绿色荧光蛋白标记的报告系统优化K562细胞转染条件的研究

本研究旨在提高基因转染人红白血病细胞株K562的转染效率，同时观察绿色荧光蛋白（GFP）作为报告系统用于转染条件优化的可行性。目的基因以GFP为报告系统，通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞，荧光显微镜下观察并计算转染效率。结果表明：电转染较脂质体转染K562细胞的效率高，电穿孔转染效率在10％左右，而脂质体转染效率小于1％。结论：电转染较脂质体转染K562细胞的效率高，GFP可作为报告系统优化K562细胞转染条件。     

THP-1单核细胞不同转染方法的比较

背景：人单核细胞系THP-1细胞是典型的悬浮细胞系,其转染并瞬时表达外源蛋白比一般贴壁细胞相对困难。其中DEAE-葡聚糖介导的细胞转染方法虽然建立较早,但在国内应用很少。目的：采用不同质粒转染方法介导质粒绿色荧光蛋白真核表达质粒（pEGFP-N1）转染人THP-1单核细胞,以获得较高转染效率的方法。方法：分别采用DEAE-葡聚糖、Lipofectamine 2000、FuGENE 6、梭华-Sofast转染试剂不同方法介导质粒绿色荧光蛋白真核表达质粒进行转染,测定不同方法的转染效率、及其对细胞活力的影响。结果与结论：荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测结果均显示DEAE-Dextran介导的转染效率最高,Lipfectamine 2000脂质体次之,FuGENE 6和梭华-Sofast则明显低于前二者。将质粒绿色荧光蛋白真核表达质粒体外成功转染人THP-1单核细胞中,通过优化转染方法提高转染效率、降低对细胞活力的影响。     

不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨

目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞A20最佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在A20细胞中的表达及作用奠定基础.方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析这三种转染方式对A20细胞的转染效率.结果:脂质体转染效率最低,仅见个别细胞有绿色荧光,NucleofectorTM核酸转染效率约为10%,浓缩后的慢病毒载体介导转染法效率最高,可达80%以上.结论:对于悬浮细胞A20而言,浓缩后的慢病毒载体介导的转染法是最佳的转染方式,该方法在将外源基因转染至悬浮细胞方面值得推广,也为极难转染的细胞做稳定转染提供参考价值.     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景：近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的：探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法：以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine^TM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论：采用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×10^8L^-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1：3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高（P〈0.01）,而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

PEI与脂质体介导基因转染的比较研究

目的：比较新型转染试剂阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）与脂质体2000介导的血管内皮细胞生长因子 VEGF165基因转染人胚肾细胞293T 的转染效率,为基因转染提供新的方法。方法分别采用脂质体和不同 N／P 比值的 PEI 将合成的含有绿色荧光蛋白（GFP）和 VEGF165的质粒转入293T 细胞。转染24 h 后,采用 CCK-8试剂盒检测细胞活性;转染48 h 后在荧光显微镜下观察比较两种转染方法的转染效率,并通过 ELISA 方法检测细胞上清液中 VEGF165浓度,比较两种方法的转染效果。结果当 N／P＝9时,PEI 转染的细胞活性与脂质体转染相近,对细胞的毒性较小;此时,PEI 转染效率与脂质体也相似,均可达到约70％;同样,转染后细胞上清中 VEGF165浓度较未转染组提高（P ＜0．05）,但两种方法转染组间比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论PEI 作为一种新型的转染试剂,与脂质体相比,在一定比例范围内,具有转染效率高,对细胞毒性小且价格低廉的优势,有望成为基因转染的有效载体。     

Lipofectamine 2000介导重组siRNA质粒载体转染SGC7901的条件优化

目的寻求Lipofectamine 2000介导外源基因体外转染胃癌细胞SCG7901的最佳条件,建立有效的转染体系。方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,统计分析在不同质粒与脂质体的用量比、培养基选择、转染作用时间等条件下脂质体介导外源基因导入胃癌细胞的效率。结果用24孔板培养细胞时,在细胞融合度约90%,质粒用量为0.6μg,脂质体用量1.2μl(两者质量/体积比为1:2),转染作用时间为8 h时,转染效率为465%%,细胞存活率约78%。结论按以上转染体系,可获得较为满意的结果。     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景:近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的:探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法:以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体LipofectamineTM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论:采用脂质体LipofectamineTM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×108L-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1:3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高(P<0.01),而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞:筛选理想浓度

