槟榔碱对口腔角质形成细胞端粒酶逆转录酶表达的影响

目的：观察槟榔碱对人口腔角质形成细胞（KC）端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA及蛋白表达的影响，进一步探讨hTERT在口腔黏膜下纤维性变（OSF）癌变过程中的作用机制。方法：体外培养正常口腔黏膜的上皮细胞，将实验细胞分为0．03、0．06、0．09g／L槟榔碱组、空白对照组。采用Western印迹法和RT-PCR方法观察槟榔碱对KC hTERT mRNA及蛋白表达的影响。结果：槟榔碱能呈剂量依赖性增加KC hTERT mRNA及蛋白表达，0．03、0．06、0．09g／L槟榔碱组hTERT mRNA及蛋白表达均高于空白对照组（P〈0．05）。结论：槟榔碱对KChTERT mRNA与蛋白表达有明显诱导作用，且在一定范围内呈剂量依赖关系，槟榔碱诱导KChTERT过度表达可能在OSF癌变过程中起重要作用。     

岩黄连脱氢卡维丁体外抑制Tca8113增殖及对端粒酶活性影响的研究

目的：研究中草药岩黄连脱氢卡维丁（Tetradehydroscoulerine，YHL－1）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用，及其对端粒酶活性和端粒酶催化亚基（hTERT）表达的影响，探讨其抗癌机制。方法：采用噻唑蓝比色法（MTT法）检测不同浓度的YHL-1对Tca8113细胞增殖的影响，同时以TRAP—ELISA法检测Tca8113细胞端粒酶活性改变情况，并用Western blotting法半定量检测端粒酶hTERT的表达。结果：YHL-1能明显抑制Tca8113细胞增殖，且随时间延长和药物浓度的增高，抑制作用增强。72h时，0．200、0．100、0．050、0．025 g／LYHL-1组细胞增殖抑制率分别为（64．1±1．5）％、（47．3±3．3）％、（35．6±5．0）％、（31．8±5．87）％。72 h时，0．100、0．050 g／L组端粒酶活性和hTERT蛋白含量均低于空白对照组（P〈0．05）。结论：岩黄连脱氢卡维丁可以明显抑制Tca8113细胞的增殖，并显著降低其端粒酶活性及hTERT的表达，这可能是其抗舌癌的机制之一。     

槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞分泌整合素α2的影响

目的：通过研究槟榔碱对体外培养的人口腔黏膜成纤维细胞（FB）表达整合素α2的影响,探讨整合素α2在口腔黏膜成纤维性变（OSF）发病机制中的可能作用。方法：体外培养人正常口腔黏膜成纤维细胞（FB）,培养基中加入不同浓度（0、10、20、40、80、160μg/ml）的槟榔碱孵育,MTT法12h后检测FB的增殖水平。RT-PCR法24h后检测0、10、20、40μg/ml浓度组整合素α2mRNA的表达水平。结果：槟榔碱浓度为20μg/ml时,FB增殖活性开始下降,与对照组相比无统计学差异（p〉0.05）,40μg/ml时下降明显与对照组相比有统计学差异（p〈0.05）。正常对照组整合素α2mRNA表达量低,随槟榔碱浓度增高其表达量呈增高趋势（p〈0.05）。结论：槟榔碱具有刺激FB表达整合素α2的作用,提示FB分泌整合素α2增多,进而诱导胶原合成增多,可能是OSF发生机制之一。     

槟榔碱预处理后的Hacat细胞及人口腔黏膜成纤维细胞中AngⅡ及AT1R蛋白的表达研究

目的:通过检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)在不同浓度槟榔碱预处理后的Hacat细胞及人口腔黏膜成纤维细胞(OMFB)中的表达与分布情况,了解槟榔碱对这两种细胞表达AngⅡ及AT1R的影响,探讨口腔黏膜下纤维性变(OSF)可能的发病机制。方法:采用免疫细胞化学SABC法,分别测定AngⅡ及AT1R兔抗人多克隆抗体在Hacat细胞和OMFB及分别在20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL槟榔碱预处理后的这两种细胞中的表达与分布情况。结果:①0～80μg/mL槟榔碱预处理后Hacat细胞中AngⅡ蛋白均有表达,80μg/mL预处理组阳性细胞数高于其余3组,差别有统计学意义(P<0.01)。②对照组及20μg/mL槟榔碱干预组Hacat细胞中未见明显AT1R蛋白表达,40μg/mL槟榔碱干预组细胞中AT1R蛋白弱阳性表达,80μg/mL槟榔碱干预组细胞AT1R蛋白呈阳性表达,表达有显著性差异(P<0.01)。结论:一定浓度的槟榔碱可以诱导Hacat细胞中AngⅡ及AT1R蛋白的表达升高,且二者的表达多位于发生了形态学变化的细胞上,推测AngⅡ及AT1R可能参与了槟榔碱的致OSF进程。     

