BMP-7/GFP融合基因在人肾小管上皮细胞的表达与定位

目的构建骨成形蛋白-7(BMP-7)/绿色荧光蛋白(GFP)融合基因,观察其在人肾小管上皮细胞的表达与定位.方法将小鼠BMP-7全长cDNA与GFP融合,连接进入真核细胞表达质粒pEGFP-C1中,以脂质体介导的方法将重组表达质粒pEGFP-C1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞.采用Western blot方法检测BMP -7在肾小管上皮细胞的表达;激光共聚焦荧光显微镜观察BMP-7在人肾小管上皮细胞中的定位情况.结果限制性酶切以及DNA测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7/GFP融合基因表达质粒.瞬时转染人肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达量较空载体转染组明显增加;GFP转染的细胞荧光均匀分布在整个细胞中,而pEGFP-C1-BMP-7转染的细胞荧光主要集中在细胞浆和细胞膜表面.结论重组BMP-7/GFP融合蛋白具有GFP自发荧光的特性,且不影响BMP-7在细胞内的正确表达.     

金丝桃素对培养的人视网膜色素上皮细胞钙离子内流的抑制

目的研究蛋白激酶C (PKC) 抑制剂金丝桃素对视网膜色素上皮细胞(RPE cells)钙离子信号共聚成像的影响. 方法使用钙荧光指示剂fluo-3 AM和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM),分析在100 nmol*L-1 佛波酯(PMA)和(或)5个浓度的金丝桃素(1, 2, 3, 4和5 μmol*L-1)刺激时培养的人RPE细胞的钙离子信号的变化. 结果 RPE细胞荧光着色很强,遍布整个细胞,其中细胞核比细胞质更强. 只用PMA或金丝桃素刺激时,可以观察到荧光强度迅速下降,并且5个浓度金丝桃素之间的下降曲线无明显差异. 用PMA预先处理细胞24 h后,再给予金丝桃素刺激发现荧光强度并没有进一步下降. 结论 fluo-3 AM 是人RPE细胞钙离子良好的指示剂,金丝桃素能强力抑制钙离子内流,它作为治疗增殖性玻璃体视网膜病变的潜在药物可能是因为能抑制PKC活性和钙离子内流.     

检测Herceptin诱导乳腺癌细胞凋亡的多种显微技术比较

目的:比较多种显微技术在检测细胞凋亡中的应用.方法:以Herceptin诱导乳腺癌SKBR-3细胞凋亡,应用Gieamsa染色光镜,EB和Hoechst染色荧光显微镜,Annexin V/PI染色激光共聚焦显微镜以及扫描和透射电镜分别检测细胞凋亡的发生.结果:在Herceptin作用下,Hoechst染色荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描和透射电镜分别观察到乳腺癌SKBR-3细胞出现不同方面的明显凋亡特征.结论:不同显微技术各有优缺点,要客观地证实凋亡的发生,应联合运用多种检测方法.     

BMP-7/GFP融合基因在人肾小管上皮细胞的表达与定位

目的 构建骨成形蛋白-7(BMP-7)／绿色荧光蛋白(GFP)融合基因，观察其在人肾小管上皮细胞的表达与定位。方法 将小鼠BMP-7全长eDNA与GFP融合，连接进入真核细胞表达质粒pEGFP-C1中，以脂质体介导的方法将重组表达质粒pEGFP-C1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞。采用Western blot方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞的表达；激光共聚焦荧光显微镜观察BMP-7在人肾小管上皮细胞中的定位情况。结果 限制性酶切以及DNA测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7／GFP融合基因表达质粒。瞬时转染入肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达量较空载体转染组明显增加；GFP转染的细胞荧光均匀分布在整个细胞中，而pEGFP-C1-BMP-7转染的细胞荧光主要集中在细胞浆和细胞膜表面。结论 重组BMP-7／GFP融合蛋白具有GTP自发荧光的特性，且不影响BMP-7在细胞内的正确表达。     

