成年斑马鱼脊髓损伤修复中BDNF/TrkB的表达研究

目的 斑马鱼具有很强的脊髓损伤后的修复能力,如在脊髓完全横断的4～6周内即可恢复自由游泳能力,但是目前修复机制不明。本文旨在研究斑马鱼脊髓损伤修复过程中,脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和其受体酪氨酸激酶受体B(Tropomyosin-related kinase receptor subtypeB,TrkB)的作用。方法 本文通过建立成年斑马鱼脊髓损伤模型,采用实时定量PCR方法,检测了脊髓损伤不同时间点斑马鱼脊髓中BDNF和TrkB基因的表达情况;进而用蛋白质电泳方法检测了脊髓损伤急性期和慢性恢复期斑马鱼脊髓中BDNF蛋白质的表达情况。结果 同假手术组相比,脊髓损伤组斑马鱼脊髓组织BDNF和TrkB基因在损伤急性期(4 h)和修复早期(6d)呈现显著性升高(P＜0.05),同时,脊髓BDNF蛋白的表达在损伤急性期(24 h)显著性降低(P＜0.05),在神经修复期(15d)显著性升高(P＜0.05)。结论 斑马鱼脊髓损伤后修复期局部存在着良好的神经再生微环境,从而可能促进轴突的再生长及运动能力的恢复。     

VEGF在损伤鼠脑组织中的表达及对脑含水量的影响

目的探讨损伤脑组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达对脑组织含水量的影响。方法Wister大鼠60只,随机分为对照组和脑损伤组,后者按损伤后不同观察时间点再分为3h、72h、7d组,每组各15只。采用Marmarou自由落体撞击法建立局灶性脑挫裂伤模型,脑损伤组大鼠致伤后按预定时间点断头处死,对照组开颅同损伤组,但不致伤,观察项目同损伤组。采用免疫组化法检测伤后不同时间点伤灶脑组织中VEGF表达情况,采用干湿重法测定伤侧脑组织含水量。结果正常鼠脑组织未检测到VEGF的表达;脑损伤后3h脑组织中VEGF表达明显增加,72h达到高峰,7d后表达减少,与相同时间点对应组脑组织含水量呈正相关。结论VEGF可导致损伤脑组织含水量增加,在脑损伤后继发脑水肿发生、发展中起重要作用。     

人参皂苷Rg1对脑挫伤后大鼠脑内胰岛素样生长因子1表达的影响

目的：探讨人参皂苷Rg1对脑组织挫伤后大鼠脑中胰岛素样生长因子1（insulin—like growth factor-1，IGF-1）表达的影响。方法：Wistar大鼠26只，分为正常对照组（2只），脑挫伤模型组（8只）及人参皂苷Rg1治疗组（16只），在损伤后不同时间点（损伤后6h、12h、2d及6d）分别处死大鼠，使用免疫组化方法观察并检测脑中IGF-1的表达。结果：与对照组相比，脑挫伤模型组损伤后各时间点脑组织中IGF-1的表达有所升高（P〈0．05）；与模型组比较，人参皂苷Rg1治疗组IGF-1的表达明显升高（P％0．05）。结论：人参皂苷Rg1可能通过促进脑挫伤后脑组织IGF-1的表达，促进脑组织的功能恢复。     

人参皂苷Rg1对脑挫伤后大鼠脑内胰岛素样生长因子1表达的影响

目的：探讨人参皂苷Rg1对脑组织挫伤后大鼠脑中胰岛素样生长因子1（insulin—like growth factor-1，IGF-1）表达的影响。方法：Wistar大鼠26只，分为正常对照组（2只），脑挫伤模型组（8只）及人参皂苷Rg1治疗组（16只），在损伤后不同时间点（损伤后6h、12h、2d及6d）分别处死大鼠，使用免疫组化方法观察并检测脑中IGF-1的表达。结果：与对照组相比，脑挫伤模型组损伤后各时间点脑组织中IGF-1的表达有所升高（P〈0．05）；与模型组比较，人参皂苷Rg1治疗组IGF-1的表达明显升高（P％0．05）。结论：人参皂苷Rg1可能通过促进脑挫伤后脑组织IGF-1的表达，促进脑组织的功能恢复。     