尼古丁上调口腔鳞状细胞癌抗氧化蛋白Prx1的表达

目的：探讨口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中抗氧化蛋白Prx1与烟草诱导的氧化应激的相关性。方法：采用RT-PCR、Western Blot方法,观察尼古丁作用相同时间（48h）不同浓度（0.1、1、10、100μmol/L）及同一浓度（1μmol/L）不同时间（24、48、72h）对Tca8113细胞Prx1mRNA及蛋白表达的影响。结果：尼古丁可诱导Tca8113细胞Prx1mRNA和蛋白表达增加。结论：Prx1表达增高可能与烟草诱导的氧化应激有相关性,在烟草诱导的OSCC发生发展中可能发挥重要作用。     

TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达的影响及姜黄素对其影响的作用

目的:探讨TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达的影响及姜黄素对其影响的作用。方法:体外培养口腔黏膜成纤维细胞,分别用100～10 000 U/mL TNF-α和10～40μg/mL槟榔碱作用于细胞24～72 h, CCK-8实验检测细胞增殖,ELISA测定细胞中羟脯氨酸的表达。用5～40μmol/L的姜黄素作用于2种处理的细胞,检测细胞增殖和羟脯氨酸蛋白的表达。结果:TNF-α促进细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达(P<0.05),槟榔碱抑制细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达(P<0.05)。40μmol/L的姜黄素作用于TNF-α和槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞,在24 h和48 h时抑制细胞增殖(P<0.05)。不同浓度的姜黄素作用于TNF-α和槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞,均能抑制羟脯氨酸合成(P<0.05)。结论:TNF-α可促进口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达,槟榔碱能抑制口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达,较高浓度姜黄素能减弱TNF-α的刺激作用,增强槟榔碱的抑制作用。     

整合素α1在口腔黏膜下纤维性变发病机制中的作用

目的:观察口腔黏膜下纤维性变(OSF)组织中整合素α1的表达与分布,及槟榔碱对体外培养的人口腔黏膜成纤维细胞(FB)表达整合素α1mRNA的影响,探讨整合素α1在OSF发病中的作用与机制.方法:①采用免疫组织化学染色方法,观察整合素α1在10例正常口腔黏膜组织和OSF早、中、晚期各20例病变组织中的表达与分布,并采用半定量方法检测正常口腔黏膜组和OSF各组FB上整合素α1的表达强度.②采用RT-PCR法检测体外培养FB分别在0、10、20、40μg/ml浓度组别槟榔碱刺激下,整合素α1mRNA的表达水平.结果:①正常口腔黏膜组织中,整合素α1表达低,主要分布于上皮基底细胞和血管内皮细胞,呈胞膜或胞质阳性,FB极少见阳性表达;而OSF病变组织中,除表皮基底细胞及血管内皮细胞外,FB细胞膜及胞质内均见整合素α1的大量表达,炎症细胞上亦可见少量表达.OSF各期FB表达整合素α1均强于正常组(P<0.05),早中期组表达增高,晚期组表达降低,与中期组有统计学差异(P<0.05).②对照组整合素α1mRNA表达量低,在槟榔碱10、20 μg/ml浓度组表达逐渐升高与对照组存在显著性差异(P<0.05).40μg/ml组出现下降与10μg/ml组无显著性差异(P>0.05);结论:槟榔碱通过刺激口腔黏膜FB表达与分泌整合素α1,进而诱导胶原合成增多,可能是OSF发生机制之一.     

