RNA干扰Caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用

目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果.方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8 shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8 shRNA的细胞系.实验分为3组,(1)正常对照组,未转染的RK3E细胞;(2)阴性对照组,转染空载体pRNAT-U 6.1的RK3E细胞系;(3)实验组,转染caspase-8 shRNA的RK3E细胞系.经脂多糖孵育12 h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR和Real time PCR检测mRNA的表达,以及各组caspase-8蛋白的活性.结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),caspase-8的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P＜0.01).结论:针对caspase-8的特异性shRNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制细胞凋亡的发生.     

乙型肝炎病毒X基因对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响及其机制

目的:研究乙型肝炎病毒X基因(HBX)对HepG2细胞生物学行为的影响及机制.方法:HepG2瞬时转染HBX真核表达载体pcDNA3.1-HBX(HepG2/HBX),转染pcDNA3.1的HepG2细胞和未转染任何质粒的HepG2细胞分别作为空白对照组和阴性对照组.转染后48 h收集细胞,流式细胞仪分析细胞凋亡率的变化;transwell检测细胞侵袭能力;RT-PCR检测PEG10 mRNA表达量的变化.结果:实验组细胞凋亡率为(4.8±1.8)％,空白和阴性对照组细胞凋亡率分别为(12.9±1.4)％和(11.7±2.2)％,P＜ 0.05.实验组细胞体外侵袭力增强(P＜0.05),PEG10基因的表达水平明显上调(P＜0.05).结论:HBX通过上调PEG10的表达,抑制HepG2细胞凋亡并增强其体外侵袭能力.     

慢病毒介导的RNA干扰HMGA2基因表达对HL-60细胞增殖及细胞周期素B2、A2表达的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰沉默高迁移率族蛋白A2(HMGA2)基因表达对人急性白血病细胞系HL-60细胞增殖及细胞周期素(cyclin) B2、cyclin A2表达的影响.方法 制备表达HMGA2基因短发夹RNA(shRNA)的重组慢病毒载体,转染HL-60细胞.通过半定量RT-PCR和Western blot检测特异性shRNA转染后HL-60细胞HMGA2基因表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术(FCM)检测细胞周期; RT-PCR及Western blot检测cyclin B2、cyclin A2 mRNA和蛋白表达水平.结果 RT-PCR和测序证实,成功构建了表达HMGA2 shRNA的重组慢病毒载体;RT-PCR和Western blot证实经嘌呤霉素筛选出的阳性克隆转染的HL-60细胞HMGA2 mRNA和蛋白表达水平与空载体组相比明显受抑,抑制率分别达(80.66 ± 7.98)%和(76.35±12.72)%;CCK-8比色结果显示,HMGA2表达受到稳定干扰的HL-60细胞增殖活力明显受到抑制,细胞增殖曲线低平,缺乏指数增殖特征.FCM检测显示,与对照组相比,转染特异性shRNA的HL-60细胞出现了明显的G2/M期阻滞,G2/M期细胞分别为(13.90±4.07)%和(30.00±5.78)%(P<0.05).HMGA2特异性shRNA转染的HL-60细胞cyclin B2 mRNA和蛋白表达与未转染细胞相比,抑制率分别为(67.55±7.69)%和(51.77±4.81)%(P<0.01).而cyclin A2的表达无明显改变.结论 HMGA2基因沉默可下调cyclin B2表达,从而使细胞出现明显的增殖抑制和G2/M期阻滞.     

干扰HMGA2基因表达抑制HL60细胞的增殖及浸润

目的:探索干扰高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)基因的表达对HL-60白血病细胞体外增殖、浸润的影响。方法:实验分为3组,实验组为稳定转染慢病毒干扰HMGA2基因表达载体的HL-60细胞;阴性对照组为稳定转染慢病毒空载体HL-60细胞;空白对照组为未转染的HL60细胞。3组分别接种BALB/c裸鼠建立种植瘤模型,检测接种后各个时间点裸鼠外周血和骨髓中白血病细胞的比例(肿瘤负荷)、生活质量,计算接种40 d后各组小鼠的肝脾指数。结果:RTPCR及Western印迹证明干扰RNA慢病毒表达载体可明显降低HL-60细胞靶基因的表达。接种后骨髓涂片结果显示裸鼠白血病模型成功建立。接种后21,28,40 d,实验组HL-60细胞在小鼠外周血和骨髓中的比例均明显低于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义(P0.05),其白血病细胞比例随接种时间延长而增加的速度亦明显变缓;且实验组小鼠萎糜少动、腹部膨隆、皮下结节等并发症出现时间明显较空白对照组及阴性对照组延迟;接种40 d后实验组小鼠肝脾指数分别为66.76±5.56和20.57±0.75,均明显低于其余两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:干扰HMGA2基因表达,可明显抑制HL60白血病细胞在小鼠体内增殖、浸润。     

