大鼠海马神经元缺氧/复氧后caspase-3活性的变化

目的：研究caspase-3在体外培养的海马神经元缺氧／复氧损伤中的作用及其抑制剂的干预效果，为缺血性脑损伤的治疗提供实验资料。方法：诱导体外培养的大鼠海马神经元缺氧3h，再复氧12－4，并在缺氧前1h用不同剂量的caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CMK进行干预处理，应用MTT比色法测定细胞存活率，底物裂解法caspase-3活性。结果：缺氧／复氧后大鼠海马神经元存活率逐渐降低，caspase-3活性明显增强，复氧24h达高峰；用Ac-DEVD-CMK预处理的海马神经元caspase-3活性降低，细胞存活率增高，并呈剂量依赖性。结论：体外培养的大鼠海马神经元缺氧及缺氧／复氧后出现迟发性死恨，caspase-3介导的细胞凋亡机制在这种损伤过程中起一定的作用，通过抑制其活性可产生神经保护作用。     

硫氧还蛋白对缺氧／复氧海马神经元生长与凋亡的影响

目的 :探讨硫氧还蛋白 (Thioredoxin ,Trx)在大鼠海马神经元缺氧 /复氧损伤中对神经元生长与凋亡的作用。方法 :①海马神经元培养和缺氧实验。取当天出生的SD大鼠 ,在无菌条件下断头取脑 ,分离双侧海马 ,参照文献进行鼠海马神经元的培养 ;取培养 10d的海马神经元 ,参照文献进行缺氧实验 ,在缺氧条件下继续培养 3h ,部分细胞在缺氧 3h后迅速更换新鲜培养液 ,在正常供氧环境下分别继续培养 12h、2 4h或 48h ,同时设置未缺氧的正常海马神经细胞作为对照。②Trx干预。取培养 10天的海马神经元 ,加入 2 0 μg/ml的Trx ,作用 1h后如上操作开始诱导缺氧 /复氧 ,如上设定时点终止培养。③细胞活力测定和caspase -3活性测定。采用MTT法测定细胞活力 ,caspase-3活性按照说明书进行操作。实验数据以 x±s表示 ,用ANOVA进行分析处理。 结果 :与正常对照组相比 ,缺氧 /复氧组2 4/4 8h时点细胞存活率显著降低 (P <0 .0 0 1) ,Trx处理组的细胞活力也进行性下降 ,但与缺氧 /复氧组相比 ,2 4/4 8h时点细胞存活率明显提高 (P <0 .0 5 ) ;但与正常对照组相比 ,Trx处理组的细胞活力仍降低 (P <0 .0 5 ) ;在缺氧 /复氧组在复氧 12～ 48h ,caspase -3样蛋白酶活性明显增高 ,以复氧 2 4h为最高 (P <0 .0 0 1) ,在Trx处理组 ,神     

大鼠海马神经元缺氧/复氧后caspase-3活性的变化

细胞凋亡过程是受基因调控的级联反应过程 ,其中caspase -3在此过程中起关键作用 ,它可促进脑部发育过程中的神经元死亡 ,在缺血性脑损伤中也起重要作用。本研究应用培养的海马神经元 ,观察在缺氧或缺氧再复氧后不同时间caspase -3活性的动态变化及caspase -3抑制剂预处理对其影响 ,研究caspase -3在体外培养的海马神经元缺氧 /复氧损伤中的作用及其抑制剂的干预效果 ,为缺血性脑损伤的在体针对性治疗提供一定的实验研究资料。取当天出生 (P1)的SD大鼠 ,分离海马神经元进行体外培养。诱导体外培养 10d的大鼠海马神经元缺氧 3h ,再复氧 12～ 48h ,并在缺氧前 1h用不同剂量的caspase -3抑制剂Ac -DEVD -CMK进行干预处理 ,同时用溶剂DMSO处理进行对照 ,应用MTT比色法测定细胞存活率 ,底物裂解法检测caspase -3样蛋白酶活性。用方差分析 (ANOVA)进行统计学分析处理。结果发现 ,缺氧 /复氧后大鼠海马神经元存活率逐渐降低 ,caspase -3活性明显增强 ,复氧2 4h达高峰 ;溶剂DMSO处理后神经元存活率及caspase -3活性与缺氧 /复氧神经元相比无显著性差异 ;用Ac -DEVD -CMK预处理的海马神经元caspase -3活性降低 ,细胞存活率增高 ,并呈剂量依赖性 ,但抑制caspase -3样蛋白酶的活性并不能完全逆转神经元的死亡。本研     