槟榔碱对HaCaT细胞增殖活性及S100A7 mRNA表达的影响

目的：通过检测角质形成细胞株HaCaT在不同浓度的槟榔碱刺激下,其生长增殖活性的变化,以及槟榔碱浓度升高对HaCaT细胞S100A7 mRNA表达的影响,进一步探讨口腔粘膜下纤维性变（oral submucous fibrosis,OSF）的发病机制。方法：应用不同浓度槟榔碱处理HaCaT细胞24h,采用MTT法检测HaCaT细胞增殖活性的改变;采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测HaCaT在槟榔碱浓度升高刺激后细胞中S100A7 mRNA表达的变化。结果：高浓度（80～320mg/L）的槟榔碱抑制HaCaT细胞的增殖（P〈0.05）,80、160和320mg/L的槟榔碱相对于未加入槟榔碱的对照组分别使细胞数量下降到89%、84%和61%,对细胞增殖的抑制分别为11%、16%和39%;而在相对较低的槟榔碱浓度（0～40mg/L）下未见对HaCaT细胞的增殖有明显抑制或促进作用。高浓度槟榔碱处理后的细胞可以见到明显的形态改变。浓度为40～80mg/L的槟榔碱轻度上调HaCaT细胞中S100A7 mRNA的表达（P〈0.05）。结论：较低浓度的槟榔碱对于HaCaT细胞的生长没有明显的抑制与促进作用,高浓度的槟榔碱能显著抑制HaCaT细胞的生长。槟榔碱对HaCaT细胞具有细胞毒性。槟榔碱在一定浓度下可以诱导HaCaT细胞S100A7 mRNA的表达增加。S100A7基因及其编码蛋白可能在口腔粘膜下纤维性变的发病中起了重要作用。     

涎腺肿瘤中hTERT mRNA表达的研究

目的：探讨端粒酶逆转录酶（hTERT）在涎腺肿瘤中的表达及意义。方法：采用原位杂交技术检测83例涎腺组织石蜡切片标本hTERT mRNA的表达，包括正常涎腺对照组10例，良性肿瘤30例，恶性肿瘤43例，并分析其与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位和组织学分化程度之间的关系。结果：对照组涎腺组织hTERT mRNA的阳性表达率为0％（0／10），良性肿瘤hTER mRNAT的阳性表达率为3．3％（1／30），恶性肿瘤hTERT mRNA阳性的表达率为83．7％（36／43）。hTER mRNA在涎腺肿瘤良性、恶性中的表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。hTERT mRNA在涎腺恶性肿瘤组织中的表达与患者性别、年龄、以及肿瘤大小、部位、分化程度无相关性。结论：hTERT mRNA表达的检测可以作为鉴别涎腺良恶性肿瘤的良好指标。     

硫代磷酸化反义寡核苷酸对耐放疗舌癌细胞MDR1基因和P-gp表达的抑制作用

目的：研究反义硫代磷酸化寡核苷酸（phosphorothioate antisense oligonuc leotide,PS—ASOs）抑制人舌癌细胞耐放疗株Tca 8113多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1,MDR1）以及MDR1蛋白（P-gp）表达的作用。方法：人工合成互补于MDR1基因mRNA特定片断的硫代磷酸化正反义寡核苷酸;PS—ASOs浓度分别为0．1μmol／L,0．25μmol／L,0．5μmol／L,以正义寡核苷酸作为实验对照,未转染的耐放疗组为空白对照,以5μl／ml脂质体Lipofectamine为载体转染耐放疗的Tca8113细胞株;逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）测定转染后MDR1 mRNA表达,流式细胞技术（FCM）测定细胞膜P—gp表达。结果：与正义组和空白对照组相比,转染PS—ASOs后12h,MDRI mRNA和P—gP表达降低,转染24h,各剂量组表达均降至最低,在转染48h后,基本恢复到转染前水平,而正义组和空白对照组在各时段及各剂量组均无统计学差异;双因素方差分析：PS—ASOs不同浓度（P=0．00）、不同作用时间仳0．00）对下调MDRI mRNA、P—gp表达差异显著,结论：PS—ASOs能降低MDR1基因以及蛋白的表达;PS—ASOs的作用具有浓度依赖性和时间依赖性。     

