兔阴道平滑肌细胞体外分离与培养

背景：阴道平滑肌细胞原代培养主要有两种方法：酶消化法和组织块贴壁法。前者培养所需时间短，产量高，但所需组织量较大，且试验中污染机会大，最佳消化时间不易把握；后者虽方法简便、有效，但培养所需时间较长。 目的：观察组织块+酶消化法原代培养兔阴道平滑肌细胞时间，并与组织块法比较。 设计、时间及地点：体外观察实验，于2005-02/2006-02在南昌大学第一附属医院烧伤研究所及动物实验室完成。 材料：四五个月龄雌性新西兰大白兔，体质量2.0~2.5 kg。 方法：①组织块法原代培养阴道平滑肌细胞：将修剪好的1 mm×1 mm×1 mm组织块均匀地接种于培养皿中，然后放入37 ℃恒温培养箱中静置培养3.0~4.0 h，待组织块贴壁牢固后，再补加含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液，使组织块浸于培养液中，37 ℃恒温静置培养3.0~4.0 d，待细胞游出后换液,大约每3天换液一次。②组织块+酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞：将组织块用0.1%胶原酶Ⅳ在37 ℃培养箱中消化0.5~1.0 h，至组织块边缘变毛时中止消化，然后将消化好的组织块接种于培养皿上，其余步骤同组织块法。③传代培养：第1次传代时机应根据细胞生长具体情况而定，在细胞达50%~60%融合时即进行传代培养。第2次以后传代，在细胞生长达80%融合时进行传代培养。 主要观察指标：①原代培养所需时间。②第3代阴道平滑肌细胞表面结构和超微结构。 结果：组织块+酶消化法原代培养细胞萌出时间较组织块法早1.0~2.0 d，细胞融合时间较组织块法早3.0~4.0 d，细胞可稳定传5~6代。倒置显微镜下观察两种方法所培养细胞呈梭形或多角形，融合时部分区域细胞出现平滑肌细胞特征性生长表现“峰-谷”状结构。透射电镜下观察，第3代阴道平滑肌细胞核呈锯齿状，胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体，含有大量高尔基体,粗面内质网扩张，游离核糖体丰富,提示获得合成表型阴道平滑肌细胞比例大。 结论：组织块+酶消化法原代培养周期较短，需要注意的是在取材、分离整个操作过程中需保持阴道组织块湿润；胶原酶消化组织块时间不应过长，以组织块周边呈现毛须状为度；此外应在静置状态下培养。     

血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞生长增殖的影响

背景：在体外构建组织工程材料的过程中，快速获得足够数量且纯度高的种子细胞极为重要，但目前人脐静脉间充质干细胞原代培养的增殖率仍较低。 目的：观察血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞原代生长、增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-03/07在辽宁医学院解剖学实验室完成。 材料：正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条，由锦州市凌河区妇幼保健院及辽宁医学院附属第一医院提供。 方法：采用胶原酶消化法分离人脐静脉间充质干细胞，以1×108 L-1的密度接种于24孔培养板，设立2组，实验组加入150 g/L血管内皮细胞生长因子，对照组不加入任何细胞因子。 主要观察指标：观察细胞形态变化，MTT法检测细胞生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞CD166的表达。 结果：接种后6 h细胞开始贴壁，48 h后细胞完全贴壁生长，出现呈椭圆形、多角形的内皮细胞，以及呈梭形的成纤维样细胞，有的形成漩涡状生长集落；原代培养1周后细胞以梭形为主；传代后24 h细胞基本完成贴壁，48 h细胞开始分裂增殖，5~7 d可见多核的成纤维样细胞贴壁，呈长杆状、三角形、梭形等。与对照组比较，实验组细胞生长状态较好，增殖较快，单位时间内获得的细胞数量明显增加(t=2.235，P < 0.05)，CD166阳性细胞率显著升高(t=1.638，P < 0.01)。 结论：血管内皮细胞生长因子可促进人脐静脉间充质干细胞贴壁，且更有利于间充质干细胞的增殖和纯化。     

