一步亲和纯化制备基因工程人源抗HBs单克隆抗体Fab片段

目的：探索亲和纯化人源单克隆抗体片段的简便实用方法。方法：应用自制的抗人免疫球蛋白片段抗体（Ａｎｔｉ－Ｆａｂ）与链球菌蛋白Ｇ亲和胶（Ｇａｍｍａ Ｂｉｎｄ）交联制备亲和层析柱,用一步法从工程菌培养上清中纯化人源抗ＨＢｓ单克隆Ｆａｂ片段。经依沙吖啶沉淀、离子交换、分子筛纯化人混合血清提取ＩｇＧ组分,木瓜酶处理后分离,纯化出Ｆａｂ,免疫绵羊制备高效价抗表。用Ｇａｍｍａ Ｂｉｎｄ一步纯化出抗血清中的ＩｇＧ     

人源性抗-D基因工程抗体在真核细胞CHO中的表达

目的于真核细胞系CHO细胞中表达人源性抗-D基因工程抗体,为人源性抗-D基因工程抗体在临床上的应用打下坚实的基础。方法脂质体法将真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL共转染体外培养的CHO细胞,经霉酚酸及组氨醇筛选阳性克隆细胞。通过ELISA法检测培养上清中人IgG的表达量。应用化学发光WesternBlotting法对真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL在CHO细胞中的表达进行鉴定。结果pAH4604/VH和pAG4622/VL共转染体外培养的CHO细胞,经霉酚酸及组氨醇筛选12～14d后有阳性克隆长出,未转染细胞则全部死亡。筛选出的各阳性细胞克隆经扩大培养及ELISA定量检测其上清人IgG含量最高为4.05ng/ml。WesternBlotting显示上清和细胞内均有人IgG重链和轻链的表达。结论所构建的真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL在CHO真核细胞系表达成功,可产生人源化的IgG重链和轻链。     

人抗-HBsAg Fab段抗体的表达

目的 观察从已构建的人抗－HBsAg噬菌抗体库中筛选出的特异笥抗体的表达情况。方法 构建溶性Fab段表达载体，进行SDS－PAGE和免疫印迹试验检测其表达的情况，并通过ELISA实验证明Fab段抗体对HBsAg具有亲和力。结果 所得到抗体在还原条件和非还原条件下的表达情况与预期相同。结论 观察到的抗体的表达情况为进行大量制备纯化奠定了基础。     

抗人大肠癌抗体CAb-1 Fab基因的克隆、表达和鉴定

目的:从杂交瘤细胞中克隆mAb CAb-1所编码Fab抗体基因,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定.方法:采用RT-PCR方法,扩增mAb CAb-1的Fd片段和全长κ链基因,分别克隆到T载体后进行序列测定和分析.依次亚克隆两个基因到噬粒pComb3中,去除该载体上的gIII基因,构建成分泌表达载体Fd-L/pComb3.转化XL1-Blue E.coli菌株,IPTG诱导表达.采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性.结果:克隆了大肠癌mAb CAb-1的Fab基因,并在E.coli中获得表达.产物CAb-1 Fab具有与大肠癌细胞株SW480特异结合的活性.结论:成功构建了在E.coli中表达抗人大肠癌mAb CAb-1的小分子单价Fab抗体的载体.     

人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析

目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性.方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc.所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价.结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60 ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合.结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备.     

提高重组抗菌蛋白BPI23在E.coli中表达水平和复性率的研究

目的:提高重组抗菌蛋白BPI23在E.coli DH 5α中的表达水平及提纯后蛋白的复性率.方法:通过降低目的基因5′端序列中GC含量和构建双拷贝重组表达载体pBV220-(synBPI600)2,减少低频密码子数目和增加目的基因拷贝数,并采用不同复性方法对提纯后的蛋白进行复性.结果:降低目的基因5′端序列中GC含量后,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的14.3%;单双拷贝重组表达载体转化E.coli DH 5α后,目的蛋白的表达水平无明显差异;在复性液中加入PEG4000后,目的蛋白产生聚集沉淀较少.结论:减少目的基因中GC含量可显著提高BPI23的表达水平,增加表达载体中目的基因的拷贝数对其表达水平无影响,在蛋白复性液中加入PEG4000可明显抑制蛋白聚集沉淀.     

