人食管癌细胞抗药机制的探讨

目的：在建立 体外多药抗药细胞株的基础上，研究其抗药性形成机制，寻求克服抗药性的方法。方法：用人食管癌上皮细胞Ｅｃａ－１０９细胞，在无诱导剂的情况下，以递加培养液中阿霉素（ＡＤＭ）质量浓度的方法，建立了Ｅｃａ－１０９／ＡＤＭ多药抗药细胞株。用荧光光度法测定抗药细胞内还原性谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量及ＡＤＭ的累积量。结果：研究发现Ｅｃａ－１０９／ＡＤＭ细胞内ＧＳＨ含量增加、降低细胞内ＧＳＨ的含量，细胞的     

过表达Beclin 1对食管癌Eca109细胞生物学行为的影响

目的：探讨自噬基因Beclin 1对食管癌细胞Eca109生物学行为的影响。方法：运用Beclin 1过表达质粒pIRES2-Zs－Green1-h Beclin 1转染食管癌 Eca109细胞株,RT-PCR和Western blot检测Beclin 1的mRNA和蛋白的表达;电子显微镜观察转染后自噬体的形成情况;MTT法检测转染前后各组细胞生长曲线的变化;血管形成实验检测其对Eca109细胞株血管形成能力的影响;Transwell小室实验检测其对Eca109细胞株迁移和侵袭能力影响;流式细胞技术检测目的基因组和对照组细胞周期的变化。结果：pIRES2-ZsGreen-hBeclin1质粒成功转染食管癌Eca109细胞株。目的基因组Eca109细胞较空载体组和未转染组生长明显抑制（P=0.000,P=0.000）;目的基因组Eca109细胞迁移、侵袭及血管形成能力明显低于对照组（P值均<0.05）;Beclin 1稳定表达后,S期细胞明显减少,细胞增殖受到抑制。结论：Beclin 1基因可以作为食管癌生长及转移的一种抑制基因。     

山奈酚诱导人食管鳞癌Eca-109细胞凋亡及其机制

目的研究山奈酚对人食管鳞癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法山奈酚体外作用于Eca-109细胞后,用MTT法检测细胞增殖抑制作用;TUNEL染色测定细胞凋亡率;RT-PCR检测Bax、Bcl-2基因表达变化情况;分光光度法测定Caspase-3和Caspase-9活性。结果山奈酚显著抑制Eca-109细胞增殖(P<0.01),呈剂量依赖关系。TUNEL染色结果表明山奈酚诱导Eca-109细胞发生凋亡,RT-PCR结果显示山奈酚作用后,肿瘤细胞Bax基因表达上调,Bcl-2基因表达下调,同时,Caspase-3和Caspase-9活性明显升高(P<0.01)。结论山奈酚能抑制Eca-109细胞增殖,诱导细胞凋亡。山奈酚可能通过线粒体途径诱导Eca-109细胞凋亡。     

人食管癌Eca-109细胞膜蛋白的分离和纯化

目的:建立人食管癌Eca109细胞系膜蛋白分离和初步纯化方法。方法:使用改良的Neville法提取细胞膜,在pH6.3的条件下,用去垢剂TritonX100和辛基β葡糖苷把细胞膜上的蛋白溶解下来,以超滤法纯化膜蛋白并分组。结果:在pH6.3的条件下,适当的去垢剂与膜蛋白质量之比使用去垢剂辛基β葡糖苷时为61;使用TritonX100时为21。超滤法将膜蛋白分为相对分子质量<3000、3000～10000、<10000、10000～30000、30000～100000、>100000共6个组分。结论:获得适当的去垢剂与膜蛋白质量比,并获得了不同的膜蛋白组分,为进一步研究人食管癌Eca109细胞肿瘤抗原奠定了基础。     

不同粒径半夏抗肿瘤复方对人食道癌Eca-109细胞生长影响的比较研究

目的 观察不同粒径半夏抗肿瘤复方对体外人食道癌Eca-109细胞生长的影响。方法 以人食道癌Eca-109细胞为材料，用MTT法检测半夏抗肿瘤复方粗粉及细粉对体外人食道癌Eca-109细胞生长的抑制作用，并比较二者作用差异。结果 半夏抗肿瘤复方粗、细粉对人食道癌Eca-109细胞生长均有抑制作用（OD值与细胞对照组比差异均显著，P＜0．05），但两者之间作用差异不显著。结论 半夏抗肿瘤复方粗、细粉对人食道癌Eca-109细胞生长均有抑制作用。     