人脑动静脉畸形血管平滑肌细胞的培养和鉴定

目的:建立一个稳定的人脑动静脉畸形血管平滑肌细胞的培养体系。方法:取手术切除的人脑动静脉畸形组织块以酶消化法接种于铺有胶原底层的培养瓶中进行原代及传代培养,并对其进行形态学观察、免疫组化染色及透射电镜等一系列细胞定性研究。结果:接种后6-8 d后可见少量细胞贴壁,所获培养细胞经免疫组化、透射电镜鉴定证实为血管平滑肌细胞,而且细胞纯度较高,细胞可以连续传代18代。结论:应用酶消化法可获得纯化的血管平滑肌细胞,细胞可以连续传代培养。培养动静脉畸形血管平滑肌细胞可应用于体外作进一步的深入研究。     

脑动静脉畸形血管内皮细胞和平滑肌细胞的体外培养

目的：探讨脑动静脉畸形（AVM）内皮细胞和平滑肌细胞的分离、培养及鉴定方法。方法：手术获得脑AVM标本后,分别采用组织块贴壁法和酶消化法对脑AVM血管内皮细胞、平滑肌细胞进行培养和形态学观察,采用免疫组化分别检测培养的内皮细胞CD31抗原和平滑肌细胞SMA抗原阳性表达。结果：相差显微镜下,培养的内皮细胞呈扁平梭形,胞核椭圆居中;平滑肌细胞呈长梭形。CD31和SMA分别在两种细胞中免疫阳性表达率超过90％。结论：AVM内皮细胞、平滑肌细胞可以获取和培养增殖,为可供研究脑血管畸形血管生物学的体外模型。     

大鼠脑动脉平滑肌细胞的体外培养与鉴定

目的建立大鼠颅内脑动脉平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)的体外培养方法。方法无菌条件下分离大鼠脑基底动脉,去除血管外膜后剪成约0.2mm的小段,分别用0.1% Ⅰ型胶原酶、0.125%胰蛋白酶消化,细胞用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。采用人工刮除法及差速贴壁法纯化细胞。SMCs通过形态学观察及α-平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学方法鉴定。结果原代培养3d后细胞开始贴壁,2w后细胞呈梭形,汇合后具有典型的峰-谷生长特点。传代培养的细胞保持上述特征,第5代细胞经α-平滑肌肌动蛋白表达鉴定,纯度达97%以上。台盼蓝排斥实验检测细胞存活率>95%。结论这种方法操作简单、结果可靠、成本低廉,可为颅内动脉粥样硬化等脑血管病机制和治疗的研究提供适宜的体外培养细胞模型。     

Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞提取与纯化的体外研究

目的建立简便易行的Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞体外提取并纯化方法,以获取能够满足实验需求的Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞,提高原代培养成功率。方法采集6例Ⅱ型神经纤维瘤病患者肿瘤组织标本作为实验材料,Ⅰ型胶原酶消化培养法提取肿瘤性许旺细胞,低浓度酶快速消化法、差数贴壁法和克隆筛选技术纯化肿瘤性许旺细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学染色榆测纯化细胞S-100蛋白表达水平,结合细胞形态鉴定经体外培养并纯化的细胞为肿瘤性许旺细胞。结果自3例肿瘤组织标本培养液中成功获得肿瘤性许旺细胞。肿瘤细胞原代培养至第3天,可见大量双极梭形或三角彤细胞,以低浓度酶快速消化法和差数贴壁法纯化细胞;培养至第3代,倒置相差显微镜观察可见4～5个克隆细胞,免疫细胞化学染色S-100蛋白表达阳性,肿瘤性许旺细胞纯度〉95％,活力良好,可以稳定传代培养。结论应用体外原代培养方法结合低浓度酶快速消化法、差数贴壁法和克隆筛选技术能够有效剔除纤维母细胞,获得纯度高、活力良好的肿瘤性许旺细胞,可用于Ⅱ型神经纤维瘤病发病机制及治疗研究。     

Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞提取与纯化的体外研究

目的建立简便易行的Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞体外提取并纯化方法,以获取能够满足实验需求的Ⅱ型神经纤维瘤病肿瘤性许旺细胞,提高原代培养成功率。方法采集6例Ⅱ型神经纤维瘤病患者肿瘤组织标本作为实验材料,Ⅰ型胶原酶消化培养法提取肿瘤性许旺细胞,低浓度酶快速消化法、差数贴壁法和克隆筛选技术纯化肿瘤性许旺细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测纯化细胞S-100蛋白表达水平,结合细胞形态鉴定经体外培养并纯化的细胞为肿瘤性许旺细胞。结果自3例肿瘤组织标本培养液中成功获得肿瘤性许旺细胞。肿瘤细胞原代培养至第3天,可见大量双极梭形或三角形细胞,以低浓度酶快速消化法和差数贴壁法纯化细胞;培养至第3代,倒置相差显微镜观察可见4～5个克隆细胞,免疫细胞化学染色S-100蛋白表达阳性,肿瘤性许旺细胞纯度>95%,活力良好,可以稳定传代培养。结论应用体外原代培养方法结合低浓度酶快速消化法、差数贴壁法和克隆筛选技术能够有效剔除纤维母细胞,获得纯度高、活力良好的肿瘤性许旺细胞,可用于Ⅱ型神经纤维瘤病发病机制及治疗研究。     

骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定

背景：心脏瓣膜的组成成分中不是只有内皮细胞发挥作用,成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成分构建。 目的：建立可以在体外获得大量内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定。 方法：全髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增,第3代细胞在特定条件下分别向内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞方向诱导分化,每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对诱导分化的细胞行免疫细胞化学检测。 结果与结论：骨髓间充质干细胞在特定条件下诱导培养后,诱导后的细胞分别具有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的特点。提示骨髓间充质干细胞在体外可以定向分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞。     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养及相关鉴定分析

背景：从以往的文献来看，阴茎海绵体平滑肌细胞的原代培养存在着制作时间长，纯度不高以及易被成纤维细胞污染等诸多缺点。 目的: 探索兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养技术及纯度鉴定方法。　 设计、时间及地点：对照实验，于2007-10/2008-03在上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海市组织工程研究与开发中心完成。 材料：成熟的雄性新西兰大白兔5只，体质量2.5~2.8 kg。 方法：取雄性新西兰兔新鲜的阴茎组织，利用高浓度的胶原酶消化法结合差速贴壁技术对海绵体平滑肌细胞进行纯化培养。以同期兔成纤维细胞作为对照参考。 主要观察指标：以四甲基偶氮唑盐分析细胞生长特性；以平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白免疫荧光鉴定海绵体平滑肌细胞；以流式细胞仪检测P2及P5代细胞α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率变化情况。 结果：培养细胞四甲基偶氮唑盐显示细胞指数增长期为6 d左右，随后进入平台期。α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白均呈阳性反应，同期成纤维细胞仅α-肌动蛋白显示阳性结果。第2代细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率分别65.3%， 42.2%, 62.3%。经过反复多次的纯化技术至第5代时，上述指标阳性表达率分别上升为92.8%，72.7%，78.1%。　 结论：通过高浓度的酶消化法及差速贴壁技术可获得高纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞，肌球蛋白、结蛋白相对于α-肌动蛋白可以成为鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标。     