抗人大肠癌HCAb嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达

目的 在CHO细胞中高效表达抗人大肠癌HCAb人-鼠嵌合抗体.方法 从分泌鼠源单抗CAb的杂交瘤细胞中克隆、扩增可变区基因,测序鉴定后连入真核表达载体,转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢（dihydrofolate reductase-deficient Chinese hamster ovary,CHO-dhfr-）细胞进行表达.经G418及氨甲喋呤（MTX）梯度加压筛选进行嵌合抗体的高效表达,并用夹心ELISA方法测定嵌合抗体表达产量.结果 采用RT-pCR、夹心ELISA等实验证实了所表达的抗人大肠癌HCAb嵌合抗体的人源性.培养上清中的抗体产量可达20mg/L.结论 成功的实现了抗人大肠癌HCAb人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中高效表达,为其进一步在大肠癌临床诊治中的应用奠定了基础.     

大肠癌相关抗体Fab段噬菌体呈现库的表达和活性鉴定

目的利用阳性重组菌XL1-Blue-Pcomb3 表达出人源性大肠癌Fab段噬菌体原始库,固相化人大肠癌组织及细胞的相关抗原后对其进行筛选,鉴定筛选后的抗体库与人大肠癌有无特异性的结合活性。方法PCR鉴定XL1-Blue- Pcomb3重链Fd段和资链的插入率,表达出人大肠癌Fab段原始库。然后提取3例用于构建原始抗体库的致敏大肠癌组织抗原,13例非致敏大肠癌组织抗原及3种体外培养的大肠癌细胞株LoVo、HT-29、LS-174T的抗原,利用3组混合抗原分别对原始抗体库进行3轮筛选,将筛选后的3个三级库等体积混和后通过ELISA及免疫组化鉴定其与人大肠癌组织及细胞是否具有特异性的结合活性,取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果Fd片段及资链的插入率分别为40%和70%,Fd片段及资链均插入质粒Pcomb3的重组率为28%,Fab段基因库库容为2.1×106,3组大肠癌混合抗原分别对原始库进行3轮筛选后,抗体库均得到了不同程度的富集,ELISA及免疫组化显示富集后的抗体库对人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞均有较特异性的结合活性。结论利用噬菌体抗体库技术筛选到了人大肠癌相关Fab段抗体群,且筛选后的抗体群与人大肠癌抗原有较特异性的结合活性。     

人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3×106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

白细胞介素31在E.coli中的表达及活性鉴定

目的构建人IL-31原核表达载体，在大肠杆菌中表达，研究人IL-31对人表皮角化细胞分泌趋化因子MIP-3β的活性影响。方法大量培养pET28a（＋）-hIL-31工程菌株，提取质粒，BamHI、HindⅢ双酶切，并将其连接到原核表达载体pET32a（＋），通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达。用RT-PCR检测该目的蛋白对人表皮角化细胞HaCaT表达趋化因子MIP-3β的影响。结果原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，经双酶切、PCR和序列测定鉴定，序列正确，IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达，纯化后的目的蛋白可刺激人表皮角化细胞表达MIP-3β。结论原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，纯化后的蛋白具有生物学活性，可刺激人表皮角化细胞表达趋化因子MIP-3β，为研究人IL-31的作用及其作用机制和制备单克隆抗体奠定了基础。     

重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达

目的:克隆人THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性THANK.方法:采用RT-PCR从PMA诱导的 HL60细胞中克隆人THANK全长编码基因,继以PCR扩增出可溶性THANK编码区基因(134～285位氨基酸),PCR产物克隆于pMD-18T,经DNA测序证实后亚克隆到pET-11a中.重组质粒转化B L21,以1 mmol/L IPTG进行诱导表达产物,SDS-PAGE分析表达产物,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性.结果:RT-PCR扩增出编码人THANK全长编码基因及P CR扩增出THANK134-285基因的cDNA,经序列分析证实与文献报道完全一致.含有THA NK134-285编码基因的表达载体,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约18 000的重组蛋白.该重组蛋白经纯化后能够诱导U937细胞凋亡.结论:成功克隆了人THANK基因,并在大肠杆菌中表达重组可溶性THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导U937细胞凋亡的作用.     