β-榄香铜酸对人食管癌细胞Eca-109的抑制作用

目的 探究β-榄香铜酸对人食管癌细胞Eca-109增殖、迁移、侵袭的影响及作用机制。方法 使用不同浓度的β-榄香铜酸(0、20、40、60μmol/L)处理Eca-109细胞,首先进行MTT、平板克隆、细胞划痕、transwell迁移、transwell侵袭实验检测β-榄香铜酸对Eca-109的细胞增殖、迁移、侵袭的影响;之后在60μmol/L浓度组使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)干预探索其作用机制。使用试剂盒检测Eca-109细胞中Fe²⁺、ROS、lipid ROS、GSH、MDA含量,使用Western blot实验检测Eca-109细胞中GPX4、PTGS2和4-HNE的蛋白表达。结果 β-榄香铜酸可呈剂量依赖性抑制Eca-109的细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭,激活Eca-109中铁死亡通路蛋白PTGS2和4-HNE,导致GPX4失活,出现铁依赖性的脂质过氧化。Ferrostatin-1可抑制整个进程,从而减少Eca-109细胞的铁死亡。结论 β-榄香铜酸可通过铁死亡通路抑制人食管癌细胞Eca-109,有望成为潜在抗食管癌的药物。     

蚯蚓纤溶酶增加人食管癌细胞ECA109对放射线敏感性的实验研究

目的:探讨蚯蚓纤溶酶(EFE)对食管癌细胞的放射增敏作用及机制.方法:选取人食管癌细胞株ECA109,采用MTT法观察EFE对细胞的生长抑制作用,克隆形成实验观察EFE对细胞的放射增敏作用,流式细胞术观察EFE对细胞周期分布的影响,RT-PCR法检测EFE对细胞内硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx)mRNA表达的影响.结果:EFE对ECA109有生长抑制作用,其作用呈剂量依赖性,IC50为3.8 ukU·ml-1;EFE 0.1、0.3 ukU·ml-1的放射增敏比分别为1.37和1.59;EFE作用24 h后,食管癌细胞G2与M期比例明显下降,细胞内SeGPx基因表达明显下调.结论:EFE在体外可抑制ECA109的生长,同时可增加其对放射线的敏感性;放射增敏机制可能与EFE清除细胞G2/M期阻滞及下调细胞内抗氧化酶SeGPx mRNA表达有关.     

阿司匹林对人食管癌细胞株Eca-109生长及凋亡的影响

目的 通过体外实验观察阿司匹林（ASA）是否有诱导人食管癌Eca-109细胞发生凋亡及增殖抑制的作用.方法 通过噻唑蓝（MTT）实验测定细胞生长抑制情况;流式细胞仪（FCM）检测凋亡率;通过电镜、Hoechst 33258染色从形态上观察细胞凋亡.结果 （1）阿司匹林能抑制人食管癌Eca-109细胞的生长,并在一定剂量和时间范围内呈现剂量、时间依赖关系.（2）流式细胞仪（FCM）观察细胞的凋亡率随阿司匹林浓度的增大而增加.（3）电镜下凋亡细胞体积缩小,染色质浓缩致密,并沿核膜边集.（4）Hoechst 33258染色后可见典型的细胞凋亡形态学变化.结论 阿司匹林对人食管癌Eca-109细胞具有增殖抑制作用,能诱导细胞凋亡,凋亡率随阿司匹林浓度的增大而增加.     

星半通膈散诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡及其机制研究

目的 研究星半通膈散药液诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡及其作用机制.方法 采用MIT法测定细胞生长抑制率,通过流式细胞仪观察凋亡细胞及检测p53、bcl-2基因表达.结果 星半通膈散不同剂量药液均可抑制人食管癌Eca-109细胞生长,诱导细胞凋亡,降低p53(突变型)、bcl-2蛋白表达率.结论 星半通膈散能诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡,而抑制p53基因突变、下调bcl-2基因表达可能是其重要机制.     