背景:siRNA转染是完成RNA干扰的关键一步.目前用于心肌细胞的RNA干扰技术多以质粒为载体转染长链shRNA,其步骤复杂.脂质体转染化学合成短链siRNA是一种操作简便,低毒高效的转染方法,将其应用于心肌细胞转染,有利于RNA干扰技术的推广应用.目的:筛选脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的最佳浓度,以及简单高效的RNA干扰操作方法.方法:应用脂质体siPORT~(TM)>NeoFX~(TM)转染试剂介导5,10,20,30 nmol/L的CY3-Negative siRNA转染心肌细胞,同时设立空白对照组,转染24 h后分别应用荧光显微镜,流式细胞仪检测转染效率和细胞凋亡率,筛选最优浓度.根据优化浓度转染PHB siRNA,48 h后检测蛋白表达验证转染效果.结果与结论:随CY3-Negative siRNA浓度的增加,在荧光显微镜下观察到激发出红色荧光的细胞比例随之增加,流式细胞仪检测出各组平均转染效率也依次增高(P＜0.05),其中30 nmol/L组转染效率最高(P＜0.05),而各实验组与空白对照组之间的细胞凋亡率差异无显著性意义(P＞0.05).将心肌细胞转染30 nmol/L的PHB siRNA,48 h后PHB蛋白表达平均下降74.11%(P＜0.05).实验结果表明,脂质体转染试剂siPORT~(TM) NeoFX~(TM)介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的理想浓度是30 nmol/L.     

SDF-1 cDNA转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究旨在探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）cDNA瞬时转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）前后hBMSCs中SDF-1mRNA表达的情况。在分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体的基础上,通过脂质体介导法将SDF-1真核表达质粒转染至hBMSCs,观测绿色荧光蛋白的表达并用RT-PCR方法检测瞬时转染效率。结果发现：SDF-1-pIRES2-EGFP瞬时转染后hBMSCs的SDF-1mRNA表达增高约20%左右。结论：阳离子脂质体可以将SDF-1cDNA真核表达质粒瞬时转染入hBMSCs,但转染效率低下,不能获得足够数量的稳定转染细胞供后续实验,因此需对转染方法作进一步的探讨。     

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景：基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的：评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点：以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料：质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法：首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标：采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因（绿色荧光蛋白基因pGFP-N2）,分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。结果：Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论：对Hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。     

两种转染人宫颈癌HeLa细胞的方法学比较

目的比较两种不同的转染方法,即Lipofectamine2000和Nucleofector Kit转染人宫颈癌Hela细胞的转染效率。方法分别选取Lipofectamine2000转染和Amax核电转(Amax Nucleofector Kit)两种转染方法。HeLa细胞培养贴壁达到85%~90%后传代获取HeLa单细胞悬液,细胞分成2管,其中1管直接采用核电转法转染红色荧光蛋白(DsRed)后种植于1.5 ml的细胞培养皿;另一管先种植于细胞培养皿,待贴壁24 h后采用Lipofectamine2000转染DsRed。细胞的存活率采用台盼兰进行检测。分别比较两者转染效率及转染前后细胞的存活率,进一步探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性。结果 Lipofectamine2000的基因转染率仅为20.23%,而核电转法的转染率为90.14%,后者为前者的4.46倍。Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为96.34%和90.76%,而核电转组分别为95.98%和78.35%。结论细胞核电转法能高效稳定地转染人宫颈癌细胞株HeLa细胞。     

小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Fit-1基因表达的抑制作用

本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长N子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制。采用脂质体介导的方法将构建的人flt-1基N特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用（3418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT—PCR和免疫印迹反应检测flt-1mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT～PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt—1基因和蛋白在细胞中的表达,两纽阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46．1％和65．4％;flt—1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力（4．3±1．2）％较对照组（12．7±1．9）％及（9．6±1．7）％明显降低（P〈0．01）。结论：VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转染入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平下降。这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移。     