实验性自身免疫性脑脊髓炎神经细胞内钙离子的变化及其意义

目的探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)发病初期及高峰期活体脑片内Ca2+荧光强度的变化,明确神经细胞内Ca2+的变化与病情演变的关系。方法采用激光共聚焦扫描显微镜(laserscanconfocalmicroscope,LSCM)对荧光探剂fluo3/AM负载的活体脑片进行观察,比较EAE发病初期组、高峰期组及正常对照组小鼠脑片的皮层、实质区域Ca2+的相对荧光强度。结果EAE发病初期组及空白对照组小鼠大脑皮层的Ca2+荧光强度均明显高于脑实质部位(P<0.05)、EAE高峰期组大脑皮层及脑内局灶区域的Ca2+相对荧光强度高于EAE初发病组(P<0.05)。结论EAE小鼠大脑皮层及脑内局灶区域均存在着神经细胞内的Ca2+内流,这种改变随着EAE病情的进展而增强。     

激光共聚焦镜下观察天花粉蛋白进入瘤细胞的动态过程

目的:观察FITC标记的天花粉蛋白(TCS)进入瘤细胞的过程。方法:通过低温离心、丙酮分级沉淀、等电点沉淀及透析技术由新鲜栝楼根原汁中提取TCS;用FITC标记TCS,在激光共聚焦显微镜下动态观察FITC-TCS进入瘤细胞的过程。结果:纯化的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为单一带,且与标准TCS泳率相同;终浓度50μg/ml FITC-TCS的孵育3h时已经进入黑色素瘤B-16细胞,6h时FITC-TCS进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,组间差异有统计学意义(P<0.01)。FITC-TCS组与对照组(FITC-BSA)荧光强度差异有统计学意义(P<0.01)。结论:采用FITC-TCS,可在激光共聚焦显微镜下观察到进入瘤细胞的动态过程。     

荧光原位杂交检测龈下菌斑中未获培养微生物

目的 在龈下菌斑中观察一种未获培养的牙周可疑致病微生物AU126.方法 针对AU126设计并评估特异性探针.使用激光共聚焦显微镜,通过与包含插入子克隆的原位杂交,定量分析荧光信号强度研判杂交严谨度.在严谨度分析获得的特定条件下,将慢性牙周炎患者的龈下菌斑标本与AU126探针进行杂交,运用共聚焦显微镜寻找AU126.结果 AU126探针理想杂交是在10%甲酰胺中进行.通过对细菌轮廓荧光强度均值的判断,证实龈下菌斑中存在ROX-126标记的阳性细菌.细胞呈杆状,长4.0～5.4 μm,宽0.64～0.84 μm.结论 在评估了AU126探针的特异性以及确定理想杂交严谨度的条件下,运用荧光原位杂交结合激光共聚焦显微镜技术,成功观察到人类龈下菌斑中的一种未获培养微生物AU126.     

荧光原位杂交检测龈下菌斑中未获培养微生物

目的在龈下菌斑中观察一种未获培养的牙周可疑致病微生物AU126。方法针对AU126设计并评估特异性探针。使用激光共聚焦显微镜,通过与包含插入子克隆的原位杂交,定量分析荧光信号强度研判杂交严谨度。在严谨度分析获得的特定条件下,将慢性牙周炎患者的龈下菌斑标本与AU126探针进行杂交,运用共聚焦显微镜寻找AU126。结果AU126探针理想杂交是在10%甲酰胺中进行。通过对细菌轮廓荧光强度均值的判断,证实龈下菌斑中存在ROX-126标记的阳性细菌。细胞呈杆状,长4.0~5.4μm,宽0.64~0.84μm。结论在评估了AU126探针的特异性以及确定理想杂交严谨度的条件下,运用荧光原位杂交结合激光共聚焦显微镜技术,成功观察到人类龈下菌斑中的一种未获培养微生物AU126。     

