胶质瘤中 Nanog 启动子区组蛋白修饰的检测及意义

目的检测胶质瘤组织中Nanog启动子区组蛋白修饰与Nanog的表达，并探讨其在胶质瘤发展中的作用。方法Westernblot检测胶质瘤及正常脑组织中抗组蛋白H3乙酰化（H3ac）及抗H3K9三甲基化（H3K9me3）蛋白的表达．染色质免疫共沉淀．（ChIP）Real—timePCR技术检测Nanog启动子区域组蛋白H3乙酰化及H3K9甲基化水平，Real—timePCR检测相应组织中NanogmRNA表达情况。结果Westernblot结果显示：胶质瘤组织中H3ac的表达量较正常脑组织显著增高（F=72．80，P=0．00），H3K9me3的表达量较正常脑组织显著下调（F=84．79，P=0．00）。ChIP—Real—timePCR检测显示：胶质瘤中Nanog启动子区组蛋白H3乙酰化水平高于正常脑组织（F=59．34，P=0．00），H3K9甲基化程度低于正常脑组织（F=74．88，P=0．00）。Real—timePCR结果显示：高级别胶质瘤中NanogmRNA相对表达量高于低级别胶质瘤（t=11．41，P=0．00）。结论Nanog启动子区的组蛋白修饰可调节其蛋白的表达，并且是影响脑胶质瘤的发生和发展的重要机制之一。     

胶质瘤U87细胞中AKT2基因表达对化疗药物替尼泊苷敏感性的影响

目的探讨脑胶质瘤U87细胞中AKT2基因表达对替尼泊苷（VM-26）敏感性的影响。方法体外将慢病毒介导的AKT2-shRNA表达载体转染胶质瘤U87细胞,作为实验组;转染GFP—shRNA的U87细胞作为阴性对照组,未转染的U87细胞作为空白对照组。应用RT—PCR、Westernblot检测3组U87细胞中AKT2mRNA和蛋白的表达变化。应用MTT法检测3组U87细胞对VM-26敏感性的变化。结果与阴性对照组和空白对照组比较,实验组转染后的U87细胞AKT2mRNA和蛋白的表达水平明显下降（P〈0．01）。实验组VM-26对U87细胞的半数抑制量（IC50）为（6．46±0．42）μg／ml,阴性对照组为（1．16±0．25）μg／ml,空白对照组为（1．15±0．22）μg／ml,实验组与两对照组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AKT2-shRNA抑制AKT2基因表达,能增加人脑胶质瘤U87细胞株对化疗药物VM-26的敏感性。     

胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区甲基化检测及意义

目的检测胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区甲基化表达,并探讨其Nanog基因表达的关系。方法使用无血清悬浮培养法获得胶质瘤干细胞并鉴定;采用甲基化特异性多聚酶链反应(MSP)分别检测胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系U87中Nanog基因启动子区甲基化状态,实时定量多酶链反应(RT-PCR)检测相应细胞中Nanog表达情况。结果由U87胶质瘤细胞系成功获得胶质瘤干细胞(GSCs);MSP检测胶质瘤干细胞和U87细胞系Nanog启动子区皆呈非甲基化状态,且胶质瘤干细胞中Nanog非甲基化程度高于U87细胞系(t=6.988,P=0.000)。实时定量PCR结果显示胶质瘤干细胞中Nanog mRNA相对表达量高于U87细胞系。结论胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区呈非甲基化状态,可能与Nanog基因表达有关,且可能促进Nanog的转录并维持着胶质瘤干细胞的恶性生物学活性。     