人胚胎干细胞外源基因的瞬时表达效率

背景：人类胚胎干细胞的修饰和操作技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同。目的：对比观察两种化学转染试剂转染含不同启动子的增强型绿色荧光蛋白表达载体在人胚胎干细胞中的表达效率。方法：采用Fugene HD和lipofectamine2000分别转染无滋养层培养的H9细胞,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术分析不同载体pCAG-EGFP、pEGFP-N3在H9细胞中的表达效率。结果与结论：Fugene HD转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为（42.45±3.32）%、（25.95±1.91）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。lipofectamine2000转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为（1.94±0.18）%、（1.49±0.33）%。采用Fugene HD转染的表达效率均高于lipofectamine2000转染的表达效率（P〈0.05）。结果显示在人胚胎干细胞的H9细胞系中,Fugene HD的转染效率显著高于lipofectamine2000;CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白表达效率显著高于CMV启动子。     

沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病KG-1细胞凋亡的影响

摘要本研究旨在探讨沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病细胞株KG-1增殖和凋亡的影响。将SUV39HIsiRNA经Lipofectamine…2000转染至KG-1细胞,应用MTS法检测细胞增殖率,观察sUV39111siRNA对KG-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞凋亡;Westernblot检测SUV39H1siRNA作用后P15和凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达。结果表明,沉默SUV39H1基因可抑制细胞增殖,SUV39H1siRNA浓度为30、60、120、240nmol／L作用48h后,KG-1细胞的增殖率分别为（76．43±1．98）％、（51．31±1．84）％、（37．31±1．61）％、（18．94±3．22）％,差异具有统计学显著意义（P〈0．05）;SUV39HIsiRNA可上调P15基因的表达;SUV39H1siRNA可诱导细胞凋亡,30、60、120nmoL／LSUV39H1siRNA作用48h后,KG-1细胞凋亡率分别为（40．2±5．1）％、（56．8±4．8）％、（71．6±5．6）％,差异有统计学显著意义（P〈0．05）;抗凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达减少。结论：SUV39H1siRNA能抑制KG-1细胞的增殖并诱导其凋亡,有望成为白血病治疗的-个新的靶点。     

叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺纳米载体转染螺旋神经节细胞

背景：新型阳离子纳米材料叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺易于合成和改性,稳定性好,结构及性能容易调控,已被作为基因治疗转染载体应用于多种疾病的研究。 目的：观察叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺转染体外培养小鼠内耳螺旋神经节细胞的可行性及特点。 方法：分别以叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺（实验组）、阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000（对照组）作为载体,制备携带增强型绿色荧光蛋白的转染载体系统。将昆明小鼠螺旋神经节细胞分别培养于含实验组和对照组转染载体系统的DMEM/F-12培养基中,培养24 h后,MTT法观察载体系统的细胞毒性,倒置荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达强度,流式细胞仪检测细胞转染率。 结果与结论：两种载体分别转染后,螺旋神经节细胞形态均未发生明显改变,但两组载体对螺旋神经节细胞均有一定的毒性,实验组载体毒性较小且转染效率较高（P〈0.05）。结果说明叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺基因转染体外螺旋神经节细胞的转染效率及细胞毒性均优于传统的阳离子脂质体。     

纳米级阳离子聚合物优化转染siRNA的研究

背景：转染是基因研究最关键的始动环节，高效安全的基因转染试剂是基因研究的热点问题。纳米级材料表面活性强，易于表面修饰，膜通透性高，如何将物质纳米化应用于基因转染尚在探索之中。目的：观察不同分子质量、结脂度的纳米级阳离子聚合物的转染效率，筛选低毒、高效的优化转染试剂。设计：对照实验。单位：南方医科大学基因研究所。方法：实验于2006-03／2007-06在南方医科大学基因工程研究所实验室完成。以脂质体为阳性对照，将9种不同分子质量、结脂度的纳米级阳离子聚合物聚乳酸聚乙醇酸、壳聚糖-聚己内酯、聚乙烯亚胺-聚乙二醇，包裹FITC标记的以bcl-2基因为靶标的siRNA（0．2nmol／L），转入无血清培养的白血病细胞株K562，于转染后6h后补加20％胎牛血清培养基。MTT法测定24，48，72h后细胞增殖状况，荧光显微镜检测转染48h后各纳米材料转染效率，流式细胞仪检测白血病细胞株K562细胞Bcl-2蛋白的表达和凋亡率。结果：①荧光显微镜结果：不同材料的纳米级颗粒，其转染效率有统计学差异（P〈0．05），同种材料的纳米结构因其结脂度不同，其转染效率也有统计学差异（P〈0．05）。②MTT结果：表明细胞增殖率与转染率正相关。③流式细胞仪结果表明：转染siRNA引起的靶基因表达抑制以及细胞凋亡率与转染效率正相关。结论：分子质量为1800／2000，脂结合力为29％的纳米级聚乙烯亚胺-聚乙二醇颗粒，为低毒、高效的转染试剂。     