ABCE1基因对人食管癌细胞Eca109的影响及作用机制

目的 明确ABCE1基因对食管癌Eca109细胞中的增殖、侵袭、迁移、凋亡生物学行为的影响并对其作用机制进行初步探讨.方法 将构建好的ABCE1的SiRNA绿色荧光载体转染入食管癌Eca109细胞中,于荧光显微镜下观测转染效率并应用Western blot法及RT-PCR法证实基因沉默的效果,通过Western blot法检测RNase L的改变,MTT法分析细胞增殖能力并绘制细胞生长曲线,Transwell法检测细胞侵袭力,Transwell法检测细胞侵袭力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 转染ABCE1-SiRNA后的Eca109细胞内可见绿色荧光.Western blot法及RT-PCR法证实了基因沉默的效果(P＜0.05).MTT实验证实,转染ABCE 1-SiRNA载体的食管癌细胞与阴性对照组和空白对照组的细胞相比,增殖受到显著抑制(P＜0.05).Transwell结果显示转染ABCE1-SiRNA载体的食管癌细胞穿膜细胞数较阴性对照组和空白对照组的细胞明显减少(P＜0.05).转染ABCE1-SiRNA-1和转染ABCE1-SiRNA-2的细胞与空白对照组细胞和转染ABCE1-SiRNA-N的细胞相比较,细胞迁移发生明显减慢(P＜0.05),流式细胞仪检测细胞凋亡显示转染ABCE1-SiRNA载体的细胞的细胞凋亡率均显著高于阴性对照组和空白对照组细胞(P＜0.05).结论 抑制ABCE1基因表达后,食管癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力被抑制,细胞发生早期凋亡.这表明ABCE1基因的表达对食管癌细胞Eca109具有肿瘤生物学行为的影响.     

食管细胞系和癌组织中分化抑制因子Id-1 mRNA的表达

目的:探讨分化抑制因子Id-1基因在食管癌组织和食管癌细胞系中的表达状况.方法:采用RT-PCR方法检测食管癌细胞系(EC109、EC1、EC18)、食管永生化上皮细胞系(NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT)及20例食管癌及其配对癌旁正常组织中Id-1 mRNA基因的表达状况.结果:EC109、EC1、EC18、NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT均出现Id-1 mRNA的表达.正常食管上皮中未见其表达,癌旁组织中Id-1 mRNA阳性表达率为35%(7/20),癌组织中为65%(13/20),有升高趋势,但差异无统计学意义(x2=3.6,P＞0.05).结论:Id-1基因可能参与了食管癌的癌变过程.     

人食管癌细胞抗药机制的探讨

目的在建立体外多药抗药细胞株的基础上,研究其抗药性形成机制,寻求克服抗药性的方法。方法用人食管癌上皮细胞Eea-109细胞,在无诱导剂的情况下,以递加培养液中阿霉素(ADM)质量浓度的方法,建立了Eca-109／ADM多药抗药细胞株。用荧光光度法测定抗药细胞内还原性谷胱甘肽(GSH)含量及ADM的累积量。结果研究发现Eca-109／ADM细胞内GSH含量增加、降低细胞内GSH的含量,细胞的抗药性呈现部分逆转;抗药细胞内ADM的质量浓度较敏感株Eca-109细胞低,用维拉帕米能增加抗药细胞内ADM的质量浓度,同时部分逆转其抗药性。结论Eca-109／ADM细胞的抗药机制主要是由于细胞内GSH含量升高及细胞内药物质量浓度降低所致。     