曲古抑菌素A调节U251细胞组蛋白乙酰化和NDRG2表达

目的观察曲古抑菌素A（TSA）对脑胶质瘤细胞组蛋白H4乙酰化的调节和对NDRG2表达的影响及其对细胞增殖的作用。方法0．1～1．0μmol／LTSA分别处理U251细胞12～96h后用四甲基偶氮唑蓝（MTr）法比色检测U251细胞的生长活性,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期,实时定量多聚酶链反应（real—timePCR）检测U251细胞NDRG2的mRNA表达水平,Westernblot方法检测组蛋白H4乙酰化和NDRG2蛋白的表达水平。结果TSA可明显抑制U251细胞的增殖;流式细胞仪检测显示G0／G1期细胞比例增加,S期细胞比例略有降低,表明发生G0／G1阻滞,随用药剂量的增加还伴有明显的G2／M阻滞。加入不同浓度TSA后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显增高,组蛋白H4的乙酰化水平也明显增强。结论一定浓度的TSA可抑制U251细胞的增殖,提高组蛋白H4乙酰化及NDRG2的表达水平,这可能是其抗肿瘤作用机制之一。     

芹菜素对脑胶质瘤细胞U87增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的 探讨芹菜素对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及作用机制。方法 体外培养脑胶质瘤U87细胞,加入20、40、80 μmol/L芹菜素干预,以培养基作为空白对照组。使用MTT法检测U87细胞的增长抑制率,使用Hocst染色法观察细胞凋亡情况;使用Transwell检测U87细胞侵袭能力;划痕实验法检测U87细胞迁移能力;使用免疫印迹法检测U87细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、Bak1、Caspase-3表达水平。结果 与空白对照组比较,芹菜素组细胞抑制率显著增加（P<0.05）、细胞凋亡数目明显增加（P<0.05）、细胞侵袭数目显著下降（P<0.05）、细胞迁移数目明显减少（P<0.05）,U87细胞MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达显著下降（P<0.05）,Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.05）;而且均呈浓度依赖性。结论 芹菜素可有效抑制脑胶质瘤U87细胞增殖、促进凋亡,可能与下调MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达水平,上调Caspase-3表达有关。     

去乙酰化酶抑制剂HDACIs抗胶质瘤研究进展

DNA甲基化和组蛋白乙酰化是表观遗传学经典的调节途径。其中,组蛋白乙酰化途径在脑胶质瘤发生过程中起到重要作用,并受组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)两类酶调节。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC inhibitors,HDACIs)可以通过改变细胞内组蛋白乙酰化程度改变染色质空间结构,从而抑制目的基因转录,对肿瘤发生起到关键作用。本文就组蛋白乙酰化修饰与脑胶质瘤的关系及HDACIs在脑胶质瘤治疗中的应用进行综述。     

抑癌基因的乙酰化与去乙酰化

在真核生物中,组蛋白乙酰化与去乙酰化在基因表达调控中起重要作用。组蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰是一个与基因活化和抑制密切相关的动态过程,高乙酰化标志活跃转录而低乙酰化则与转录抑制相关。而组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是组蛋白乙酰化的关键酶,其决定着组蛋白的乙酰化程度,参与了肿瘤异常基因表达。而抑癌基因通过对组蛋白赖氨酸末端的乙酰化修饰而改变染色体的结构,从而参与肿瘤的发生。脑胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤,其发生发展与抑癌基因的失活有关,而组蛋白的乙酰化水平与肿瘤的产生、增殖、致癌基因和肿瘤抑制基因的表达水平有密切的关系。因此现将抑癌基因的乙酰化与去乙酰化做一阐述。     

膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人骨髓基质干细胞对脑胶质瘤细胞的体外靶向抗肿瘤作用

目的：探索经膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）修饰的人骨髓基质干细胞（hMSCs）对脑胶质瘤的靶向抗肿瘤作用。方法：通过体外Transwell系统研究hMSCs向胶质瘤的迁徙能力。采用经全长人TRAIL（hTRAIL）重组的腺相关病毒（rAAV）载体（rAAV hTRAIL）对骨髓基质干细胞（MSCs）进行修饰。将hTRAIL修饰的MSCs与人胶质瘤细胞（U87MG）在体外共同培养,分析其对脑胶质瘤的靶向抗肿瘤作用。结果：hMSCs向胶质瘤细胞的迁徙具有高度特异性。经TRAIL修饰的hMSCs不仅在MSCs表面表达全长TRAIL,且能在培养基中分泌可溶性TRAIL。经rAAV-hTRAIL转染后,hMSCs细胞凋亡作用无增加。将TRAIL修饰的hMSCs与U87MG细胞共培养,与采用可溶性TRAIL治疗后相比较,可明显提高U87MG细胞的凋亡率。结论：在体外实验中,hMSCs向胶质瘤细胞的迁徒具有高度特异性,且能诱导胶质瘤细胞凋亡,并提高对sTRAIL不敏感胶质瘤细胞的凋亡率。由此推测膜结合型TRAIL修饰的MSCs在肿瘤微环境中对脑胶质瘤具备靶向抗肿瘤效应。MSCs可能成为脑胶质瘤靶向治疗的有效载体。     