MicroRNA-9对口腔鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的检测miR-9在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织和细胞中的表达水平,探讨miR-9对OSCC细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法收集42例OSCC患者肿瘤及癌旁组织标本。将SCC-9细胞分为3组:miR-9 mimics组,转染对照组(miR-NC)和未转染组(空白组)。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织样本和细胞中miR-9的表达水平,体外实验通过转染miR-9 mimics至SCC-9细胞中,平板克隆形成试验和流式细胞术检测细胞增殖凋亡情况。Pearson相关分析分析miR-9与人高迁移率族AT Hook蛋白2(HMGA2)的相关性;荧光素酶试验,qRT-PCR和蛋白质印迹技术(Western blot)验证HMGA2是miR-9的靶基因。结果与癌旁组织和正常口腔角化细胞相比,miR-9在OSCC组织和细胞中的表达下调(P0.05);体外实验发现,与空白组和miR-NC组相比,miR-9mimics组的细胞增殖受到抑制,而凋亡比率增加(P0.05)。机制研究结果表明,OSCC组织中HMGA2 mRNA和蛋白的表达均增加(P0.05),并与miR-9成显著负相关(r=-0.7701,P0.001);荧光素酶结果显示,miR-9能直接与HMGA2-3'-UTR靶向结合;成功转染miR-9 mimics后能降低SCC-9细胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表达(P0.05)。结论在OSCC中,miR-9表达下调;miR-9能够降低HMGA2表达,抑制OSCC细胞增殖,促进其凋亡。     

miR-29b 对缺血损伤心肌细胞模型的自噬影响及分子机制研究

目的　探讨与研究微 RNA-29b ( miR-29b) 对缺血损伤心肌细胞模型自噬的影响及分子机制。方法　将已经建立缺氧 / 复氧模型的心肌细胞系 (H9C2) 随机分为三组:空白组、对照组与实验组 , 以 life2000 TM 为载体体外转染磷酸盐缓冲液 (PBS)，miRNA 对照质粒（miR-NC）与 miR-29b，检测细胞自噬、增殖水平与氧化自由基等表达变化情况。结果　细胞转染后 24h 与 36h，三组 miR-29b mRNA 表达水平，细胞增殖指数相比差异有统计学意义（F=9.284~81.871,均 P ＜ 0.05），其中实验组与空白组及对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05），空白组与对照组相比差异无统计学意义 (P ＞ 0.05)。细胞转染后 24h 与 36h，三组 HIF-1α，LC-3 蛋白相对表达量及 SOD 活力，MDA 含量相比差异具有统计学意义（F=9.133~15.693, 均 P ＜ 0.05），其中实验组与空白组及对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05)，空白组与对照组对比差异无统计学意义 (P ＞ 0.05)。结论　miR-29b 能通过正向调节 HIF-1α 和 LC-3 的相对表达量来提高SOD 活性，降低 MDA 含量，从而促进细胞自噬，发挥对缺血损伤心肌细胞的保护作用。     

以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染类风湿关节炎患者软骨细胞对aggrecanase-2 mRNA表达的干扰作用

目的研究以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染类风湿关节炎(RA)患者软骨细胞对aggrecanase-2 mRNA表达的干扰作用。方法回顾性分析2015~2016年确诊为活动期或者是中晚期的RA患者30例,并在关节置换术中切除患者膝关节的软骨块,冲洗软骨块,并使用0.25%胰酶和0.20%的Ⅱ型胶原酶模拟体温在36.8℃的恒温水浴箱内让其自行消化25~35 min,离心,取其沉淀并加入一定量的10.00%胎牛血清的DMEM培养基内培养,最终取其培养的第2~3代软骨组织。将设计好的慢病毒载体介导的aggrecanase-2 shRNA转染进RA患者的软骨细胞中。按照慢病毒剂量,将细胞分为200μl(A组)、100μl(B组)、50μl(C组)。其中,A组分为空白对照组、阴性对照组、aggrecanase-2 shRNA1组(shRNA1组)、aggrecanase-2 shRNA2组(shRNA2组)、aggrecanase-2 shRNA3组(shRNA3组)、aggrecanase-2 shRNA4组(shRNA4组)。各孔加入促转染剂约3~7μm/ml,其中阴性对照为含杂乱序列的病毒液,空白对照组则用培养基来代替病毒。利用PCR技术定量检测转染之后由各种转染复数转染的aggrecanase-2和aggrecanase mRNA在各种的时间段内的表达系数。结果加入慢病毒之后的A、B、C三组RA患者的感染复数分别为100、50、25,转染效率分别为91.21%、59.98%、31.09%。以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染的RA患者的软骨细胞的aggrecanase-2 mRNA的表达水平明显有所降低,差异具有统计学意义(P0.05)。随着时间的增加,各组aggrecan蛋白表达水平出现明显的变化,其中shRNA4组升高最为明显,差异具有统计学意义(P0.05)。结论以慢病毒为载体介导的aggrecanase-2 shRNA转染的RA患者的软骨细胞中的aggrecanase-2 mRNA的表达受到明显的抑制,但是其对RA患者的软骨组织没有实质上和功能上的伤害;同时其还可以通过抑制aggrecanase-2 mRNA的表达来促进aggrecan蛋白的表达,从而起到保护软骨组织退化的作用。     

