壁虎骨骼肌卫星细胞表达Pax7。Pax7阳性的小鼠骨骼肌卫星细胞达99%以上。培养3天后卫星细胞开始增殖。结论:成功建立壁虎骨骼肌卫星细胞的纯化和鉴定方法,为进一步研究卫星细胞在高等哺乳动物损伤修复中的可塑性奠定基础。     

Notch1在肌成纤维细胞转化中的作用及表达变化

目的  探讨在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中,Notch1表达的变化规律,以及γ-分泌酶抑制剂（DAPT）抑制Notch信号后,对细胞转化的影响。方法  取新出生2～3 d SD大鼠的肺组织,用胰酶消化法分离肺成纤维细胞,再将培养至第3代的细胞分为3组：对照组、转化生长因子-β1（TGF-β1）组、TGF-β1+ DAPT组。对照组为空白对照,TGF-β1组加入5ng/ml TGF-β1,TGF-β1+DAPT组同时加入5 ng/ml TGF-β1及5μmol/L DAPT。采用免疫细胞化学法对α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化进行检测。同时通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测Notch1 mRNA和蛋白的表达变化。结果  α- SMA免疫细胞化学结果表明,对照组大部分细胞无染色,而TGF-β1组则可见大部分细胞内有黄色和棕黄色颗粒及条纹,DAPT组和对照组无明显差异。对照组、TGF-β1组、TGF-β1+DAPT组Notch1 mRNA表达量分别为（0.278±0.022）、（0.783±0.018）和（0.313±0.029）,对照组与TGF-β1组、TGF-β1组与TGF-β1+DAPT组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,对照组与TGF-β1+DAPT组比较差异无统计学意义（P >0.05）。对照组、TGF-β1组、TGF-β1+DAPT组Notch1蛋白表达量分别为（0.312±0.019）、（0.701±0.026）和（0.345±0.022）,组间比较结果同Notch1 mRNA。结论  Notch1可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,进而促进肺纤维化。

     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desm in呈强阳性表达。体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1~2 d的潜伏期,5~6 d进入平台期。细胞汇合至60%~70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的 建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性.方法 采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞.免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MIT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性.结果 获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desmin呈强阳性表达.体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2 d的潜伏期,5～6 d进入平台期.细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞.结论 酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法.骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞.     

咀嚼肌卫星细胞的体外培养及生物学特性的研究

目的:探讨咀嚼肌卫星细胞的体外培养方法并研究其生物学特性。方法:取新生绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠面部咀嚼肌,采用酶消化法分离出咀嚼肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养。采用倒置显微镜及荧光显微镜观察、测定生长曲线等指标,研究咀嚼肌肌卫星细胞的增殖与分化能力,采用骨骼肌肌动蛋白(-αsarcometric actin)单抗免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:酶消化法适于咀嚼肌卫星细胞的分离,体外培养的咀嚼肌卫星细胞增殖速度快。免疫化学染色显示,体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达。结论:体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞有强的增殖分化能力,能用于颌面部组织工程种子细胞库的构建。     

大鼠认知障碍对糖代谢的影响及其与肝脏和骨骼肌糖原合成酶激酶-3β表达水平的关系

目的  探讨大鼠认知障碍对糖代谢的影响及其与肝脏和骨骼肌;糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表达的关系,为糖代谢的神经调节机制研究提供新的实验依据。方法  Aβ1-42大鼠海马内注射构建认知障碍模型,血糖仪检测大鼠空腹血糖（FPG）,半定量反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测肝脏与骨骼肌GSK-3β mRNA的表达,蛋白印迹法（Western blot）检测肝脏与骨骼肌GSK-3β的表达。结果  ①实验组大鼠FPG为（7.99±0.15）mmol/L,与假手术组和对照组比较显著升高（P <0.05）。②实验组大鼠肝脏和骨骼肌GSK-3β mRNA表达水平分别为（0.47±0.03）和（0.26±0.02）,与假手术组和对照组比较均明显升高（P < 0.05）。③实验组大鼠肝脏和骨骼肌GSK-3β表达水平分别为（0.47±0.04）和（0.26±0.03）,均显著高于假手术组与对照组（P <0.05）。结论  大鼠认知障碍可引起血糖水平的升高,其机制可能与认知障碍大鼠肝脏和骨骼肌GSK-3β表达升高有关。

     

成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究

目的：观察损伤对成年动物骨骼肌卫星细胞增殖的影响,以获取基因治疗自体移植的载体。方法：以阳离子脂质体介导法将pRSVLaxZ或pRchTH质粒转入培养肌细胞。结果：骨骼肌损伤后,分离出的肌卫星细胞及组织块游离成肌细胞数均显着增高;外源基因能在细胞内表达。结论：损伤可诱导成年骨骼肌卫星细胞增殖并促进体外培养肌细胞成活。     