Nanog基因在脑肿瘤干细胞中的表达及意义

目的 探讨Nanog基因在脑肿瘤干细胞(BTSCs)的表达以及生物学意义.方法 无血清悬浮培养法从U87胶质瘤细胞株分离培养BTSCs.免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测U87肿瘤细胞及其BTSCs中Nanog的表达,双重免疫细胞化学染色法检测Nanog/CD133共表达情况.结果 在U87胶质瘤细胞株中成功分离培养出BTSCs,Nanog蛋白在U87肿瘤细胞和BTSCs中的阳性率分别为(64.1±18.2)%和(97.2±1.8)%,且Nanog+/CD133+细胞共表达于部分细胞中;Nanog mRNA相对含量在U87肿瘤细胞和BTSCs中分别为0.3851±0.0771和0.6032±0.1223,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 U87细胞株中存在BTSCs.Nanog在U87细胞株中高表达,在BTSCs中表达水平高于U87肿瘤细胞且Nanog与CD133存在共表达,表明Nanog与BTSCs关系密切.

Abstract：

Objective To detect the expression of Nanog in glioma cell line U87 and the relationship with BTSCs.Methods BTSCs were isolated from glioma cell line U87 and cultured in simplified serum-free neural stem cell medium by nanosphere suspension culture method spheres,and purified continuously through the monoclonal formation experiment.The immunofluorescence staining of cells was employed to identify the BTSCs and differentiated cells.The expression of Nanog mRNA was examined by RT- PCR and Nanog protein was detected by immunocytochemistry in U87 and BTSCs respectively.Double immunocytochemistry staining was used to detect the co- expressions of Nanog/CD133.Methods BTSCs were isolated ,cultured and purified successfully from glioma cell line U87.Both Nanog mRNA and protein were expressed in U87 and BTSCs.The expression rate of immunopositive cells was (64.1 ±18.2)% in U87 and (97.2±1.8)% in BTSCs respectively(t =5.719,P =0.000).The Nanog+/CD133+ cells could be found co-expressed in U87 and BTSCs by using double immunocytochemistry s taining.The relative level of Nanog expression was 0.3851 ±0.0771 in U87 and0.6032±0.1223 in BTSCs(t =4.770,P =0.000).Conclusion BTSCs exist in glioma cell line U87 in vitro.The levels of Nanog expression in BTSCs were higher than that in U87.Nanog expression was associated with the genesis and differentiation state of glioma.The overexpression of Nanog and co- expression of Nanog/CD133 showed that it might contribute to the existence of BTSCs,which lay a foundation to the further explore its role in biological behaviour of glioma.Expression of Nanog in U87 indicated the close relationship between glioma and stem cell,and suggested Nanog may play a critical role in the development of glioma.     

三个不同位点组蛋白修饰在人脑胶质瘤中的意义

目的 探讨组蛋白修饰与人脑胶质瘤发生及病理分级的关系.方法 选取西京医院神经外科自2006年至2008年病理确诊的胶质瘤患者肿瘤组织标本67例,采用免疫组织化学方法,检测组蛋白3个位点(H4K12Ac、H4R3monoMe、H4K20triMe)的修饰水平,并对结果进行统计学分析.结果 组蛋白3个位点在胶质瘤中均有修饰,有2个位点(H4K12Ac、H4R3monoMe)的修饰水平随胶质瘤病理级别的增高而升高,差异有统计学意义(P＜0.05),H4K20triMe的修饰水平则与肿瘤的病理级别无明显相关.结论 组蛋白修饰与人脑胶质瘤的发生有关,且修饰水平的变化与病理级别相关.     