重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中的高效表达

目的:在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性.方法:采用PCR方法对编码人VEGI全基因进行修饰,获得编码成熟蛋白第29～174位氨基酸的C端胞外区基因片段,将PCR产物亚克隆到 pMD-18T中,经DNA测序证实后亚克隆入高表达载体pLOU-1,转化大肠杆菌BL21,获得高表达菌株.经IPTG诱导获得高表达,纯化表达产物并检测其对内皮细胞ECV304增殖的抑制活性 .结果:重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,约占细菌总蛋白的40％;纯化的重组蛋白经复性后具有直接抑制内皮细胞增殖的活性.结论: 重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,且表达的重组蛋白具有抑制内皮细胞生长作用,为研究其抗肿瘤作用打下了基础.     

人白细胞介素-18在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中实现人IL－18成熟蛋白（mhIL-18）的高效表达。方法 采用RT－PCR由人肝脏Kupffer细胞中扩增mhIL-18基因，构建非融合型原核表达质粒petTT/mhIL-18，转化至大肠杆菌DH5α，用IPTG诱导热处理重组蛋白表达，超声裂解细胞提取包涵体，采用SDS－PAGE及Western blot分析重组蛋白的表达，包涵体蛋白经8mol/L尿素溶解，透析复性，ELISA检测重组蛋白诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN－γ的能力。结果 所扩增的mhIL-18基因与GenBank公布的序列一到，经IPTG诱导，mhIL-18在大肠杆菌中的表达量占菌体蛋白的40％以上，，在细胞中以包涵体形式存在，复性的重组蛋白具有诱生IFN-γ的能力。结论 mhIL-18可在大肠杆菌中高效表达。     

人源抗-HBs Fab表达系统的转换与效果

目的:重新克隆抗-HBs Fab基因于pBAD载体,改变诱导方式与表达条件,提升原核表达人源抗体片段的经济性与实用性.方法:经3次基因扩增,分步克隆,将Fd、Lc与pBAD/Lc基因先后插入到pBAD载体中,形成单载体双启动、定向表达形式.筛选双重插入菌落,阿拉伯糖诱导表达,PAGE和Western印迹鉴定抗-HBs Fab的表达效果.结果:酶切克隆载体,琼脂糖电泳证实Fd和pBAD/Lc基因的正确插入;PAGE可见明显的相对分子质量近50 000的蛋白区带,Western印迹显示该区带确为Fab;HBsAg特异印迹表明表达产物具有抗原结合活性.结论:比较原pComb3表达系统,改变后的pBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量(可达70 mg/L)并保持了抗体活性,为该抗体的批量制备与临床应用提供了条件.     

在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素

目的 构建以融合蛋白形式在大肠杆菌中高效表达心钠素的重组质粒,稳定高效地获得基因工程产品心钠素。方法 采用PCR和亚克隆技术构建带有心钠素的融合基因并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。利用操纵子重复克隆提高表达量,以凝血酶切割融合蛋白释放心钠素小肽并通过柱层析纯化蛋白质。检定产品的各项理化指标和大鼠的体内降压,体内利尿和体外舒张血管等药理活性。结果 构建了4个高效表达和心钠素融合蛋白的质粒,分别含1-4个目的基因串联操纵子;通过温度诱导表达后,该系列表达的目的分别为菌体总蛋白的46%、54.8%、56.1%和60.1%;提取纯化包涵体形式的融合蛋白后,以凝血酶切割释放心钠素,再经纯化分离出心钠素,实验室摇瓶发酵每升培养液可获3mg以上的纯度大于96%的产品,产品具有利尿,降压和舒张血管的药理活性。结论 利用融合基因的克隆与表达成功地研制了人心钠素基因工程产品。     

