白色念珠菌实时荧光定量聚合酶链反应检测体系的建立

目的建立白色念珠菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测体系,实现白色念珠菌的早期、快速检测,为临床医生对白色念珠菌感染的诊断提供指导。方法使用白色念珠菌及其他真菌标准株,利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 7.7设计引物探针。同时对镁离子(Mg2+)、三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、引物及探针浓度等参数进行优化,选出最佳反应体系,并验证反应体系的特异性、重复性,分析反应体系的最低检测限,对临床分离出的45例白色念珠菌进行检测。结果设计的引物探针仅能对白色念珠菌进行特异性扩增,反应体系不同底物浓度与Ct值之间成良好的线性关系,反应体系的最低检测限为5CFU/mL,且反应体系稳定性、重复性好,对临床分离菌株的检测阳性率为100%。结论成功设计了白色念珠菌特异性的引物探针,并建立了实时荧光定量PCR检测体系,能快速、准确地检出白色念珠菌。     

荧光定量聚合酶链反应检测肝病患者HBV DNA

目的　探讨荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)法的临床应用价值。方法　采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和FQ PCR法对 2 4 0例不同的肝病患者及 10 8例健康体检者进行乙型肝炎病毒标志物 (HBVM )以及HBVDNA定量检测。结果　不同临床类型 (急慢性乙肝患者、肝硬化和肝癌 )患者血清中HBVDNA的阳性检出率的差异具有显著性 (x2 =9.4 0 ,P <0 .0 5 ) ;不同人群血清中HBVDNA阳性检出率的差异亦具有显著性 (x2=12 5 .31,P <0 .0 0 1)。ELISA检测结果为“HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)”和“HBsAg(+)HBeAb(+)HB cAb(+)”的HBV感染者 ,体内HBVDNA含量显著高于HBVM阴性者 ;e抗原阳性和阴性者体内HBVDNA含量的差异亦具有显著性。HBV、HCV重叠感染者血清HBVDNA含量明显低于单纯HBV感染者 (P <0 .0 5 )。结论　FQ PCR法检测HBVDNA具有灵敏度高、特异性好、结果可靠的优点 ,可反映HBV真实感染和低复制状态 ,对于乙肝的临床诊断、治疗方案选择和预后判断具有重要的指导意义     

荧光定量聚合酶链反应检测唾液中幽门螺杆菌的研究

幽门螺杆菌 ( Hp)感染与胃炎、胃溃疡甚至胃肿瘤等的发病关系密切 ,国际癌研究协会已于 1 994年将 Hp感染列为人的 类致癌因子。检测 Hp感染发展迅速 ,然而其中大多属于有创性 ,荧光定量 -聚合酶链反应 ( FQ- PCR)法能从唾液中直接检测 Hp并具有无创、简便、可准确定量等优点。我们用 FQ- PCR法检测唾液中 Hp,对诊断儿童 Hp感染进行探讨。对象与方法一、研究对象　 1 999年 1 1月至 2 0 0 0年 8月我院门诊患儿 72 8例 ,男 40 5例 ,女 32 3例 ,年龄 3个月～ 1 4岁。其中 ,3个月～ 1岁 5例 ;1～ 3岁 2 8例 ;3～ 6岁 1 96例 ;6～ 1 0岁…     

实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在肺结核诊断中的应用价值。方法应用FQ-PCR对临床诊断肺结核及其他肺部疾病患者的临床标本进行结核分枝杆菌DNA定量检测,同时与涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法作比对。结果 189例临床诊断肺结核患者FQ-PCR检测123例阳性,提示敏感度为65.1%(123/189),而涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法分别为40.2%(76/189)、63.5%(120/189)。94例其他肺部疾病患者及20例健康对照者FQ-PCR检测均为阴性,特异度为100.0%。结论 FQ-PCR敏感度和特异度均高,检测过程简单、易标准化、全过程仅需4～5h,可用于结核病的快速诊断。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测食管癌患者血清miR-100表达的意义

目的检测食管癌患者与健康人血清中miR-100的表达量差异,并探讨其作为食管癌分子诊断指标的可能性。方法采用实时荧光定量PCR方法,检测40例食管癌患者(研究组)和50例体检健康者(对照组)血清中miR-100的表达量,并进行统计学分析。结果研究组及对照组血清中miR-100的表达量分别为6.399±3.541、2.625±1.515,研究组明显高于对照组,差异有统计学意义(t=9.07,P0.05)。用于食管癌患者诊断的miR-100的ROC曲线下面积为0.832(95%置信区间为0.731~0.934),当Cut off值为5.285时,miR-100诊断食管癌的灵敏度和特异度分别为65%和95%。结论食管癌患者血清中miR-100表达较健康人高,有望成为该疾病辅助诊断的新分子标志物。     