吉非替尼对表达PTEN的胶质瘤细胞株U87细胞增殖活性的影响

目的探讨表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼对表达磷酸酶一张力蛋白同源物（FrEN）的胶质瘤细胞株U87细胞增殖活性的影响。方法将人脑恶性胶质瘤细胞株U87细胞（PTEN缺失）置人DMEM中培养,根据转染质粒不同分为空白组（不转染任何质粒）、空载体组（转染pCDNA3．1载体）和PTEN组（转染pCDNA3．1-PTEN质粒）,采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）,碘化丙碇双掺入法分析细胞DNA合成水平,采用流式细胞仪分析细胞周期,采用蛋白免疫印迹法分析蛋白表达。结果与空白组和空载体组相比,PTEN组PTEN蛋白表达水平明显升高,而磷酸化Akt蛋白表达水平明显降低。PTEN组BrdU阳性细胞比例[（13．5±2．7）％]明显低于空白组[（39．5±4．2）％;P〈0．05]和空载体组为[（40．7±5．1）％;P〈0．05]。PTEN组GJG。期细胞比例[（80．2±6．6）％]明显高于空白组[（43．2±5．2）％;P〈0．05]和空载体组[（41．1＋4．7）％;P〈0．05],而s和G2,M期细胞比例[分别为（35．7±3．7）％和（21．1±2．1）％]明显低于空白组[分别为（36．5±4．1）％和（22．4±1．9）％;P〈0．05]和空载体组[分别为（12．7＋2．O）％和（7．1±1．1）％;P〈0．051。结论高表达PTEN蛋白能够增强胶质瘤细胞株U87细胞对吉非替尼的敏感性。     

缺氧条件下全反式维甲酸对U87胶质瘤细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的研究模拟缺氧条件下全反式维甲酸(ATRA)对U87胶质瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及其可能的机制。方法 U87胶质瘤细胞分为空白对照组、缺氧对照组、低浓度干预组、高浓度干预组。CoCl2模拟缺氧,U87胶质瘤细胞经不同浓度ATRA(5、10μmol/L)干预后,实时定量PCR法及Western blot法分别检测细胞中VEGF mRNA、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA及VEGF蛋白的表达。结果与缺氧对照组相比,低、高浓度干预组VEGF mRNA表达分别为缺氧对照组的(2.08±0.23)倍及(3.13±0.14)倍,两组与缺氧对照组的差异均具有统计学意义(均P<0.01);低、高浓度干预组HIF-1αmRNA表达分别为缺氧对照组的(1.62±0.07)倍及(1.83±0.09)倍,两组与缺氧对照组的差异均具有统计学意义(均P<0.01)。而VEGF蛋白相对表达量在缺氧对照组为(2.15±0.12),低浓度干预组为(2.32±0.20),高浓度干预组为(3.09±0.08),各组间差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论在模拟缺氧条件下,ATRA可在转录及翻译水平增加U87细胞中VEGF的表达,而这种表达上调可能部分通过上调HIF-1α表达实现。     

姜黄素诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞增殖的研究

目的研究姜黄素对脑胶质瘤U87细胞增殖的抑制作用及机制。方法采用10、20、40、60、80μmol/L姜黄素分别处理U87细胞72h后,MTT法检测姜黄素对U87细胞增殖的影响。流式细胞术检测40μmol/L姜黄素处理前后U87细胞周期和凋亡变化。提取40μmol/L姜黄素处理前后不同时间点U87细胞总蛋白,Westernblot检测自噬相关蛋白LC3的表达。结果姜黄素呈剂量依赖性抑制U87细胞增殖(P0.05),半数抑制浓度(IC50)为42.44μmol/L。姜黄素诱导G2-M期细胞周期阻滞,实验组G2-M期细胞比例为(47.71±2.67)%,对照组为(17.96±0.88)%(P0.01);实验组细胞凋亡率为(3.93±0.82)%,对照组为(1.80±0.65)%,两组差异无统计学意义(P0.05)。姜黄素给药12、24、48h,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为(0.89±0.004)、(0.93±0.01)、(1.09±0.02),高于对照组(0.76±0.04)(P0.05);3-MA能减弱姜黄素对U87细胞增殖的抑制作用。结论姜黄素通过诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖。     