蒺藜皂苷对缺氧-复氧诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响

目的：观察蒺藜皂苷（Tribulus terrestrisL．saponion，TTLS）对大鼠皮层神经元经缺氧一复氧后细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：离体培养大鼠皮层神经元，先用95％N：与5％CO2混合气体造成细胞缺氧3h，再给予95％O2。与59／6CO2混和气复氧12h，建立缺氧复氧损伤的皮层神经元凋亡模型。中药组于缺氧-复氧时均加入TTLS进行干预。AnnexinV—FITC／碘化丙啶（propidiumiodide，PI）双染，流式细胞仪定量分析细胞凋亡百分率；JC-1荧光染色，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位的变化，荧光酶标仪测定神经元胞浆内caspase-3／7的活性，并采用免疫细胞化学法观察细胞Bax蛋白表达情况。结果：细胞缺氧3h复氧12h后，凋亡率明显增加，线粒体膜电位显著降低，胞浆内caspase-3／7活性增多，Bax蛋白大量表达（P〈0．01）。TTLS能抑制缺氧-复氧损伤的皮层神经元线粒体膜电位的降低，减少caspase-3／7活性，并可降低Bax蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡的发生。结论：缺氧一复氧可以诱导皮层神经元的凋亡。TTLS可降低缺氧-复氧诱导细胞凋亡的发生，其机制与维持线粒体膜电位的稳定，抑制caspase酶活性，降低Bax蛋白表达有关。     

异丙酚对缺氧复氧后培养海马神经元nNOS的影响

目的 观察异丙酚对培养海马神经元缺氧复氧后损伤反应的影响.方法 培养12d海马神经元,随机分为正常对照再培养24h组(Nor组)、缺氧4h后复氧24h组(Ano组)、加异丙酚500μmol/L缺氧4h后复氧24h组(Pro组).采用MTT法测定细胞存活率,免疫组化方法 测定nNOS蛋白含量,应用流式细胞仪测定神经元凋亡率.结果 缺氧后Ano组nNOS蛋白表达及细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),加入异丙酚后能减少nNOS蛋白含量(P＜0.01)和细胞凋亡率(P＜0.05),Pro组细胞存活率较Ano组增加(P＜0.05),但与Nor组比仍下降(P＜0.05).结论 异丙酚能提高体外海马神经元的抗缺氧能力,减少nNOS蛋白过度表达和细胞的凋亡.     

TAK1对大鼠海马神经元细胞缺氧复氧后JNK信号通路和细胞凋亡的影响

目的：探讨TAK1对大鼠海马神经元缺氧复氧后JNK信号通路和细胞凋亡的影响。方法新生（出生＜24 h） SD大鼠,雌雄不拘,体质量5～6 g,原代培养海马神经元,接种于培养孔或培养皿中。采用随机数字表法,将其随机分为4组,每组48孔和12皿,正常对照组（ C组）：不予任何处理;缺氧复氧组（ HR组）：缺氧4 h复氧24 h;TAK1抑制剂组（ T组）、DMSO组：分别于缺氧处理前给予TAK1特异性抑制剂5Z－7－oxozeaenol 1μg／mL和等量DMSO溶液后行缺氧复氧。各组缺氧复氧处理结束后1 h,测定神经元活力、凋亡率、cleaved Caspase －3和Bax蛋白的表达水平,测定JNK磷酸化水平。结果与C组比较,HR组和DMSO组的海马神经元活力降低,细胞凋亡率升高,cleaved Caspase－3和Bax蛋白表达上调,JNK磷酸化水平明显升高（ P＜0．05）;与HR组比较,T组海马神经元活力增强,细胞凋亡率降低,cleaved Caspase －3和Bax蛋白表达下调,JNK磷酸化水平降低（P＜0．05）。结论 TAK1可能通过激活JNK信号通路介导的细胞凋亡参与大鼠海马神经元缺氧复氧后的损伤机制。     

