HSV-tk/GCV自杀基因系统对骨肉瘤细胞体外杀伤效应

目的：观察：HSV—tk／GCV系统对骨肉瘤细胞SAOS-2的体外杀伤作用．方法：构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN,在lipofectamine2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人骨肉瘤细胞SAOS-2,G418筛选出抗性克隆命名为SAOS／tk,以RT—PCR及Southern blot检测tk基因的整合及表达．观察tk基因修饰细胞生长状况及MTT法观察前药对tk基因修饰骨肉瘤细胞的杀伤效应．结果：RT—PCR及Southern blot分析证明tk基因在人骨肉瘤细胞系SAOS-2中有整合及表达;SAOS／tk与未转基因的原肿瘤细胞相比,两者生长速度及形态结构无明显差别;在前药敏感性试验中,GCV对SAOS／tk细胞的杀伤作用十分明显,半数致死量约为1mg／L,而亲本细胞SAOS-2和空白质粒转染SAOS／0细胞,半数致死量大于100mg／L．tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗,SAOS／tk占混合细胞总数的20％时即可杀伤约50％的混合培养细胞.结论：人骨肉瘤细胞系SAOS-2对HSV—tk／GCV系统高度敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径．     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

HSV-TK/GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3杀伤作用的研究

目的评价HSV—TK／GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3的杀伤作用及旁观者效应。方法用含HSV—TK重组腺病毒载体转染人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法计算细胞存活率以评价杀伤作用;转染的OVCAR3细胞（TK^＋）与未转染的OVCAR3细胞（TK^-）以不同比例混合,再加入GCV,MTT法计算细胞存活率以评价旁观者效应。结果HSV—TK／GCV系统可明显杀伤OVCAR3细胞,在感染复数（MOI）为100时,平均细胞存活率为26％;HSV—TK／GCV系统对该细胞的杀伤作用有明显的“旁观者效应”,当TK^＋细胞占10％、20％、30％、40％、50％时,细胞平均存活率分别为82％、52％、41％、35％、32％。免疫细胞化学检测OVCAR3细胞的细胞膜上有Cx43的表达。结论HSV—TK／GCV系统对人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3有明确的杀伤作用及旁观者效应。     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的：观察HSV－tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法：将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色，测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含HSV－tk基因的重组腺病毒载体AcCMVtk。AdCMVtk感染Hep-2细胞后，加入10mg/LGCV,佼 活率及旁观者效应。结果：随着腺病毒感染复数量（multiplicity of infection,MOI)增加，对Hep-2细胞转染率亦增加，100％转染所需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系，即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应，但较弱。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

HSV1-tk自杀基因系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应

【目的】检测自杀基因系统单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1-tk/GCV)对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应。【方法】将B16/tk(tk+)细胞和未经修饰的B16(tk-)细胞按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%比例分别进行混合,各组细胞于96孔板中培养,加入丙氧鸟苷(GCV)至15.7μmol/L,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同tk+细胞比例的HSV1-tk/GCV系统在体外对肿瘤细胞的杀伤率。各组混合细胞分别接种于小鼠腋下,以GCV注射液按100 mg.kg-1.d-1进行治疗,检测瘤体体积、湿质量,测定抑瘤效应。【结果】tk+比例10%以上治疗组,HSV1-tk/GCV系统对黑色素瘤B16细胞均有明显杀伤效应,但旁杀伤作用不明显;从移植瘤体积看,20%以上tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P0.05),以80%tk/GCV治疗组作用最显著(P0.01);从移植瘤质量看,80%tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P0.01),其他组虽随着tk+细胞比例的增高瘤体平均质量下降,但差异无显著性意义。【结论】HSV1-tk/GCV系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应均随着B16/tk细胞比例的增高而增强,已建立显示出体外杀伤效应和体内抑瘤活性的小鼠黑色素瘤自杀基因系统。     

HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739旁观者效应的实验研究

目的 为探讨HSV－TK／GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739的旁观者效应。方法 台盼蓝染色计数法对GCV单独作用T739－TK细胞、T739细胞或其两者按不同比例混合在不同容积等情况下的杀伤作用进行研究。结果 HSV－TK／GCV系统有效的杀伤T739－TK细胞，且这种作用有明显的旁观者效应，旁观者效应的强弱与T739－TK细胞所占比例以及细胞间接触程度成正相关。结论 HSV－TK／GCV系统不仅能有效的杀伤T739－TK细胞，而且对T739细胞有明显的旁观者效应。     