汉滩病毒核蛋白在大肠杆菌中高效表达

提高汉滩病毒核蛋白的表达量，进一步研究核蛋白的功能，并利用其建立ＨＦＲＳ的血清学诊断方法。利用已有的含ＰＲＰＬ启动子的汉滩病毒核蛋白编码区的表达载体－Ｓ２２，通过酶切和连接的方法，将汉滩病毒Ｓ片段核蛋白的编码区基因插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１和ＧＳＴ基因的３’末端，构建了一种表达核蛋白的融合质粒－ｐＴＨａｎＳ。结果；经薄层扫描仪扫描，ｐＴＨａｎＳ核蛋白的表达量占细胞总蛋白量的３２％。并对     

人Era和人Era C端蛋白在大肠杆菌中的高表达

目的 在大肠杆菌中的高表达人Era和人EraC端蛋白。方法 PCR扩增人era基因（h-era)的全长cDNA和h-eraDNA的C端区域基因,h-eracDNA克隆到（His)6融合表达载体pRSET－C中,构建融合表达质粒并转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达（His)6-h-Era融合蛋白;h-eracDNA的C端区域基因克隆到非融合表达载体pDH中P1启动子下游,转化大肠杆菌ATP106,42℃热诱导表达人EraC端蛋白（h-Era-C),SDS-PAGE电泳、凝胶薄层扫描检测蛋白的表达。结果 表达的（His)6-h-Era融合蛋白产物占全工力总蛋白的80％;人EraC端蛋白占全菌总蛋白的40％。结论 人Era蛋白和EraC端蛋白在大肠杆菌中获得了高表达。     

在大肠杆菌中融合高效表达人MCP-1

目的：利用含强启动子的融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ对编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的基因进行高效表达。方法：基因重组技术及蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物占菌体蛋白的５０％ 。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测表明,表达产物可与抗ＭＣＰ－１ 抗体特异反应。生物学活性测定结果表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性。结论：融合蛋白对ＭＣＰ－１ 趋化活性无影响     

IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的：研究人IL-18成熟蛋白（mhIL-18）在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法：利用PCR方法扩增出mhIL-18基因，构建融合型表达载体pPTYB1-IL18，转化入大肠杆菌ER2566中，IPTG诱导表达，优化表达条件，超声裂解细胞，采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达，亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果：成功构建载体并转化入ER2566后，经IPTG诱导，表达量可占菌体总蛋白的26％以上，其中80％以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95％，具有显著的IL-18的生物学活性。结论：成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18，并具有显著的IL-18的生物学活性。     

人sCR1结合C3b结构域基因的克隆及在大肠杆菌中高效表达

目的克隆表达人可溶性补体受体1型(sCR1)结合C3b结构域基因.方法从外周血单核细胞中提取总RNA,RT-PCR克隆编码sCR1-SCR15-18的cDNA,连接pMD-18T载体进行DNA序列分析,再亚克隆pET32原核表达载体,构建pET32-sCR1-SCR15-18重组表达载体,转化BL21菌,用IPTG诱导表达,表达产物通过免疫印迹实验鉴定.结果获得了预期的扩增目的片段,成功构建了pMD-18T重组克隆载体,核苷酸测序结果与GenBank登录的人sCR1-SCR15-18 cDNA序列一致.成功的构建了原核表达载体pET32-sCR1-SCR15-18,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,并在菌体内形成包涵体.免疫印迹实验显示,在分子量约43×103处出现单一条带的阳性结果.结论从单核细胞中克隆出sCR1-SCR15-18片段基因,人sCR1-SCR15-18在大肠杆菌中得到高效表达.