体外培养大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型的建立

目的 建立体外培养大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型.方法 取体外培养7 d的海马神经元,分为正常对照组和糖氧剥夺/复氧组.后者分别在糖氧剥夺0.5、1.0、1.5 h再复糖复氧.常氧状态下检测各组复氧后1、5、24、48、72 h培养液中的LDH活性,并观察神经元形态和轴突长度的变化.结果 糖氧剥夺/复氧后的神经元折光性降低,胞体肿胀,并且轴突逐渐变短,同时LDH水平随时间延长增加.其中糖氧剥夺0.5 h再复氧组效果最佳,其轴突缩短明显且神经元存活率较高.结论 成功建立了体外培养SD大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型.     

三七总皂苷对缺氧复氧致皮质神经元损伤细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响

【目的】研究三七总皂苷（PNS）对缺氧复氧致皮质神经元损伤细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响，探讨PNS抗神经元缺氧，复氧诱导的细胞凋亡的作用。【方法】体外原代培养大鼠胎鼠大脑皮质神经元细胞（CNC），采用缺氧／复氧（H／R）诱导皮质神经元细胞氧化应激损伤模型，采用PNS50、10、2mg／L进行干预。采用实时荧光定量逆转录酶-聚合酶链式反应（RT—PCR）技术检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-2相关蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）mRNA表达的变化，采用福林-酚法（Lowrry）法检测caspase-3蛋白含量的变化。探讨PNS抑制神经元细胞凋亡的分子机制。【结果】PNS50、10mg／L剂量组可以显著降低Bax表达；PNS50mg／L组可以显著增加Bcl—2表达；PNS有降低caspase-3表达的趋势。PNS各剂量组均能够抑制cas—pase-3的活性，有剂量依赖性趋势。【结论】PNS可能是通过增加抑制凋亡基因Bcl-2的表达，抑制促凋亡基因Bax的表达，抑制caspase-3的活性等作用抑制神经元缺氧／复氧诱导的细胞凋亡。     

七氟烷后处理对原代海马神经元氧糖剥夺/复氧损伤及自噬的影响

目的 探讨七氟烷后处理对原代海马神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤、氧化应激及自噬的影响。方法 取(18±0.5)d孕鼠子宫内胎鼠海马组织,收集海马神经元进行培养,7d后培养的海马神经元随机分为3组：正常对照组(CON组)、氧糖剥夺/复氧组(OGD/R组)、七氟烷后处理组(OGD/R+SEVO组)。CON组正常培养;OGD/R组：氧糖剥夺1.5 h,复氧复糖24 h,建立OGD/R损伤模型;OGD/R+SEVO组经氧糖剥夺后即刻予2.4%七氟烷后处理1 h,复氧复糖23 h。处理结束后,比色法检测各组乳酸脱氢酶(LDH)的活性,原位末端标记法(TUNEL)检测各组神经元凋亡变化,免疫荧光法检测各组神经元线粒体活性氧和微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)的表达,Western blot检测丝氨酸/苏氨酸激酶(PINK1)、E3泛素连接酶(Parkin)的表达。结果 与CON组比较,OGD/R组LDH释放增加(P<0.01),神经元凋亡增加,线粒体活性氧和自噬标志性蛋白LC3B表达增加(P<0.01), PINK1蛋白和Parkin蛋白表达上调(P<0.001,P<...     