MIF对耐ADM人乳腺癌细胞MCF-7/ADM 体内外耐药逆转作用

目的：采用动物体内外结合方法探讨米非司酮（mifepristone, MIF）对耐阿霉素（adriamycin,ADM）人乳腺癌细胞MCF-7/ADM耐药逆转作用。方法：四甲基偶氮唑蓝法检测5 μmol/L MIF对 MCF-7/ADM体外耐药逆转作用。MCF-7/ADM接种裸鼠皮下构建裸鼠移植瘤模型,空白对照组（NS组）为0.2 mL生理盐水腹腔注射+0.5 mL食用油灌胃;ADM组为5 mg/kg ADM腹腔注射+0.5 mL食用油灌胃;MIF组为30 mg/kg MIF灌胃+0.2 mL生理盐水腹腔注射;ADM+MIF组为5 mg/kg ADM腹腔注射+30 mg/kg MIF灌胃。观察各组裸鼠移植瘤情况。结果：（1）5 μmol/L MIF对MCF-7/ADM细胞的抑制率小于5%,与未用MIF组的抑制率比较差异无统计学意义（P>0.05）。（2）ADM对MCF-7/ADM细胞的半抑制率为17.21 mg/L,而对非耐药乳腺癌细胞MCF-7细胞的半抑制率为0.42 mg/L,ADM对MCF-7/ADM细胞的半抑制率明显高于MCF-7的半抑制率（P＜0.05）。（3）5 μmol/L MIF与ADM联合处理MCF-7/ADM细胞后,MCF-7/ADM半抑制率为1.96 mg/L,明显低于单用ADM组的半抑制率（P＜0.05）。逆转ADM耐药倍数为8.78。（4）ADM+MIF组瘤体积［（232.5149±309.2377）mm3］均低于NS组的瘤体积［（962.2309±261.1313 ）mm3］（均P＜0.05）,也低于MIF组的瘤体积［（778.2846±42.6919）mm3］,还低于ADM组的瘤体积［（508.9648±16.2609） mm3］（均P＜0.05）。MIF+ADM组的瘤质量抑制率为78.0%。结论：MIF对耐阿霉素的人乳腺癌细胞MCF-7/ADM体内外均有逆转耐药性的作用。     

人肺腺癌多药耐药细胞系的建立及其生物学特征

目的 建立人肺腺癌多药耐药细胞系。方法 以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系SPC-A-1为诱导对象,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法,诱导建立人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP;MTT法测定药物敏感性,透射和扫描电镜观察形态变化,常规染色体检测分析染色体变化。结果 用192d建成人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP,它对顺铂的耐药指数为11.2,对顺铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱和足叶乙甙等药物有不同程度的耐药性,但对羧基喜树碱无耐药性,电镜观察可见SPC0-A-1/CDDP细胞胞核不规则,较大,有丰富的微绒毛。结论 本研究建立了稳定的人肺腺癌多药耐药细胞系（SPC-A-1/CDDP）,可应用于下游实验。     

重组人生长激素联合奈达铂在体外对人食管癌细胞株EC109作用的实验研究

目的 研究重组人生长激素(rhGH)在体外对人食管癌细胞生长的影响.方法 实验分为对照组、rhGH组、奈达铂(nedaplatin,NDP)组和rhGH NDP 组共4组,利用体外细胞培养、MTT比色法、流式细胞术及免疫细胞化学等方法,测定不同浓度的rhGH对人食管癌细胞株EC109细胞抑制率、细胞周期、增殖指数(PI)及核增殖抗原Ki-67表达的影响.结果 rhGH在体外不能明显促进EC109细胞分裂增殖,对照组与rhGH组、rhGH NDP组与NDP组比较细胞抑制率、PI、Ki-67表达强度差异均无统计学意义(均P＞0.05);rhGH各亚组间比较差异亦无统计学意义(均P＞0.05);NDP组、rhGH NDP组与rhGH组、对照组比较细胞抑制率增加,阻滞于G0～G1期的细胞数增加,S期细胞明显减少,PI明显降低,Ki-67表达强度明显下降(均P＜0.05).结论 重组人生长激素在体外不能明显促进食管癌EC109细胞生长.     

卵巢癌顺铂耐药细胞系的建立

目的 :建立人卵巢癌体外耐药模型 ,研究卵巢癌对顺铂的耐药特征。方法 :模仿临床卵巢癌化疗模型 ,采用中等浓度、间歇作用法 ,从人卵巢癌细胞株SKOV3培养出对顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP ;倒置显微镜下观察细胞形态 ;MTT法、单克隆形成法检测耐药细胞的耐药指数 ;流式细胞仪检测两种细胞的细胞周期分布。结果 :SKOV3/DDP细胞形态无明显改变 ;耐药指数用MTT法检测为 1 8,单克隆形成法检测为 8;SKOV3主要分布于G0 -G1期 ,SKOV3/DDP主要分布于S期及G2 -M期。结论 :中等剂量、间歇作用法可以诱导出卵巢癌细胞株SKOV3对顺铂耐药性。此项研究结果可为临床卵巢癌化疗方案的制定、复发癌二线化疗药物的选择提供理论依据     