过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的腺病毒构建

目的设计特异性标记过氧化物酶体的绿色荧光蛋白,构建腺病毒载体,并感染培养的大鼠心肌细胞H9C2,检测该腺病毒载体的表达效率,通过共聚焦显微镜观察细胞过氧化物酶体的分布,同时给予细胞缺氧处理,对比细胞内过氧化物酶体的变化。方法（1）设计带有过氧化物酶体信号肽序列的绿色荧光蛋白序列。（2）PCR扩增该序列片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack中;pAdTrack经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组绿色荧光蛋白质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。（3）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒和不带有信号肽序列的Ad-GFP腺病毒感染培养的H9C2,24h后共聚焦显微镜下观察。（4）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染H9C2细胞后,分为正常培养和1%氧浓度培养两组,24h后观察。结果重组Ad-GFP-Peroxi腺病毒载体构建成功;与Ad-GFP腺病毒相比,Ad-GFP-Peroxi腺病毒能够特异性显示大鼠心肌细胞内过氧化物酶体的分布;且缺氧刺激后H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论利用同源重组的方法成功构建的过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的过表达腺病毒,对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率,共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况,且缺氧刺激导致过氧化物酶体分布聚集。     

伴放线放线杆菌侵入人颊黏膜上皮细胞的研究

[目的]探讨伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,A.a)与人口腔颊黏膜上皮细胞之间的关系,加深对A.a侵入颊黏膜上皮细胞能力的了解.[方法]运用荧光原位杂交技术和激光共聚焦扫描显微镜对12例侵袭性牙周炎患者(AgP)、30例慢性牙周炎患者(CP)和12例牙周健康者频黏膜上皮细胞中的细菌进行定位及半定量.[结果]受检者口腔颊黏膜细胞内均检测出细菌.分别有11名AgP患者、27名CP患者和1名牙周健康者上皮细胞内检测出A.a;颊黏膜上皮细胞内A.a占全细菌相对比例为60%～100%处比较时,AgP组与CP组之间的差异具有显著性意义(P＜0.01).[结论]A.a能够黏附和侵袭口腔颊黏膜上皮细胞.     

骨髓间充质干细胞肾动脉注射移植修复裸鼠急性肾小管坏死

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对裸鼠急性肾小管坏死(ATN)的修复作用,为MSCs移植治疗ATN提供实验依据。方法:5周龄裸鼠随机分为健康对照组、ATN模型组、MSCs移植治疗组。ATN模型采用50%甘油肌内注射诱导,MSCs移植采用经肾动脉注射途径向肾脏内移植增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的MSCs。实验期间观察饮食、活动等变化,检测血肌酐(Scr)水平,H-E染色观察肾组织病理学变化,荧光显微镜观察EGFP标记的阳性细胞在裸鼠肾脏的分布及数量。结果:ATN模型组裸鼠肾脏肾小管上皮细胞变性、局部坏死,病变于肾皮质或皮髓交界处明显,而肾小球未见明显异常。MSCs移植治疗组的肾小管上皮细胞无混浊肿胀和细胞核固缩溶解,间质无明显的充血和水肿。MSCs细胞移植后第14天的受体鼠肾小管中EGFP阳性细胞明显增多。结论:肾动脉注射途径移植的MSCs能定位于肾小管上皮,可促进ATN中损伤的肾小管上皮细胞的修复。     

BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究

目的 观测体外培养的兔骨髓间充质干细胞生物学特性,并转染重组腺病毒Ad5-EGFP-BMP7,观察BMP7与EGFP的表达情况.方法 通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、纯化间充质干细胞;流式细胞仪检测细胞周期和表面标记;体外诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定.转染后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测外源基因的表达.结果 原代及传代间充质干细胞为成纤维细胞样细胞;87%以上处于G0/G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶染色阳性,并有矿化结节形成;经成脂肪细胞诱导后,细胞内出现大量脂滴.转染Ad5-EGFP-BMP7后,荧光显微镜下可见EGFP表达阳性;免疫细胞化学染色显示细胞内BMF7表达阳性.结论 成功分离、纯化间充质干细胞,并鉴定其具有成体干细胞特性;重组腺病毒介导BMP7和EGFP体外成功转染间充质干细胞,并稳定表达BMP7、EGFP,为下一步实验奠定了基础.     