慢病毒转染和电转染原代C57BL/6小鼠神经干细胞的比较

摘要：目的  比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣，获得神经干细胞高效转染的方法。方法  从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞，进行原代培养；分别进行慢病毒转染和电转染，通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达，比较两种转染方法的转染效果，并用噻唑蓝（MTT）法计算相对存活率，比较两种方法转染后对细胞的影响。结果  慢病毒与电转染两种转染技术转染神经干细胞48 h后，慢病毒的转染率为（77.6±6.6）%，高于电转染法转染率[（29.2±4.8）%]，两者比较，差异有统计学意义（P <0.05）；转染72 h后，慢病毒转染的细胞荧光表达量为（60.0±3.6）%，电转染细胞的荧光表达量仅剩（12.8±2.4）%；MTT法结果显示，电转染组细胞相对存活率为（75.8±2.3）%，慢病毒转染组细胞相对存活率为（70.1±1.4）%，两者比较，差异无统计学意义（P >0.05）。结论  对于原代神经干细胞转染，慢病毒转染法比电转染法具有更高的转染效率及长久稳定性，转染后细胞存活率与电转染法接近，因此慢病毒转染法更能满足研究者的需求。

     

十一酸睾酮对大鼠肛提肌卫星细胞结蛋白的影响

目的探讨不同浓度的雄激素对骨骼肌卫星细胞中结蛋白基因及结蛋白表达的影响。方法采用酶消化法原代培养骨骼肌卫星细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长,通过desmin及α-actin免疫荧光法对培养的骨骼肌细胞进行鉴定。选用原代培养3-4d的骨骼肌细胞,随机分成0组（空白对照组）、1组（0.01×10-3ng/μl雄激素组）、2组（0.04×10-3ng/μl雄激素组）、3组（0.16×10-3ng/μl雄激素组）、4组（0.64×10-3ng/μl雄激素组）、5组（1×10-3ng/μl雄激素组）。培养终止后,在倒置相差显微镜下观察骨骼肌细胞形态的变化。应用半定量PCR及Western blotting测定骨骼肌卫星细胞中结蛋白基因及结蛋白含量的表达。结果雄激素作用于肛提肌后,结蛋白基因的表达增多,结蛋白表达增强。结蛋白基因及结蛋白的含量有随雄激素浓度的增加而增高的趋势。结论雄激素能促进结蛋白基因及结蛋白的表达,且随雄激素浓度的增加,其促进作用越强。     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

大鼠肛提肌卫星细胞的分离纯化及鉴定

目的：　探讨大鼠肛提肌卫星细胞分离和纯化方法,观察肛提肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法：　采用改进的胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶来消化分离大鼠的肛提肌卫星细胞,结合差速贴壁法进行纯化,从而获得高纯度的大鼠肛提肌卫星细胞。运用显微镜观察细胞的形态和生长状况;CCK-8检测体外培养的肛提肌卫星细胞生长情况并绘制生长曲线;免疫荧光法对不同时期的卫星细胞进行鉴定。结果：　显微镜下观察发现,分离出的大鼠肛提肌卫星细胞生长较好。CCK-8检测结果显示,体外培养的前1、2 d细胞生长缓慢,3 d以后细胞呈倍数扩增,第10天细胞生长速度下降,部分细胞出现分化。免疫荧光和DAPI染色显示不同时期的肌卫星细胞,其特征性基因表达有差异。结论：　本方法成功从大鼠肛提肌组织中分离出了具有增殖、分化能力的肛提肌卫星细胞,为应用肛提肌卫星细胞探讨肌肉的损伤、修复机制奠定了前期基础。     

云南白药对大鼠骨骼肌急性损伤后炎症反应和卫星细胞再生的影响

目的：研究云南白药对大鼠急性骨骼肌损伤后炎性细胞和肌再生细胞（卫星细胞）的作用及其机理。方法：制备跑台诱导大鼠骨骼肌急性损伤模型,造模24　h后,模型大鼠左侧后肢喷洒云南白药为治疗侧,右侧喷洒等量生理盐水作为非治疗侧,在损伤后2、4、7、10和14d分别取4只大鼠后肢的治疗侧和非治疗侧腓肠肌（快肌）和比目鱼肌（慢肌）做HE切片,在光学显微镜下观察炎性细胞和卫星细胞的数量及形态学变化。结果：药物治疗侧快肌在损伤后的第2、4、7天炎性细胞较非治疗侧明显减少（P<0.01）,肌细胞的坏死程度较轻;云南白药治疗侧慢肌在损伤后的第2天炎性细胞较非治疗侧明显减少（P<0.01）。药物治疗侧的快肌和慢肌在损伤后的第7、10天损伤的肌纤维部分得到修复,卫星细胞的数量较非治疗侧明显增多（P<0.01）。结论：云南白药能够抑制炎性细胞对损伤后肌肉组织的破坏作用,缩短炎症反应进程,促进损伤后肌纤维的修复,对骨骼肌卫星细胞的增殖有一定的促进作用。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖

目的探讨成年大鼠原代骨骼肌卫星细胞体外培养方法,观察细胞的增殖、成肌分化特性。方法采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化鉴定所获取细胞的肌源性标志desmin。MTT法观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖特性并绘制生长曲线图。同时观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性。结果所分离的原代骨骼肌卫星细胞纯度在90%以上。细胞体外培养时在第3天进入对数生长期,5～6d进入增殖平台期。细胞体外培养时无须特殊诱导可以自发出现成肌定向分化,相互融合形成具有自发收缩特性的肌管细胞。结论体外培养获取的骨骼肌卫星细胞数量可以满足组织工程研究的需要。     

整合素和粘着斑激酶在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用

目的探讨整合素和粘着斑激酶是否在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）迁移调控中起作用。方法前期实验将JWA核酶基因构建到逆转录病毒载体pLXSN上，转染人体外培养的人PASMCs内，并证实转染的JWA特异性核酶基因能抑制PASMCs内JWA基因的表达。该研究应用改良Boyden小室法测定细胞迁移情况．半定量RT-PCR（sqRT-PCR）法测定细胞内整合素αv、整合素β3。粘着斑激酶的mRNA表达量．Western blot法检测细胞内整合素αv、整合素β3、粘着斑激酶的蛋白表达量。结果与空载体转染细胞（P-pLXSN组）及未转染细胞（PASMCs组）比较．转染JWA核酶基因的细胞（P-JWARZ组）迁移率显著增加，细胞内整合素αv、整合素β3、粘着斑激酶的mRNA及蛋白表达量均显著增加。结论整合素、粘着斑激酶信号通路可能在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移中起调控作用。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定

目的：探讨骨骼肌卫星细胞体外培养，鉴定的方法。方法：采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌卫星细胞，经差速贴壁法纯化后，在培养液中进行培养，观察不同血清浓度下，卫星细胞生长融合的情况，倒置显微镜观察细胞形态，利用结蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定肌卫星细胞。结果：细胞经过两步消化和差速贴壁后，纯度在90%以上，在生长培基中，细胞分裂增生；在融合培基中，细胞发生融合，形成肌管。结论：成年大鼠肌卫星细胞在不同的培养条件下可增生或分化，结蛋白免疫细胞化学染色可以早期鉴定骨骼肌卫星细胞。     

LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达

采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导基因转移技术，将含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶的结构基因（ＬａｃＺ基因）及Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子的质粒（ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ）导入体外培养的大鼠原代骨骼肌内；另外，分别将具有ＲＳＶ启动子和巨细胞病毒ＣＭＶ启动子的ＬａｃＺ基因直接注射到活体小鼠肌肉组织内。经转染的体外培养骨胳肌细胞和取自活体的肌肉组织切片行Ｘ－ｇａｌ组织化学检测以判断ＬａｃＺ基因的表达情况。实验结果证明，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的骨胳肌基因转染率约为１０％～２０％。直接肌肉注射含有不同启动子的ＬａｃＺ基因后，肌细胞内均有该基因表达。结果表明，无论在体内或体外，骨骼肌细胞均能被外源性基因所转染并能表达该报告基因。因此，有望使用经遗传工程改造的骨胳肌细胞作为体细胞基因治疗的有效运载细胞。     

Si-GATA-3对AR小鼠PBMCs中Th1/Th2细胞亚群功能的体外调节

目的 研究RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体si-GATA-3在体外对变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）小鼠PBMCs中Th2、Th1细胞亚群功能的调节作用。方法 构建RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体siGATA-3,并进行包装、纯化和滴定。BALB/C小鼠随机分为AR组和正常对照组。用卵蛋白构建BALB/C小鼠变应性鼻炎模型,抽取其外周血并分离外周血中单个核细胞（PBMCs）,随机分为3组,即si-GATA-3组、siNC组和AR组。进行细胞培养,然后分别用si-GATA-3、si-NC和生理盐水对3组变应性鼻炎小鼠的PBMCs进行干预72 h,用生理盐水代替si-GATA-3干预正常对照组小鼠的PBMCs。干预结束分离PBMCs和细胞培养上清液。分别用荧光定量qPCR和Western bloting方法检测PBMCs中GATA-3 mRNA、T-bet mRNA和GATA-3、T-bet蛋白的相对表达量;用ELISA技术检测细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ的含量。结果 构建出RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体si-GATA-3,其滴度为5...