钙敏感受体及钙蛋白酶在大鼠脊髓神经元缺氧复氧损伤中的表达及其意义

目的: 探究大鼠脊髓神经元缺氧复氧损伤中钙敏感受体及钙蛋白酶的表达变化及其意义。方法: 将原代培养的新生SD大鼠脊髓神经元随机分成4组：正常对照组、缺氧复氧组、激活组、抑制组。后3组神经元均制备缺氧复氧损伤模型,激活组加入钙敏感受体激动剂GdCl3,抑制组加入受体抑制剂NPS2390。应用Hoechst 33258染色观察各组脊髓神经元凋亡;应用免疫荧光技术分析钙敏感受体及钙蛋白酶蛋白在脊髓神经元的表达定位;采用蛋白质印迹法检测各组钙敏感受体、钙蛋白酶以及Bax蛋白的表达水平。结果： 与对照组比较,缺氧复氧组脊髓神经元凋亡增加,并且钙敏感受体、钙蛋白酶、Bax蛋白的表达明显升高（均P<0.01）;GdCl3可明显增强上述作用,而NPS2390可明显抑制上述作用。结论： 在缺氧复氧损伤过程中,脊髓神经元凋亡增加,钙敏感受体及钙蛋白酶表达增多。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在缺氧缺血性神经细胞死亡中的作用

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在缺氧缺血性神经细胞死亡中的作用。方法体外实验采用原代培养的大鼠胎鼠皮质神经细胞,给予缺氧再给氧处理;体内实验采用线栓法建立大鼠局灶性短暂性脑缺血再灌注损伤模型。用噻唑蓝比色法测定神经细胞生存率,用电泳迁移率变动分析法检测PPARγ的结合活性。结果缺氧处理后的神经细胞,其PPARγ的结合活性明显增加,以对照组活性为100,而缺氧3h组为160.3,缺氧3h再给氧的2、4、8h分别为157.5、136.6、103.3;缺氧3h及再给氧2h组与未处理组相比(P<0.01)。缺血处理后的神经细胞,其PPARγ的结合活性也明显增加,以假手术组为100,则手术组缺血侧、未缺血侧分别为144.8、102.6,缺血侧PPARγ的结合活性与未缺血侧及假手术组相比(P<0.01);PPARγ拮抗剂GW9662能明显增加缺氧再给氧后神经细胞的生存率,以对照组(CTL)生存率为100%计算,单纯缺氧组为58.6%,不同浓度的GW9662(0.5、1、2.5)预处理后分别为68%、73.6%和89.7%,GW9662预处理组与单纯缺氧再给氧组相比(P<0.05或P<0.01);GW9662能明显降低由于缺氧而增高的PPARγ结合活性,以未处理组为100,单纯缺氧组、GW9662预处理组分别为184、105,GW9662预处理组神经细胞PPARγ的结合活性与单纯缺氧再给氧组相比,P<0.01。结论PPAR     

星形胶质细胞条件培养液对缺氧损伤神经元的影响

目的分析星形胶质细胞(Ast)与腺苷对缺氧/复氧损伤神经元的保护作用,揭示腺苷对神经系统的保护机制。方法体外培养SD大鼠大脑皮层Ast和海马神经元及大脑皮层神经元,纯化后给予神经元缺氧/复氧处理,收集复氧18 h后的Ast条件培养液(ACM)和腺苷预处理的Ast条件培养液(ACMa),然后用ACM、ACMa及ACM+腺苷(ACM+含100μmol·L-1腺苷的DMEM液)以15的浓度培养缺氧损伤神经元;光镜观察神经元形态学变化,二甲氧唑黄比色法测定细胞活性。结果 ACMa组、ACM+腺苷组及ACM组的神经元缺氧损伤后的细胞形态较模型组得到明显改善,细胞活性较模型组也得到显著提高。不同条件培养液对缺氧/复氧后神经元活性的作用:ACMa>ACM+腺苷>ACM。结论 Ast条件培养液对缺氧/复氧损伤的神经元有重要的保护、修复作用,腺苷可通过Ast间接地保护和修复受损神经元。     