HSV-tk/GCV系统对高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2的抑制作用

目的 :探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk) /丙氧鸟苷 (GCV)自杀基因系统对高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2的作用 .方法 :采用阳离子脂质体介导法将含HSV tk基因复制缺陷型逆转录病毒载体 (pBabe/tk)导入M3SP2细胞 ,嘌呤霉素筛选抗性克隆 .用MTT比色法测定HSV tk/GCV对tk阳性M3SP2细胞 (M 3SP2 /tk)生长的影响及旁观者效应 ;用流式细胞术分析HSV -tk/GCV对M3SP2 /tk细胞周期的影响 .结果 :M3SP2 /tk细胞对GCV的敏感性显著增加 ,细胞生长受到抑制 ,在GCV(0 .1～ 10 0 0mg·L-1)作用 6d时 ,M3SP2 /tk细胞存活率为 6 2 .3%- 14 .5 %,IC50 值为 0 .6 8mg·L-1,而转空载体细胞和亲本细胞IC50 值大于 10 0 0mg·L-1.M3SP2 /tk细胞在GCV(1～ 10mg·L-1)作用 4 8h时 ,明显阻滞于S期 .10 %tk阳性的M 3SP2 /tk细胞与 90 %tk阴性的亲本细胞M3SP2混合培养 ,10mg·L-1的GCV仍可杀伤 5 4 .4 %的细胞 .M3SP2 /tk细胞含GCV (1,10mg·L-1)培养上清液仍能影响tk阴性的舌癌细胞系TbpTL的生长 .结论 :HSV tk/GCV具有显著抑制涎腺粘液表皮样癌细胞体外生长的作用 ,其作用机制与细胞周期进程停滞和旁观者效应有关     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肿瘤基因治疗中的应用

胸苷激酶基因在细菌和哺乳动物细胞中都存在，但只有病毒的胸苷激酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶才能使更昔洛伟(ganciclovir，GCV)等核苷类似物磷酸化，磷酸化的核苷类似物干扰DNA的合成而中止细胞的复制，尤其在肿瘤细胞中。在近10年，人们利用HSV—tk基因通过病毒载体转染多种肿瘤细胞，然后给予更昔洛伟(GCV)或阿昔洛伟(acyclovir，ACV)，在体外、体内试验对肿瘤细胞的杀伤作用都很明显。另外HSV—tk／GCV系统在抗肿瘤作用中有“旁观”效应，即转染有HSV-tk基因的靶细胞与未转染的HSV-tk基因的靶细胞同样可被GCV杀伤。由于HSV—tk／GCV系统的抗肿瘤作用效果明显，安全性好，越来越多的肿瘤患志愿接受实验，该系统已获准临床实验。本综述了近10年来HSV-tk／GCV系统在抗肿瘤治疗探索中的应用，大量资料显示HSV—tk基因用于抗肿瘤治疗将是本世纪的重要方法。     

转铁蛋白受体介导的肝癌靶向性HSV-tk/GCV系统的构建及体外效应研究

目的：构建肝癌靶向性HSV—tk／GCV基因转移系统，并研究其在体外对肝癌细胞的杀伤效应。方法：体外培养通过基因重组技术构建和表达抗转铁蛋白受体(TfR)人—鼠嵌合抗体的转染瘤细胞D2C5．6，诱导裸鼠(Balb／c，nu／nu)产生腹水并纯化；以蛋白质连接因子—水溶性碳二亚胺(EDC)介导TfR的抗体与多聚左旋赖氨酸的连接(Ab—PLL)，与pEBAF／tk按比例混匀，得到Ab—PLL—pETAF／tk基因转移系统；分别转染不同的细胞株进行体外效应研究：人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721，人肺癌细胞株549，观察给予不同浓度的更昔洛韦(GCV)随时间延长的细胞改变情况，用MTT法检测GCV对不同细胞的杀伤作用。结果：分析型酸性尿素凝胶电泳证实抗TfR的抗体与PLL成功连接；体外杀伤实验显示：经Ab—PLL—pETAF／tk基因转移系统处理的3种细胞对GCV表现出不同的敏感性。HepG2细胞(CD71 ，AFP )对GCV很敏感，低浓度的GCV(1mg／L)处理3d，即可使细胞生长抑制率达到74．8％，SMMC7721细胞(CD71 ，AFP )对GCV低度敏感，A549(CD71-，AFP-)对GCV不敏感。结论：TfR介导的肝癌靶向性HSV—tk／GCV基因转移系统构建成功；有可能用以肝癌细胞为靶细胞的基因治疗的研究。     