槟榔碱诱导口腔角质形成细胞凋亡研究

目的:了解槟榔碱(arecoline)对体外培养的人口腔黏膜角质形成细胞(keratinocyte,KC)凋亡的影响。方法:不同浓度的槟榔碱以及在不同时间处理体外培养的KC,在荧光显微镜下观察KC凋亡形态学改变并计算凋亡百分率,用比色法检测Caspase-3活性的改变。结果:1)槟榔碱能以一定时间和浓度依赖方式诱导培养的KC发生凋亡,其细胞凋亡率较正常对照组明显增高(P<0.05)。2)槟榔碱作用KC,其Caspase-3活性较正常对照组明显增高(P<0.05)。结论:槟榔碱可诱导KC凋亡,Caspase-3可能参与了这一细胞凋亡过程的调控。KC凋亡异常可能是口腔黏膜下纤维性变的重要发病机理之一。     

槟榔碱对口腔黏膜肌成纤维细胞分化的影响

目的探讨口腔黏膜下纤维性变组织中肌成纤维细胞的来源。方法通过体外口腔黏膜角质形成细胞和成纤维细胞共培养，用免疫组化、反转录聚合酶链反应等方法观察α-平滑肌肌动蛋白的表达。结果体外培养的口腔黏膜下纤维性变成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白的阳性率为（85.80±3.56）％，正常口腔黏膜成纤维细胞中阳性率为（3.82±0.76）％。槟榔碱直接干预成纤维细胞后α-平滑肌肌动蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义（P〉0.05）；角质形成细胞与成纤维细胞共同培养组成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白的表达增强；角质形成细胞经槟榔碱预处理后与成纤维细胞共同培养组α-平滑肌肌动蛋白的表达强于无干预共同培养组。结论口腔黏膜下纤维性变组织中成纤维细胞向肌成纤维细胞分化可能是槟榔成分与角质形成细胞共同作用的结果。     

Effects of nicotine on proliferation, cell cycle, and differentiation in immortalized and malignant oral keratinocytes

BACKGROUND: Numerous epidemiological studies have reported that tobacco smoking is a major risk factor for oral cancer, but relatively little is known about the effect of nicotine, a major product of cigarette smoking, on immortalized oral keratinocytes and cancer cells. METHODS: We investigated the effects of nicotine on the growth and differentiation of immortalized human oral keratinocytes (IHOK), primary oral cancer cells (HN4), metastatic oral cancer cells (HN12), and human skin keratinocytes (HaCaT), in the monolayer and in the three-dimensional (3D) raft cultures using the MTT assay, Western blotting, and cell cycle analysis. RESULTS: Nicotine inhibited the proliferation of immortalized and malignant keratinocytes in dose- and time-dependent manners as determined by MTT assay. The 3D organotypic culture showed that nicotine at high concentration (300 microM) inhibits epithelial maturation, surface keratinization, and decreased epithelial thickness. Flow cytometry showed that nicotine inhibited cell cycle progression by inducing G(0)/G(1) arrest of HaCaT, IHOK, HN4, and HN12 cells without causing apoptosis. Nicotine treatment increased p21 expression in immortalized cells (HaCaT, IHOK) and oral cancer cells (HN4, HN12), but decreased pRb and p53 expression in oral cancer cells. Moreover, after high-dose nicotine treatment, the involucrin expression increased markedly in immortalized cells, but not in oral cancer cells. CONCLUSIONS: We demonstrated that nicotine inhibits growth through cell cycle arrest at G(0)/G(1) phase probably by increasing the expression of p21(WAF1/CIP1). Nicotine also affects epithelial differentiation in immortalized and malignant oral keratinocytes. Malignant oral keratinocytes appear to be more resistant to the effects of nicotine on epithelial growth and differentiation as compared to the immortalized cells.     