Effect of impaction on gene-modified cells seeded on granular bone allografts in vitro and in vivo

Background While attempting to restore bone stock, impaction bone grafting employed during revision joint surgery may result in slow and limited allograft incorporation into host bone. A new approach including gene-modified bone marrow stromal cells （BMSCs） in combination with impaction bone grafting may effectively restore bone stock and improve allograft incorporation. This study aimed to investigate the effect of impaction on gene-modified BMSCs seeded on granular bone allografts in vitro and in vivo.Methods Deep-frozen, granular, cancellous bone allografts from canines were prepared to serve as cell delivery scaffolds and were seeded with green fluorescent protein （GFP） genetically-modified BMSCs to construct cell-allograft composites. The composites were impacted in a simulative, in vitro impaction model and cultured for further analysis under standard conditions. Four Beagle dogs, treated with bilateral, uncemented proximal tibial joint hemiarthroplasty with a prosthesis, were implanted with autologous GFP gene-modified cell-allograft composites to repair the bone cavity around each prosthesis.Results A significant reduction in cell viability was observed after impaction by fluorescence microscopy in vitro.However, there remained a proportion of GFP-positive cells that were viable and functionally active, as evidenced by the secretion of GFP protein in vitro and in vivo.Conclusions Gene-modified BMSCs seeded on granular allografts were able to withstand the impaction forces and to maintain their normal functions in vitro and in vivo, in spite of a partial loss in cell viability.     

COA:Effect of impaction on gene modified cells seeded on granular bone allograft in vitro and in vivo

Background Impaction bone grafting during revision joint surgery to restore bone stock may result in slow and limited allograft incorporation into host bone. A new approach has been proposed by gene modified bone marrow stromal cells (BMSCs) in combination with impaction bone grafting may effectively restore bone stock and improve allograft incorporation. This study aims to investigate the effect of impaction on gene modified BMSCs seeded on granular bone allograft in vitro and in vivo. Methods Deep frozen granular cancellous bone allograft from canine was prepared to serve as cell delivery scaffold, which was seeded with green fluorescent protein (GFP) genetically modified BMSCs to construct cell allograft composites. The composites were impacted in a simulative impactor model and treated with successive incubation under the standard condition after impaction in vitro. Four Beagle dogs, treated with bilateral uncemented proximal tibial joint hemiarthroplasty with prosthesises, were implanted with autologous GFP gene modified cell allograft composites to repair the bone cavity around the prothesis to mimic impaction bone grafting in vivo. Results Significant reduction of viable cells was observed after impaction under fluorescence microscope in vitro, but a proportion of GFP positive cells remained alive and functionally active to secret GFP protein in vitro and in vivo. Conclusions Gene modified bone marrow MSCs seeded on granular allograft will withstand the forces of impaction and maintain their normal functions in vitro and in vivo in spite of partial loss.     

绿色荧光蛋白标记骨髓基质干细胞在恒河猴体内构建组织工程骨的示踪作用

目的 用绿色荧光蛋白(GFP)标记恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC),以示踪其在体内参与组织工程骨形成的情况.方法 用OBI-293A细胞对腺病毒Ad5.CMV-GFP进行扩增,用Ad5.CMV-GFP转染rBMSc,将转染成功的第三代BMSc在转染后48 h消化制成细胞悬液,接种至块状可吸收HA上,体外培养3 d后,将其植入恒河猴(同体移植)背阔肌的肌袋内,以未转染GFP的BMSC用同样的方法接种块状可吸收HA上,作为对照,术后6周取材,4%的中性多聚甲醛固定,塑料包埋,制作骨磨片PI染色在激光共聚焦显微镜下进行观测.结果 转染GFP后,rBMSc仍贴壁生长,呈梭形或多角形,仍分裂增殖,但增殖速度有所降低.48 h可见细胞发出强烈的荧光,呈全细胞分布,计数转染率达80%.在激光共聚焦显微镜下观察骨磨片,可见材料内有发出较强荧光的细胞结构,能同时被PI染液着色.结论 绿色荧光蛋白能有效示踪组织工程骨种子细胞,种人体内的BMSC是组织工程骨骨组织形成的主要细胞来源.     

绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养及其示踪的可行性

目的观察并比较两种小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及选取GFP-BMSCs作为移植实验示踪的种子细胞可行性。方法通过骨片培养法(A法)和全骨髓贴壁法(B法)培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞,并参照不同的培养方法优化其换液方式;观察两种培养方法原代及传代GFP小鼠骨髓MSCs形态变化;取第3代细胞进行生长曲线测定及多向分化功能检测;观察GFP小鼠骨髓MSC经多次传代及诱导分化后绿色荧光的稳定性。结果 1)A法原代培养可见贴壁细胞增殖形成大小不等的克隆集落,并向周围进一步扩展、融合,而B法在原代培养时由于混杂较多血液系统细胞,传代至3、4代即可获得较纯的BMSCs;2)观察其生长曲线,A法细胞扩增速度快,纯度高,B法细胞由于受杂细胞的影响,扩增难度大;3)BMSCs可被诱导成脂肪细胞,油红O染色可见红色脂肪颗粒;在成骨分化过程中可见骨结节结构形成;4)GFP-BMSCs传代后生物学特性稳定,传代至5代及诱导分化后其GFP表达仍为强阳性。结论与传统全骨髓贴壁法相比,骨片培养法可在原代或1代就获得高浓度的足量干细胞,GFP-BMSCs经多次传代后荧光不减退,可作为体内细胞示踪。     

甲状腺素在骨髓间充质干细胞成软骨诱导过程中的作用

目的探讨甲状腺素在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)软骨形成的作用。方法在两种条件培养基中培养和诱导猪BMSCs,对照组用成软骨培养基(含10-7 mol/L地塞米松和10 ng/mL TGFβ1),甲状腺素(T3)用成软骨培养基加100 nmol/L T3。MTT法检测BMSCs单层增殖情况。4周后取两组BMSCs Pellets,进行组织学染色和半定量基因表达分析。结果T3组BMSCs增殖明显高于对照组(P˂0.05)。T3组BMSCs Pellets形成典型软骨陷窝样结构,甲苯胺蓝染色阳性,并且优于对照组(P˂0.05)。与对照组相比,T3组第4周软骨生成标志基因Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)和性别决定基因9(SOX9)的表达显著升高(P˂0.05),肥大标志基因Ⅹ型胶原(Col-Ⅹ),基质金属蛋白酶13(MMP13)基因的表达显著升高(P˂0.05),成骨基因Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ),Runt相关转录因子2(RUNX2)表达在两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲状腺素可促进间充质干细胞的增殖和软骨形成,同时诱导间充质干细胞分化的软骨细胞肥大,这些结果为研究软骨组织工程的诱导方案提供了有益的线索。     

骨髓间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤后肾功能及氧化应激水平的改善作用

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）促肾缺血再灌注损伤修复的能力,为肾脏疾病治疗提供新的思路。 方法：健康3周龄C57BL/6J小鼠的骨髓细胞悬液进行BMSCs体外扩增培养。8周龄C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、平行对照组和细胞移植组,每组16只小鼠。建立肾缺血-再灌注损伤模型,将BMSCs通过尾静脉注射到细胞移植组小鼠中,平行对照组注射生理盐水。检测肾功能指标血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平变化、损伤肾组织自由基--羟自由基和超氧阴离子自由基变化和肾形态学变化。结果：①分离培养的BMSCs增殖旺盛,纯度较高,且均质性和稳定性好。②平行对照组小鼠整体状态差,肾功能指标、氧化应激指标明显升高,组织形态学出现肾小球崩解,肾小管结构消失,肾间质见大量炎性细胞浸润。而细胞移植组小鼠整体状态良好,肾功能指标和氧化应激指标得到明显改善（P<0.05）,组织形态学未出现明显病理性改变。结论：BMSCs在体外易分离培养,具有旺盛的增殖能力;移植BMSCs后,通过抑制氧自由基的生成来促进肾缺血-灌注损伤后小鼠的恢复。     

参麦对环孢霉素A急性肾毒性的影响

目的 观察参麦对环孢霉素A所致肾小管细胞毒性损伤的影响。方法利用体外培养的环孢霉素A中毒模型，测定细胞培养上清液LDH活性及参麦对环孢霉素A中毒后肾小管细胞增殖活性的影响。结果环孢霉素A中毒细胞胞浆内出现空泡变性，细胞增殖活性明显降低，上清液LDH活性明显升高。参麦可明显减轻环孢霉素抑制细胞增殖的作用，上清液中LDH活性明显降低。结论参麦可对抗环孢霉素A的肾毒性作用，促进损伤的肾小管上皮细胞增生。