MicroRNA-223在淋巴细胞白血病原代细胞中表达及作用机制的研究

本研究旨在探讨急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）原代细胞中MicroRNA-223与LMO2基因的表达水平及MicroRNA-223的作用机制。应用人淋巴细胞分离液分选ALL、CLL患者及正常人骨髓中淋巴细胞,在ALL、CLL患者骨髓淋巴细胞中转染MicroRNA-223的类似物靶向升高细胞中MicroRNA-223的表达,在正常人骨髓淋巴细胞中转染MicroRNA-223抑制物靶向敲低细胞中MicroRNA-223的表达。转染后培养72 h,用RT-PCR方法检测转染前后MicroRNA-223和LMO2表达量及其相关性,并用流式细胞术进一步观察细胞凋亡和细胞周期的变化。结果表明,转染MicroRNA-223类似物前,ALL、CLL患者中MicroRNA-223表达水平为（433.11±144.88）,LMO2水平为（807.10±238.41）,正常人转染MicroRNA-223抑制物前,MicroRNA-223表达水平为（949.59±267.39）,LMO2的表达为（455.32±176.83）;MicrRNA-223的表达在正常人中明显高于ALL、CLL患者（P〈0.05）,而LMO2的表达在正常人中明显低于ALL、CLL患者（P〈0.05）。转染后,ALL、CLL患者中MicroRNA-223表达明显增加（571.86±142.00）（P〈0.05）,而LMO2表达明显减少（651.97±230.12）（P〈0.05）;在正常人中MicroRNA-223表达明显降低（646.32±172.93）（P〈0.05）,LMO2的表达明显升高（541.27±158.86）（P〈0.05）。转染后细胞周期及细胞凋亡率的变化表现为,在ALL、CLL患者转染前细胞周期G1/G2细胞比例为（94.75±3.15）%,S期为（5.14±3.12）%;转染后G1/G2细胞比例明显增加（97.03±2.08）%（P〈0.05）,在S期明显减少（2.97±2.08）%（P〈0.05）;转染前细胞凋亡率为（54.47±8.72）%,转染后为（60.48±8.81）%,后者明显增加（P〈0.05）。正常人转染前细胞周期G1/G2细胞比例是（96.73±2.26）%,S期是（3.25±2.26）%;转染后G1/G2细胞比例明显减少（94.55±2.77）%（P〈0.05）,在S期明显增加（5.45±2.77）%（P〈0.05）,细胞凋亡率为（59.02±10.20）%,转染后明显减少（51.96±10.20）%（P〈0.05）。结论：淋巴细胞白血病原代细胞中MicroRNA-223表达降低,LMO2表达增高,导致淋巴细胞增殖周期及凋亡异常,这可能是淋巴细胞白血病的发病机制之一。     

抑制mll-af9融合基因表达对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响

本研究探讨siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的mll-af9融合基因的影响.选择THP-1细胞特有的m11-af9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段.以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,用RTPCR法比较转染前后mll-af9 mRNA表达水平的变化,以MTT法检测细胞增生抑制率,流式细胞术检测细胞周期的改变和细胞凋亡水平.结果表明siRNA转染效率为(69.1±1.8)%,转染siRNA后THP-1细胞生长受到明显抑制,m11-af9融合基因表达量大幅度减少,细胞周期发生了明显的变化,主要表现为G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡水平增高,而对照组siRNA转染后则无上述改变.结论利用siRNA靶向干扰mll-af9融合基因的表达可以有效抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1的增殖.