The differential expression of HSV -1 UL12 gene in E.coil BL21 and E.coli Rosetta

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV -1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a - ULI2,比较重组表达质粒pET32a -UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性.方法 使用PCR的方法扩增出HSV -1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a - UL12,分别转化E.coli BL21和E coli Rosetta菌.经SDS - PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性.结果 重组质粒pET32a - UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高.结论 成功构建了表达出了具有较高活性的HSV -1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV -1药物奠定了基础.     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

黑色素瘤抗原-3原核重组质粒的构建及表达

目的 构建MAGE-3目的 基因原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆茵(E.coli)B121(DE3)中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的 基因,连接入原核表达载体pGEX-4T-1.构建MAGE-3目的 基因的原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并测序,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3 目的 基因并构建了原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21(DE3)中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的 蛋白.结论 成功构建的原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.     

融合头的改变对抑制重组抗菌肽毒性的影响

为进一步完善G13结构域的原核表达系统,人工合成编码G13的基因片段,PCR扩增后克隆于原核表达载体pET28a中,构建的重组质粒pET28a-G13转化于E.coli BL21(DE3)中.另外对pET28a-G13进行突变,改变其G13片段N端上游处的融合头的电荷数,转化于E.coli BL21(DE3)中.构建pThiohisA突变体并与pET28a-G13共转化于E.coli BL21(DE3)中.用诱导剂诱导所构建的各个工程菌,然后比较A_(600)值变化及蛋白表达量,分析不同的融合头对G13毒性抑制效果,发现融合头对G13毒性抑制效果与其净负电荷数及酸性氨基酸的相对位置有关.     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

CREKA/tTF融合蛋白表达及活性鉴定

目的制备用于靶向肿瘤血管中的凝血血浆蛋白的CREKA/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术构建CREKA与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中表达,镍亲和色谱柱纯化,梯度透析复性。利用凝血时间,结合荧光定量测定等实验在体外鉴定该融合蛋白的活性。结果获得序列正确的CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coli BL21中高效表达。纯化后的融合蛋白具有引起血液凝固的功能,且能与凝血血浆蛋白结合。结论成功构建CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,CREKA/tTF融合蛋白具有TF凝血活性及CREKA的结合活性。     

蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌.方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E-coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-TCMPK和pET28a(+)表达载体.连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定.用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析.结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6～0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显.结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础.     

AcAP5蛋白N端片段的表达、纯化与活性评价(英文)

犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma anticoagulant peptide 5,AcAP5)N端40个氨基酸片段(N40)含有与FXa结合的结构域。为研究N40的FXa抑制作用,我们克隆、表达和纯化了N40,并检测其生物活性。用PCR扩增N40基因;将PCR产物克隆至原核表达载体pET-30a中,构建质粒pET30a-N40;将其转化入大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定,经过镍柱亲和层析纯化,用BCA法进行蛋白定量,测定该蛋白抑制FXa的活性。限制性酶切鉴定和基因测序结果显示重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示目的蛋白在E.coli.BL21(DE3)中为可溶性表达,亲和层析纯化后获得了纯度约90%的蛋白,经活性鉴定该蛋白确有抑制FXa的活性。     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

不相容双质粒共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅因子合成酶基因caiE

基因caiB和基因caiE分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶，携带这两个基因的重组菌可以共表达两个外源蛋白，得到高活性肉碱脱水酶。分别构建这两个基因的表达质粒pET28caiB和pET22caiE，利用双抗生素筛选法，获得能稳定遗传的双质粒转化子。经IPTG诱导，两个基因共表达，表达量分别占菌体总蛋白的39％和20％，共转化菌的酶活力比pET28caiB单转化菌提高了2．3倍，并由此建立了不相容质粒共表达外源基因的新方法。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定

利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶(L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化入BL21(DE3)。乳糖诱导使其表达,其中80%以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质。将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95%以上。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性。     

幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因的表达、纯化与活性检测

目的高效表达幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶(PDF)蛋白。方法以PCR方法克隆肽脱甲酰基酶基因(def),构建了融合表达载体pET-32a-def,在宿主菌BL21中进行了诱导表达。结果重组产物获高效表达,部分产物以可溶状态存在,经纯化后具有肽脱甲酰基酶活性。结论为PDF特性分析及PDF抑制剂筛选奠定了基础。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链结构类似多肽融合蛋白的制备

为了在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)与胰岛素B链(9-23)肽段结构类似多肽(Ins B(9-23))的融合蛋白,使用基因工程方法构建了CTB与Ins B(9-23)的融合基因CTB-Ins B-X若干,并将融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌株经乳糖诱导后,其表达产物经过12%SDS-PAGE分析表明该菌株可以包含体形式表达融合蛋白,并制备得到纯度较高的重组蛋白。该重组蛋白的包含体经过变性、复性后,可以在体外自组装成五聚体结构。GM1-ELISA分析结果表明,重组蛋白在体外可以与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合,表明该融合蛋白保持了CTB形成五聚体的生物活性。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。