大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型的建立

目的建立大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型。方法在大鼠鼠胚海马神经元培养基础上,给予不同时间的缺氧复氧,应用Wright-Giemsa染色、TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果随着缺氧和复氧时间的延长神经细胞凋亡数逐渐增加,其中缺氧4 h复氧48 h大鼠海马神经细胞凋亡最为显著。结论缺氧复氧可诱导培养的大鼠海马神经细胞发生凋亡,缺氧4 h复氧48 h可作为细胞凋亡模型。     

人参首乌方对缺氧复氧诱导的皮质神经细胞凋亡的影响

目的 探讨人参首乌方(RSSW)降低缺血性脑损伤、保护神经元的作用及机制.方法 原代培养大鼠皮质神经元,Na2 S2 O4造成缺氧/复氧损伤模型,分为正常组、模型组、依达拉奉阳性药组、RSSW高、中、低剂量组,通过Hoechst 33258染色及流式细胞术测定细胞凋亡率,生化测定细胞内内源性超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)、过氧化产物丙二醛(MDA)和线粒体膜电位(MMP)及细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)水平,ELISA检测细胞内凋亡蛋白Caspase-3,9的活力,Western blot检测其抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.结果 RSSW能升高细胞SOD活性,提高GSH及MMP水平,减少细胞内ROS、MDA生成和LDH漏出,抑制Caspase-3,9的活性,具有显著的抗氧化活性,上调Bcl-2蛋白的表达,剂量依赖性抑制神经细胞元凋亡.结论 RSSW对氧化应激损伤诱导的神经细胞凋亡有保护作用,其机制可能与其增加细胞内源性抗氧化剂、改善Bcl-2蛋白的表达及抑制Caspase-3和Caspase-9的活性相关.     

缺氧后不同复氧时间对心肌细胞自噬的影响

［摘要］目的　探讨大鼠心肌细胞（H9C2）不同缺氧复氧（hypoxia reoxygenation,HR）时间对自噬（Autophagy）及细胞活力的影响．方法　体外培养的H9C2细胞按照不同复氧时间随机分为5组,正常对照组（A 组）、缺氧组（B 组）、复氧2 h组（C组）、复氧12 h组（D组）、复氧24 h组（E组）．Western Blot检测各组细胞中LC3 II/LC3 I的表达量,MTT法检测各组心肌细胞的活力．结果　HR模型组心肌细胞活力明显低于正常对照组（P＜0.05）;缺氧组及各复氧组细胞的LC3 II/LC3 I的比值明显高于对照组（P＜0.05）,其中以12 h组比值最高（P＜0.05）;缺氧组及各复氧组的细胞活力明显低于对照组（P＜0.05）,其中以12 h组细胞活力最低（P＜0.05）．结论　利用三气培养箱可以造成H9C2细胞HR损伤;细胞缺氧可以激活细胞自噬,复氧后自噬进一步激活,以12 h自噬激活最明显,24 h下降至缺氧组水平,同时细胞缺氧造成细胞损伤,复氧后细胞损伤进一步加重,在复氧12 h时细胞活力最低,复氧24 h细胞活力得到改善．     