间隙连接蛋白43在系统旁观者效应中的作用

目的　研究细胞间间隙连接蛋白 4 3(connexin4 3,Cx4 3)在单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及更昔洛韦 (HSV tk GCV)系统旁观者效应中的作用 ,探讨旁观者效应的机制。方法　用带tk基因的逆转录病毒载体感染不同Cx4 3表达水平的中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) ,获得不同Cx4 3表达水平的tk 细胞 ,tk /tk-细胞按不同比例混合 ,经更昔洛韦 (GCV)作用后 ,用细胞计数检测混合细胞体系的生长抑制率 ,用流式细胞仪检测各组细胞的DNA含量并分析细胞周期。结果　体外实验证实 ,tk /tk-混合细胞经GCV作用后生长受抑制的程度与Cx4 3表达水平有关 ,Cx4 3表达水平高的混合细胞在含有 5 %tk 细胞时就表现出旁观者效应 ,而Cx4 3表达水平低的混合细胞在含有 2 0 %tk 细胞时才表现出明显的旁观者效应。结论　在HSV tk GCV系统的基因治疗过程中 ,旁观者效应的效率与间隙连接蛋白的表达水平有关     

腺病毒介导的HSV-tk体外抗喉癌作用

目的 :观察 HSV- tk/ GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法 :将带有报告基因 Lac Z的 5型缺陷性腺病毒载体 Ad CMVL ac Z感染喉癌细胞 Hep- 2 ,X- gal染色 ,测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含 HSV- tk基因的重组腺病毒载体 Ad CMVtk。Ad CMVtk感染 Hep- 2细胞后 ,加入 10 mg/ LGCV,观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果 :随着腺病毒感染复数量 (multiplicity of infection,MOI)增加 ,对 Hep- 2细胞转染率亦增加 ,10 0 %转染所需的 MOI为 2 0 0。 Ad CMVtk/ GCV对 Hep- 2细胞的杀伤强度与 Ad CMVtk量呈正向关系 ,即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应 ,但较弱。结论 :腺病毒介导的 HSV- tk/ GCV具有杀伤喉癌细胞作用     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。     

逆转录病毒介导HSV-TK基因治疗膀胱癌及旁观者效应的观察

目的 观察HSV—TK／GCV治疗膀胱癌的体内效果及旁观者效应。方法 用逆转录病各感染鼠源性膀胱癌细胞T739，以不同比例的T739和T739TK细胞建立膀胱癌腹腔肿瘤模型，同时，在背部皮下以母代细胞T739建立皮下肿瘤，观察GCV治疗俯后肿瘤大小变化及动物存活时间。结果 动物存活时问随基因转移效率提高而延长，腹腔肿瘤生长受到抑制，背部肿瘤在50％以上转移效率时肿瘤生长缓侵。结论 HSlV—TK／GCV对膀胱癌的体内杀伤效应随基因转移效率提高，并存在远距离旁观者效应。     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

自杀基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶对鼻咽癌细胞株杀伤作用机制的研究

目的探讨自杀基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）对鼻咽癌（NPC）细胞株的杀伤作用机制.方法将HSV-tk基因通过脂质体法转染NPC细胞株,经G418筛查挑选阳性细胞克隆并经逆转录聚合酶链反应（R-PCR）鉴定,加入前体药物戊环鸟苷（GCV）后,观察其对NPC细胞的杀亡状况.结果MTT法显示转染的NPC细胞株在加入GCV后,成活率明显降低,与未转染基因的NPC细胞株相比,差异有显著性（P＜0.01）.流式细胞仪显示与未加GCV的细胞相比,转染基因的细胞加入GCV后生长受到明显抑制,S期细胞数从占总细胞数的35.71%降至17.41%,凋亡率从1.33%增长至8.15%,并出现明显的凋亡峰.电镜下,转染细胞经GCV作用后大量细胞发生凋亡,可观察到凋亡细胞内特征性的凋亡小体.结论自杀基因HSV-tk对NPC有明显的杀伤作用,其可能性机制是HSV-tk基因联合GCV,对NPC细胞产生选择性细胞毒性作用,抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗肝门部胆管癌的体内外实验研究

目的:观察逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(E.coli-cytosinedeaminase,CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)基因转染肝门部胆管癌的作用。方法:在脂质体lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,收集其病毒上清,转染FRH细胞,用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-Fc)和(或)无环鸟苷(ganciciovir,GCV)后,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定转基因组及未转基因组FRH细胞存活率。在0.8cm裸鼠肝门部胆管癌模型转染入双自杀基因后,给予5-Fc500mg/kg体重,GCV100mg/kg体重,1次/d,共10d,观察肿瘤生长情况。结果:双自杀基因在FRH细胞中可稳定表达,联合使用5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fc或GCV。在裸鼠实验性肝门部胆管癌,实验组肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05);双自杀基因与单自杀基因的作用有显著差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效地杀死肝门部胆管癌细胞,明显抑制裸鼠肝门部胆管癌生长,双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用。