茶多酚对舌鳞状细胞癌细胞增殖和端粒酶催化亚基的抑制作用

目的观察茶多酚对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖和端粒酶催化亚基(hTERT)的影响。方法实验分0.025、0.050、0.100、0.200g/L茶多酚组和空白培养基组。采用噻唑蓝比色法检测茶多酚对Tca8113细胞增殖的影响,逆转录PCR法检测hTERT基因表达,Western-blot法测定细胞中hTERT蛋白表达量。所有数据采用ANOVA单因素方差分析和Student-Newman-Keuls检验进行统计学检验。结果茶多酚能明显抑制Tca8113细胞增殖,并存在时间和浓度依赖性。72h时,0.200、0.100、0.050和0.025g/L茶多酚组细胞增殖抑制率分别为69.75%±3.24%、63.17%±3.19%、50.35%±4.21%和34.75%±3.71%。72h时,0.100、0.050g/L组hTERT mRNA和蛋白表达均低于空白对照组(P<0.05)。结论茶多酚能够抑制人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株的增殖及端粒酶催化亚基的转录和表达,抑制端粒酶催化亚基可能是茶多酚抗舌癌的机制之一。     

Adverse effects of arecoline and nicotine on human periodontal ligament fibroblasts in vitro

BACKGROUND, aims: The habit of betel nut chewing impinges on the daily lives of approximately 200 million people. Betel quid chewers have a higher prevalence of periodontal diseases than non-chewers. This study examined the pathobiological effects of arecoline, a major component of the betel nut alkaloids, on human periodontal ligament fibroblasts (PDLF) in vitro. METHOD: Cell viability, proliferation, protein synthesis, and cellular thiol levels were used to investigate the effects of human PDLF exposed to arecoline levels of 0 to 200 microg/ml. In addition, nicotine was added to test how it modulated the effects of arecoline. RESULTS: Arecoline significantly inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner. At concentrations of 10 and 30 microg/ml, arecoline suppressed the growth of PDLF by 20% and 50% (p < 0.05), respectively. Arecoline also decreased protein synthesis in a dose-dependent manner during a 24-h culture period. A 100 microg/ ml concentration level of arecoline significantly inhibited protein synthesis to only 50% of that in the untreated control (p < 0.05). Moreover, arecoline significantly depleted intracellular thiols in a dose-dependent manner. At concentrations of 25 microg/ml and 100 microg/ml, arecoline depleted about 18% and 56% of thiols (p < 0.05), respectively. This suggests that arecoline itself might augment the destruction of periodontium associated with betel nut use. Furthermore, the addition of nicotine acted with a synergistic effect on the arecoline-induced cytotoxicity. At a concentration of 60 microg/ml, arecoline suppressed the growth of PDLF by about 33% and 5 mM nicotine enhanced the arecoline-induced cytotoxic response to cause about 66% cell death. CONCLUSION: During thiol depletion, arecoline may render human PDLF more vulnerable to reactive agents within cigarettes. Taken together, people who combine habits of betel nut chewing with cigarette smoking could be more susceptible to periodontium damage than betel nut chewing alone.     

Heat shock protein 27 expression in areca quid chewing-associated oral squamous cell carcinomas

Oral Diseases (2012) 18 , 713–719 Objectives: Heat shock protein (HSP) 27 is a low‐molecular‐weight protein that functions as a molecular chaperone and plays a cytoprotective role through its antioxidant activity during cell stress. Areca quid chewing is associated with the high incidence of oral squamous cell carcinomas (OSCCs) in Taiwan. The aim of this study was to compare heat shock protein 27 (HSP27) expression in OSCCs and the normal oral tissues. Methods: Forty‐eight OSCCs from areca quid chewers and ten normal oral tissue biopsy samples without areca quid chewing were analyzed by immunohistochemistry for HSP27. The normal human oral keratinocytes (HOKs) were challenged with arecoline, the major alkaloid of areca nut, by Western blot for HSP27. Furthermore, epigallocatechin‐3 gallate (EGCG), glutathione precursor N‐acetyl‐l ‐cysteine (NAC), cyclooxygenase‐2 inhibitor NS‐398, HSP inhibitor quercetin, extracellular signal‐regulated protein kinase (ERK) inhibitor PD98059, and p38 inhibitor SB203580 were added to find the possible regulatory mechanisms. Results: Heat shock protein 27 exhibited higher expression in OSCCs than normal specimens (P < 0.05). Arecoline was found to elevate HSP27 expression in a dose‐ and time‐dependent manner (P < 0.05). The additions of pharmacological agents were found to inhibit arecoline‐induced HSP27 expression (P < 0.05). Conclusions: Heat shock protein 27 expression is significantly elevated in areca quid chewing‐associated OSCCs. Arecoline‐induced HSP27 expression was downregulated by EGCG, NS398, NAC, quercetin, PD98059, and SB203580.