荧光定量聚合酶链反应检测唾液中幽门螺杆菌的研究

幽门螺杆菌(Hp)感染与胃炎、胃溃疡甚至胃肿瘤等的发病关系密切,国际癌研究协会已于1994年将Hp感染列为人的Ⅰ类致癌因子.检测Hp感染发展迅速,然而其中大多属于有创性,荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)法能从唾液中直接检测H p并具有无创、简便、可准确定量等优点.我们用FQ-PCR法检测唾液中Hp,对诊断儿童Hp感染进行探讨.     

实时荧光定量聚合酶链反应在HBV YMDD基因变异检测中的应用

目的以DNA测序法为标准,探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎(下称乙肝)病毒YMDD基因变异的敏感性和特异性。方法选取68例乙肝患者经拉米夫定治疗前及治疗9个月后其血清采用荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异,并随机选取10例(5例实时荧光定量PCR提示YMDD变异;5例提示未变异)慢性乙肝患者做DNA测序,分析二者的检测结果。结果拉米夫定治疗前HBVDNA的载量,两组相比差异无统计学意义(P>0.05),9个月后YMDD的变异率为14.7%(10/68);YMDD变异型组HBV DNA无l例阴转,YMDD野生型组HBV DNA阴转率为79.3%(46/58),差异有统计学意义(P<0.01);10例测序法所测结果与实时荧光定量PCR完全相符,总符合率为100.0%。结论实时荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异具有很好的临床应用前景。     

荧光定量聚合酶链反应检测肝病患者HBV DNA

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法的临床应用价值.方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和FQ-PCR法对240例不同的肝病患者及108例健康体检者进行乙型肝炎病毒标志物(HBVM)以及HBV DNA定量检测.结果不同临床类型(急慢性乙肝患者、肝硬化和肝癌)患者血清中HBV DNA的阳性检出率的差异具有显著性(x2=9.40,P<0.05);不同人群血清中HBV DNA阳性检出率的差异亦具有显著性(x2=125.31,P<0.001).ELISA检测结果为"HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)"和"HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)"的HBV感染者,体内HBV DNA含量显著高于HBVM阴性者;e抗原阳性和阴性者体内HBV DNA含量的差异亦具有显著性.HBV、HCV重叠感染者血清HBV DNA含量明显低于单纯HBV感染者(P<0.05).结论 FQ-PCR法检测HBV DNA具有灵敏度高、特异性好、结果可靠的优点,可反映HBV真实感染和低复制状态,对于乙肝的临床诊断、治疗方案选择和预后判断具有重要的指导意义.     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的 建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)快速检测方法,为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法 选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,建立并优化real-time PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果 本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0.2 cfu,比普通TaqMan real-time PCR检测限(3～5 cfu)提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值(Ct) 与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999)。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100%。结论 TaqMan-MGB探针real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体,有很好的应用前景与价值。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核杆菌DNA的临床应用

结核病是严重危机全球公共卫生的问题之一。结核病的病原学检测是发现传染源的主要手段,是确定结核病的依据,在结核病的预防和治疗工作中起着不可或缺的重要作用^[1]。近年来随着结核分子生物学诊断技术的快速发展,其快速、敏感、特异性高等的优点使其在临床逐渐得到应用。其中实时荧光定量聚合酶链反应（FQPCR）阳性结果可作为结核病诊断的重要临床依据。     

利用实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌

目的 建立针对粪便标本中伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中伤寒沙门菌的检出率。 方法 根据伤寒沙门菌特异基因STY1633设计特异性引物,优化反应条件,建立实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)反应体系。利用92株常见的非伤寒病原菌及44株伤寒沙门菌的染色体DNA评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者粪便标本及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。 结果 利用本方法检测的伤寒沙门菌纯菌及伤寒患者标本均扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检测中,qPCR法的最低检测限为500 fg/反应,相当于97个拷贝/反应。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前检测下限达104 cfu/g,增菌后可达50 cfu/g。 结论 基于STY1633基因的实时荧光定量PCR方法在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度,为伤寒沙门菌的快速诊断及某些不明原因发热及腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段,对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持。     

荧光定量聚合酶链反应技术检测儿童患者人巨细胞病毒结果分析

目的 了解本院儿童患者人巨细胞病毒(HCMV)感染现状.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术对243例住院疑似患儿进行HCMV-DNA定量检测.结果 HCMV总阳性率为16.05%;男性和女性阳性率分别为17.83%和12.79%;1个月至1岁年龄组(婴儿期)患者最高为17.41%.临床诊断主要以肝损害、腹泻和黄疸为主.结论 加强儿童患者HCMV的检测,有助于临床诊断与治疗方案的选择.     