兔主动脉内皮细胞培养及鉴定：内皮细胞分离方式及培养条件的改良

背景：获取内皮细胞的方法有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。一直以来，内皮细胞的培养方法也在不断的更新。 目的：探讨兔主动脉内皮细胞的培养和鉴定方法。 方法：取1周龄新西兰大耳白兔主动脉，剥去外膜，内膜面向下铺入2 g/LⅠ型胶原酶、2 g/LⅢ型胶原酶，2 g/L Ⅳ型胶原酶和2 g/L Ⅴ型胶原酶混合消化液中(按1∶1∶1∶1∶1混合)消化20 min，按1∶1加入培养基以终止消化。轻轻刮下内膜层细胞，将细胞悬液离心，用DMEM培养液(含胎牛血清20%、VEGF 1 μg/L、bFGF 2 μg/L，庆大霉素6 U/L)混匀沉淀细胞，吹打分散至单个细胞培养，48 h后用首次换液。再按1∶2分瓶传代培养。采用倒置相差显微镜观察细胞培养结果。免疫组织化学及免疫荧光鉴定Ⅷ因子相关抗原。电镜观察Weibel-Paladed小体。 结果与结论：体外获得并培养5代内皮细胞。Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体均证实实验成功的培养了原代及传代内皮细胞。提示兔主动脉内皮细胞可从主动脉获得并通过培养成为细胞系，Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体联合鉴定是确定内皮细胞的良好方法。     

双细胞种植改善人工血管内皮细胞的保留率

背景：前期研究表明,在人工血管内壁种植内皮细胞,使其早期快速内皮化,可以改善移植血管的通畅性,但种植的单层内皮细胞往往黏附力差,在血流的冲击下容易脱落。 目的：采用血管内皮细胞和平滑肌细胞双层种植方法,提高人工血管腔面内皮细胞的保存率。 方法：采用标准酶分离技术和细胞培养技术分离培养兔内皮细胞。采用组织贴块法分离培养兔平滑肌细胞。并分别以lacZ和GFP基因转染内皮细胞及平滑肌细胞。双层细胞种植组在聚四氟乙烯人工血管管腔面先后种植平滑肌细胞和内皮细胞,以单纯种植血管内皮细胞为对照。在体外将受试的人工血管接入作者设计的灌流模型下灌注2 h,计算比较灌注前后受试标本内皮细胞密度。体内实验,将人工血管植入兔子体内7 d,分别测定内皮细胞保留率。 结果与结论：灌注2 h 后,单纯内皮细胞种植组细胞保留率为0.39±0.04,而双层细胞种植组内皮细胞保留率为0.73±0.07,双层细胞种植组细胞保存率明显高于单纯内皮细胞种植组(P < 0.01)。人工血管植入兔体内7 d,单纯内皮细胞种植组内皮细胞保留率为0.63±0.10,双层细胞种植组内皮细胞保留率为0.95±0.06,两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。结果证实在内皮细胞和人工血管壁之间种植平滑肌细胞在体外和体内均可提高内皮细胞的保存率。     

不同浓度细胞种植脱细胞血管基质上构建组织工程血管

摘要 背景：前期研究表明制备的脱细胞血管基质适合平滑肌细胞和内皮祖细胞生长,但是共培养模型中细胞接种密度对血管基质上细胞覆盖率的影响尚不清楚。 目的：观察不同浓度度细胞种植在脱细胞血管基质上的生长情况。 方法：采用两步法进行细胞种植,先将不同细胞浓度血管平滑肌细胞种植在脱细胞血管基质上,培养3 d后再将不同浓度内皮祖细胞接种在平滑肌细胞-血管基质复合体上,构建片状组织工程材料,分别在内皮祖细胞种植后3 d、1周时间段获取标本,扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况。 结果与结论：血管平滑肌细胞和内皮祖细胞在脱细胞基质表面生长良好。不同浓度细胞在基质上的排布不同;提高接种的浓度有利于在材料表面快速形成致密的细胞层。提示采用两步法以合适的浓度种植细胞于脱细胞基质上,可以构建组织工程血管。 关键词：内皮祖细胞;平滑肌细胞;组织工程血管;脱细胞血管基质;种植 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.010     