Beclin 1 基因对恶性胶质瘤细胞 U87 自噬活性和增殖的影响简

目的研究BeclinJ基因对U87胶质瘤细胞自噬和增殖的影响。方法实验分5组：空白对照组．pSUPER—Bec组（表达BeclinsiRNA）与其阴性对照组（pSUPER—non组）,pcDNA3．1-Bec组（表达BeclinJ基因质粒）与其阴性对照组（pcDNA3．1-non组）。分别转染U87细胞,采用免疫印迹检测Beclin1、LC3和p62蛋白在各组的表达;用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）检测各组细胞增殖率。结果转染后48h,pSUPER—Bec组Beclin1、LC3B—11蛋白表达下降,p62蛋白表达升高。pcDNA3．1-Bec组Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达升高,p62蛋白表达下降。与空白对照组或pcDNA3．1-non组相比．pcDNA3．1-Bec组细胞增殖速度降低（P〈0．05）,其他各组细胞增殖速度无明显差异。结论恶性胶质瘤细胞中自噬相关基因Beclinj表达下降,过表达Beclinl蛋白能增强细胞的自噬活性,抑制细胞的增殖活性。     

ShRNA-AKT2对人脑胶质瘤U87细胞株增殖及凋亡的影响

目的研究通过慢病毒载体靶向抑制丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因表达对胶质瘤细胞株U87增殖、凋亡的影响。方法利用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)干扰载体感染U87细胞株,逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术(Western blot)分别检测转染后细胞株AKT2 mRNA和蛋白表达水平变化,四唑盐(MTT)法检测细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期改变。结果转染AKT2-shRNA可有效降低U87细胞株内的AKT2表达。干扰组细胞从第3 d开始增殖明显降低(P0.05);AKT2-shRNA干扰组细胞的凋亡率为11.80%±1.83%,明显高于阴性对照组的2.01%±0.20%和未转染组的2.13%±0.32%(P0.05);AKT2-shRNA干扰组细胞周期S期细胞百分比显著低于对照组,而G0/G1期细胞比分比显著高于对照组(P0.05)。结论 AKT2-shRNA可抑制胶质瘤细胞株的增殖,并导致肿瘤细胞凋亡增加。     

异柠檬酸脱氢酶1基因突变增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性

目的探讨胶质瘤细胞异柠檬酸脱氢酶1（IDHl）基因突变对替莫唑胺（TMZ）细胞毒性的影响。方法将培养的U87胶质瘤细胞分组转染含空载体（空载体组）、野生型IDHl基因（野生组）和R132H突变型IDHl基因（突变组;IDHl第132位的精氨酸被组氨酸所取代）质粒,利用液相色谱串联质谱法检测细胞上清液中2-羟基戊二酸（2-HG）水平、噻唑蓝法检测细胞增殖活性、实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测细胞caspase3mRNA和蛋白质表达;将含三种不同质粒的U87细胞接种大鼠建立荷瘤大鼠模型并观察大鼠经TMZ治疗后60d存活率。结果与空载体组和野生组比较,突变组细胞上清液中2-HG水平、细胞caspase3mRNA和蛋白质表达水平均显著升高（P〈0．05）,而细胞增殖活性显著下降（P〈0．05）;TMZ治疗后60d,突变组大鼠存活率显著升高（P〈O．05）;空载体组和野生组之间均无统计学差异（P〈0．05）。结论IDHlR132H基因能够增加TMZ对神经胶质瘤细胞的细胞毒性作用并提高其治疗荷瘤大鼠的存活率。