实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒感染的临床意义

我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法对HBV感染760例血清中HBVDNA进行定量检测，并与常规PCR检测结果进行比较分析，取得了较好的效果，现总结如下。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测解脲脲原体生物群的研究

目的建立解脲脲原体生物群Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法根据解脲脲原体生物群MBA基因差异,分别设计并合成引物和探针。优化引物和探针浓度及试验条件,并进行试验的灵敏度、特异性和重复性评价。结果生物1群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5U Taq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.1pmol/L,TaqMan探针0.2pmol/L,模板DNA 2μL。生物2群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5UTaq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.2pmol/L,TaqMan探针0.3pmol/L,模板DNA2μL。PCR反应条件:95℃2min;95℃10s;55℃(检测荧光信号)20s,循环40次。该方法线性范围在1.0×102～8 copy/mL之间,检测限达到100～200copy/mL,特异性达到100%,CV值为2.5%。结论 本研究建立的TaqMan荧光PCR检测解脲脲原体生物群线性范围宽、灵敏度高、特异性及重复性好,能够快速进行解脲脲原体生物群检测。     

氨基糖苷类药物耐药基因armA实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立一种快速、准确检测细菌中arm A耐药基因的Taq Man实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。方法根据arm A基因设计特异的引物及探针,在多种常见致病菌中检测其特异性;使用阳性质粒标准品评价该方法的灵敏度;使用粪便模拟标本验证该方法的应用性。结果本方法特异性好,建立的arm A耐药基因real-time PCR方法标准曲线,确定其对质粒标准品的灵敏度为4.07×101拷贝/ml。应用该方法对粪便模拟标本进行检测,其检测下限为1.3×104cfu/ml。结论本研究建立了arm A耐药基因荧光定量PCR检测方法,有望在耐药基因监测中推广使用。     

竞争性聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA

定量检测ＨＢＶ－ＤＮＡ的现有方法主要是分子杂交法，敏感性为０．１～１ｐｇ，不能达到病毒最低感染水平。聚合酶链反应技术有极高的特异性，灵敏度可达１ｆｇ，相当于３×１０２个病毒颗粒。定量ＰＣＲ技术为研究病毒与疾病关系提供了强有力的手段。本文应用竞争性ＰＣ...     

实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌（A～F群）方法的建立和应用

目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性.方法 根据沙门菌保守的HilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR.结果 所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符.结论 建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测.     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒

目的 用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱ－ＰＣＲ）方法准确地定量检测血清中乙型肝炎疾病（ＨＢＶ）的数量和免疫指标以指导临床,方法 设计合成了ＨＢＶＦＱ－ＰＣＲ诊断试剂盒,以一种完全闭管式的ＰＣＲ和荧光探针杂交技术相结合产生的实时检测定量ＰＣＲ方法,检测了５３２份临床血清标本,结果 经ＦＱ－ＰＣＲ检测,１５８份ＨＢＶ的ｓ抗原,ｅ抗原,ｃ抗体（ＨＢｓＡｇ,ＨＢｅＡｇ,ＨＢｃＡｂ）都阳性的标本,其血清标本ＨＢ     

实时荧光定量聚合酶链反应技术对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)对结核性脑膜炎的诊断价值。方法分别采用涂片法、RT-PCR法对结核性脑膜炎、疑似结核性脑膜炎以及非结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测,并对检测结果进行比较分析。结果涂片法共检出10例阳性,其中结核性脑膜炎7例(70.00%),疑似结核性脑膜炎3例(30.00%);RT-PCR法共检出46例阳性,其中结核性脑膜炎31例(67.39%),疑似结核性脑膜炎15例(32.61%)。对结核性脑膜炎患者检测,涂片法阳性率(12.28%)低于RT-PCR法阳性率(54.39%),差异有统计学意义(P0.05);对疑似结核性脑膜炎患者检测,涂片法阳性率(2.91%)低于RT-PCR法阳性率(14.56%),差异有统计学意义(P0.05);脑脊液涂片法检测结核性脑膜炎的灵敏度为12.28%,漏诊率为87.72%,RT-PCR法检测的灵敏度为54.39%,漏诊率为45.61%,差异有统计学意义(P0.05)。结论 RT-PCR法诊断结核性脑膜炎具有灵敏度好,准确度高等特点,临床有重要的指导意义。