Prdx2基因表达情况对结直肠癌SW480细胞影响作用分析

目的探讨硫氧还蛋白过氧化物酶2(Prdx2)基因表达对结直肠癌SW480细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法采用慢病毒空载体(空白组)、干扰片段(Prdx2-shRNA)慢病毒载体转染结直肠癌SW480细胞(实验组),野生型结直肠癌SW480细胞作为对照组,分别于转染后培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h采用MTT法检测SW480细胞增殖情况,采用流式细胞仪技术检测培养120 h后细胞的凋亡率,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRt-PCR)及Westernblot法检测Prdx2、Survivin mRNA及蛋白的表达,采用Transwell侵袭实验检测SW480细胞的侵袭能力。结果实验组的W480细胞凋亡率显著高于空白组和对照组(P0.05),培养48 h、72 h、96 h、120 h,实验组的W480细胞增殖能力明显低于空白组和对照组(P0.05),实验组的SPrdx2、Survivin mRNA及蛋白相对表达水平显著低于空白组和对照组(P0.05);Transwell侵袭实验结果显示,实验组的转染结直肠癌SW480细胞侵袭能力强于空白组和对照组(P0.05)。结论 Prdx2基因沉默会抑制结直肠癌SW480细胞的增殖、促进凋亡,但是会增强结直肠癌SW480细胞的侵袭能力。     

Cdx2-siRNA对胃癌细胞Survivin和Caspase-9表达的影响

目的:观察Cdx2小分子干扰RNA(Cdx2-siRNA)对人胃癌MGC-803细胞凋亡及Survivin、Caspase-9表达的影响。方法:设计合成针对Cdx2基因的siRNA寡核苷酸以及阴性对照siRNA。将人胃癌MGC-803细胞接种于培养板中,分为3组,正常对照组不作处理,阴性对照组和Cdx2-siRNA组分别用LipofectamineTM2000将阴性对照siRNA或Cdx2-siRNA成功转染进细胞内。应用流式细胞仪检测转染24h时MGC-803细胞凋亡的变化,并应用RT-PCR和Western blot技术检测胃癌MGC-803细胞中Survivin和Caspase-9基因mRNA和蛋白的表达。结果:Cdx2-siRNA组MGC-803细胞的凋亡率为(12.5±0.6)%,明显高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);Cdx2-siRNA组Survivin mRNA和蛋白的表达量分别为(0.14±0.04)和(0.51±0.12),明显低于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);Cdx2-siRNA组Caspase-9 mRNA和蛋白的表达量分别为(0.98±0.24)和(1.78±0.41),明显高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);而阴性对照组和正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Cdx2-siRNA促进人胃癌细胞的凋亡,其机制可能与其抑制Survivin的表达、增强Caspase-9的活性有关。     

Vpr抑制人大肠癌细胞株HT-29增殖及调节存活素表达的研究

目的观察I型人类免疫缺陷病毒蛋白R(Viral protein R、Vpr)在体外对大肠癌细胞HT-29增殖抑制及探索Vpr对HT-29细胞存活素(Survivin)表达的调节作用。方法应用腺病毒转染系统将Vpr基因以不同感染复数转染至HT-29细胞。MTT法检测Vpr对HT-29细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡变化。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(western blot)法检测mRNA水平和蛋白水平上Survivin的表达。结果实验组可见Vpr蛋白的表达;实验组大肠癌细胞HT-29增殖受到抑制(MOI=200),从转染72h开始,实验组MTT值与对照组及空载体组比较差异均具有有统计学意义(P0.05),随着时间的延长,抑制逐渐增强;转染72h后(MOI=200),实验组细胞凋亡率与对照组及空载体组比较均差异具有显著统计学意义(P0.01);实验组处于G2/M期细胞比例与对照组及空载体组比较均差异具有统计学意义(P0.05);转染72h后,实验组(MOI=50)Survivin基因的mRNA水平及蛋白表达水平与对照组及空载体组(MOI=200)比较均差异具有统计学意义(P0.05或P0.01),并且survivin的表达随着MOI的增加而减弱。结论 Vpr体外可以诱导细胞HT-29G2/M期阻滞及凋亡从而有效抑制细胞HT-29增殖,其机制可能与Vpr下调Survivin基因的表达有关。Vpr在大肠癌的治疗中具有潜在的应用前景。