体内环境培养的小口径组织工程血管

背景：人造血管是临床组织修复领域广泛应用的重要器官,但小口径人造血管易于栓塞、难以长期保持通畅,而组织工程血管虽有永久替代作用,培养时间长,不符合血管修复的临床实际。寻找既能及时修复血管、恢复血运,又能在体内形成生物性血管保持长期通畅,是最理想的血管修复重建方法。 目的：观察以改性猪小肠黏膜下层组织为支架,在体内血流条件下培养小口径组织工程血管的可行性。 方法：自犬隐动脉分离出血管内皮细胞、平滑肌细胞,与胶原蛋白凝胶均匀混合,分别种植于小肠黏膜下层膜表面,包绕 3 mm聚乙烯管制成30个3层管状支架,植入犬股动脉缺损处进行桥接吻合为实验组;植入犬皮下组织为对照组。术后进行彩超、组织学检测评价血管的形成过程和免疫组化鉴定。 结果与结论：术后12周,实验组14个血管支架保持通畅,有明显的血管生物结构形成,种子细胞生长增殖良好,管腔有完整内皮细胞覆盖,平滑肌细胞形态、分布良好;对照组管腔结构不完整,种子细胞增殖弱,腔面无内皮细胞覆盖。结果表明通过体内组织工程技术可在血流条件下培养形成小口径组织工程血管。     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。 目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。 方法：采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Von kossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。 结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Von kossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

成体干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究现状

成体干细胞存在于已分化的组织器官中，具有明显的可塑性，能跨系统、跨胚层分化，在组织工程和损伤修复领域具有重要的应用价值。在血管组织工程研究领域中，成体干细胞作为种子细胞得到越来越广泛而深入的研究。目前研究表明，具有向血管内皮细胞分化的成体干细胞主要有骨髓间充质干细胞、造血干细胞、脂肪来源的干细胞以及羊膜来源的干细胞等。基于此，就成体干细胞作为种子细胞在血管组织工程领域研究现状进行综述。     

组织工程血管的种子细胞

血管移植物数量和功能的不足制约着许多疾病的治疗，因此组织工程血管成为研究的热点。种子细胞作为组织工程血管重要组成部分，如何达到正常血管内皮细胞及平滑肌细胞的生理功能，是人们关注的焦点。干细胞因具备多向分化潜能，被视为理想的种子细胞，然而干细胞种类较多，在组织工程血管的构建过程中，哪种干细胞更适合作为种子细胞，尚无定论。文章对造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等多种干细胞进行比较，简述各自的特点，试图全面了解干细胞的功能，为进一步实验奠定一定的基础。     

应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞*☆

背景：研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞，并应用于各类组织工程和再生医学研究。 目的：结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞，并培养其单细胞克隆和亚克隆集落。 方法：以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象，经三重酶消化和细胞筛过滤，运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞，予细胞特异标记物以免疫组织化学染色；以有限稀释技术克隆培养的方法，获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落。 结果与结论：差速贴壁培养过程中，肌性细胞占比逐渐增高，首次贴壁1 h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养；肌源干细胞需72 h左右贴壁生长，经10 d左右可以增殖为300~500细胞数量的集落，细胞形态以小圆形细胞为主，并有少量梭形细胞，肌源干细胞能够维持形态并持续增殖；应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落，肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性，Sca-1染色阳性，阳性率为(92.3±4.1)%。提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。     

组织工程化血管与种子细胞

摘要：血管组织工程学的目的就是在体外构建理想的血管移植物,植入体内后无免疫排异反应,能维持移植血管腔的长期通畅。临床上需要各种口径大小的血管作为手术修补材料或者其他自体或者异体甚至组织工程组织的滋养血管。文章采用了文献搜集和分析的方法,综述了血管组织工程的定义、自体血管壁细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞的选择及其在应用中的优缺点。