低(无)糖、缺氧和缺氧/复氧对培养鼠脑胶质细胞活力及致损的影响

目的 :研究氧、糖剥夺和缺氧 /复氧单一或联合因素对培养鼠脑星形胶质细胞活力和引起损伤的影响及其时效反应。方法 :培养的鼠脑星形胶质细胞分为 3组 :无糖组 (D Hanks液 )、低糖组 (DMEM中含 2 .75mmol葡萄糖 )和正常糖组 (DMEM中含 5 .4 9mmol葡萄糖 ) ,各组分别进行不同时间的缺氧和 /或缺氧 /复氧。通以 5 %CO2 +95 %N2 混合气造成缺氧 ,以乳酸脱氢酶 (LDH)漏出率作为细胞受损指标 ,噻唑蓝 (MTT)降解率评测细胞活力。结果 :①在正常氧培养 2 4h ,低糖和无糖培养的细胞LDH漏出率和MTT降解率并不出现明显变化 ;② 3组二项指标在缺氧培养的各时间点依次出现明显变化 ,无糖组为 8h(P <0 .0 5 ) ,低糖组和正常糖组为 12h(P <0 .0 5 ) ,2 4h(P <0 .0 1) ;③缺氧 /复氧引起 3组二项指标出现明显变化 ,其时间点分别为无糖组缺氧 4h +复氧 12h(P <0 .0 5 ) ;低糖组缺氧 8h +复氧 12h (P <0 .0 5 ) ;正常糖组缺氧 8h +复氧 2 4h (P <0 .0 5 ) ;④在同一缺氧和缺氧 /复氧时间点 ,指标值变化程度为无糖组 >低糖组 >正常糖组 ;且两项指标的变化具有时间依赖性 ,呈反变关系。结论 :①氧、糖剥夺和缺氧复氧能引起培养的鼠脑星形胶质细胞的损伤 ;②氧、糖剥夺和缺氧 /复氧联合作用时能增加对培养的鼠脑星形胶质细胞     

3'-大豆苷元磺酸钠对去血清所致海马神经元损伤的保护作用

目的：探讨3'-大豆苷元磺酸钠对去血清所致海马神经元损伤的保护作用的影响。方法：取新生SD大鼠（0~24 h）海马区制成单细胞悬液进行体外培养,待细胞发育成熟后,用去血清的培养基制作海马神经元损伤模型,造模同时给予3'-大豆苷元磺酸钠(3.0,10.0,30.0 µmol•L-1)处理,继续培养24 h,采用MTT法检测细胞活性;并观察细胞形态的改变;取培养上清,测定去血清海马神经元中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性。结果：形态学观察模型组海马神经元细胞膜边界相对模糊,细胞皱缩,神经突触回缩,少量细胞贴壁不牢;其上清液中去血清海马神经元中LDH活性升高;MTT法检测结果显示去血清海马神经元活性降低;给予3'-大豆苷元磺酸钠处理后,镜下观察可见细胞膜边界清楚,胞体饱满,神经突触回缩不明显,细胞贴壁良好;去血清海马神经元细胞活性升高,去血清海马神经元LDH活性降低。结论：3′-大豆苷元磺酸钠对去血清所致海马神经元损伤具有显著的保护作用。     

二氮嗪后处理对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞保护作用的体外研究

目的研究线粒体ATP-敏感性钾通道（mitoKTP）开放剂二氮嗪（diazoxide,DZ）后处理对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞的影响。方法体外培养原代成年大鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型,随机分为5组：Normal组（在CO2培养箱中持续培养6h）;H／R组（缺氧3h复氧3h）;DZ组（缺氧3h复氧3h,在复氧5min时给予100mol／LDZ）;DZ＋5-羟葵酸盐（5-hydmxydecanoate,5-HD）组（缺氧3h复氧3h,在缺氧末给予100mol／L选择性mitoK。通道阻断剂5-HD,然后在复氧5min时给予100mol／LDZ）;5-HD组（缺氧3h复氧3h,在缺氧末给予100mol／L5-HD）。复氧3h末检测各组培养基中乳酸脱氢酶（LDH）漏出量和丙二醛（MDA）含量,TUNEL法测定心肌细胞凋亡指数、测定心肌细胞收缩幅度。结果与Normal组相比,其他4组培养基中LDH漏出量和MDA含量明显升高,心肌细胞凋亡指数也显著增高,心肌细胞收缩幅度降低（P〈0．05）;与H／R组比较,DZ后处理使培养基中LDH漏出量及MDA含量减少、心肌细胞凋亡指数降低,复氧后心肌细胞收缩幅度明显增高（P〈0．05）,但是缺氧末即刻给予5-HD可以逆转DZ的作用（P〈0．05）;5-HD组与H／R组相比各指标差异无统计学意义（P〉0．05）。结论Dz后处理可以通过开放mitoK。通道对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞发挥保护作用。