食管癌细胞株中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及生物学鉴定

目的:用无血清培养基方法从人食管癌细胞株KYSE-150?TE-1中分离富含肿瘤干细胞的细胞球并鉴定其生物学特性?方法:运用无血清培养基培养KYSE-150?TE-1细胞,观察细胞球的生成及在有血清培养基中的分化情况,利用MTT法以及Transwell小室法研究食管癌细胞球的增殖情况和侵袭能力,流式细胞仪检测分子标志CD44?CD271的表达?结果:KYSE-150?TE-1细胞在无血清培养基培养条件下可以获得可稳定传代的细胞球,细胞球细胞的增殖能力和侵袭能力均高于其亲本细胞;无血清培养基培养下KYSE-150细胞球中CD44+?CD271+?CD44+CD271+细胞分别为(64.92 ± 11.04)%?(28.27 ± 6.79)%?(24.07 ± 5.39)%,均显著高于亲本细胞[(37.04 ± 6.30)%?(3.69 ± 0.49)%?(1.64 ± 0.11)%,P均< 0.05]?TE-1细胞球中CD44+?CD271+?CD44+CD271+细胞占(6.41 ± 0.87)%?(2.58 ± 0.17)%?(0.27 ± 0.53)%,均显著高于亲本细胞[(1.87 ± 0.18)%?(0.44 ± 0.10)%?(0.09 ± 0.02)%,P均< 0.05]?结论:应用无血清培养基可以从KYSE-150?TE-1细胞系中分离出具有干细胞特性的食管癌细胞球,CD44?CD271分子可能是食管癌干细胞的标志?     

18种人肿瘤细胞株药物敏感性与基因表达的关系

目的 探讨18种人肿瘤细胞对化疗药物的敏感性与基因表达的关系。方法 采用MTT法检测细胞株对阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、丝裂霉素（MMC）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）和卡氮芥（BCNU）的敏感性。流式细胞术检测P-糖蛋白（P-gP）、谷胱甘肽-s-转移酶-π（GSTπ）、肺耐药蛋白（LRP）、多药耐药相关蛋白（MRP）和甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）等耐药相关基因和Fas、bcl-2、p53和p16等凋亡调控基因的表达。结果 不同细胞株对同一药物敏感性有较大差异。相关分析表明，细胞株对DDP的敏感性与p53表达呈负相关（P=0．041），对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关（P〉0．05）。结论 细胞株对DDP的敏感性与p53表达有关。     

木犀草苷对人食管鳞状癌Eca109细胞生长的抑制作用及其机制

目的 研究木犀草苷对人食管鳞状癌Eca109细胞生长的抑制作用及其机制。方法 Eca109细胞经不同浓度木犀草苷处理后,MTT法检测Eca109细胞增殖;倒置显微镜观察Eca109细胞形态的变化;流式细胞术检测Eca109细胞周期变化及细胞凋亡情况;RT-PCR检测Eca109细胞cyclin D1、survivin和c-myc基因表达。结果 MTT实验表明,木犀草苷80、120、160、200、240 μmol/L对Eca109细胞均有抑制作用,且与浓度相关。木犀草苷可引起Eca109细胞形态改变、体积缩小,并与周围细胞脱离,浓度为240 μmol/L时使细胞呈出芽状,有的细胞伸出多个伪足样突起;浓度为160、240 μmol/L时,可将细胞阻滞于G₂/M期,诱导细胞凋亡;浓度为240 μmol/L并处理Eca109细胞48 h后,使Eca109细胞cyclin D1、survivin和c-myc基因表达低于对照组（P＜0.05）。结论 木犀草苷对食管鳞状癌Eca109细胞的生长有显著抑制作用,其通过改变细胞周期、诱导细胞凋亡及抑制相关基因的表达发挥抗肿瘤作用。     

人胰腺癌耐药细胞株Patu8988/5-Fu的建立及其耐药机制的初步探讨

目的:建立人胰腺癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药细胞株Patu8988/5-Fu,观察其生物学特性并初步探讨其耐药机制.方法:采用5-Fu体外低浓度梯度递增联合大剂量冲击诱导法诱导培养人胰腺癌细胞株Patu8988,10个月建立获得性Patu8988/5-Fu多药耐药细胞株,光镜观察形态学变化;MTT法分析Patu898...