急性损伤对大鼠脊髓血管内皮生长因子表达的影响

目的了解血管内皮生长因子(VEGF)在急性损伤后的大鼠脊髓中表达的动态变化。方法采用改良Allen重量打击法大鼠急性脊髓损伤模型，用免疫组织化学方法观察了急性损伤后大鼠脊髓VEGF表达的动态变化。结果急性损伤12hVEGF即可在大鼠脊髓软脊膜、脊髓内的血管内皮细胞、胶质细胞和巨噬细胞内表达，1d达高峰，并持续到3d，7d时开始下降。结论急性损伤可上调VEGF在脊髓血管内皮细胞、胶质细胞和巨噬细胞内的表达，VEGF可能通过促进血管内皮细胞生长对损伤神经元起一定的保护作用。     

血栓心脉宁对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子表达的影响

目的：观察血栓心脉宁对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 SD大鼠随机分为假手术组、模型组和实验组。线栓法制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型,实验组于造模前每日灌胃给药1次（800 mg/kg ）,连续6 d。于缺血1 h再灌注24 h后断头取脑,免疫组织化学法和半定量PCR法检测缺血区脑组织中VEGF的表达。结果与模型组比较,实验组大鼠脑组织中VEGF的表达水平明显增高,差别有统计学意义（P＜0．05）。结论血栓心脉宁的脑保护作用机制可能与促进VEGF的表达有关。     

臂丛神经根损伤后aFGF基因在脊髓运动神经元的表达

目的：研究大鼠臂丛神经根损伤后酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)在脊髓前角运动神经元的表达及表达的保护作用。方法：选用120只健康成年SD系大鼠，随机分为脊髓神经根损伤组、假手术组和正常对照组，每组再设1h组、6h组、24h组、48h组，实验组造成臂丛神经损伤，取大鼠脊髓标本，然后应用免疫组化技术（LSAB）染色，观察aFGF基因在脊髓前角运动神经元的表达。结果：在脊髓神经根损伤后的手术后不同时间组中，损伤脊髓神经元表达不同。在损伤1h表达高峰，持续至伤后6h，在脊髓神经损伤24h后恢复正常。在假手术组和正常对照组的手术后不同时间组中，表达结果无差异。结论：神经元损伤后，脊髓运动神经元aFGF基因表达增加，提示这与脊髓运动神经元修复机制有关，尤其是早期修复过程中aFGF基因表达增加具有很重要的抗损伤保护作用。     

血管内皮生长因子防止脊髓运动神经元凋亡的研究

目的研究成年大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子对运动神经元的神经保护作用以及Caspase-3 mRNA表达与运动神经元凋亡的关系。方法用72只SD大鼠制作成脊髓损伤模型,随机分为对照组、应用VEGF组和VEGF拮抗组。伤后6、12、24h和3、7、14d取材。应用原位杂交、TUNEL技术研究运动神经元的凋亡。结果Caspase-3 mRNA在VEGF组脊髓组织中的表达下调,在VEGF拮抗组中表达增高。TUNEL阳性细胞计数显示脊髓损伤后VEGF拮抗组有多量神经元丢失,而VEGF组神经元丢失数量明显减少。结论VEGF可以防止成年大鼠脊髓损伤后运动神经元的凋亡,其作用可能是由Caspase-3介导的。     

大鼠脊髓损伤后HIF-1α和VEGF表达的上调及其在血管新生中的意义

目的:探讨脊髓损伤后神经细胞内缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化在血管新生中的意义.方法:应用改良Allen重击法损伤大鼠T12脊髓,按伤后存活时间再分为脊髓损伤1 d,3 d,7 d,14 d和30 d组.各组动物的脊髓切片经免疫荧光染色后,用荧光显微镜观察HIF-1α,VEGF的表达和分布,对Laminin免疫反应阳性的血管基膜进行图像分析,比较上述各组的血管密度.结果:HIF-1α和VEGF共定位于脊髓前角运动神经元,脊髓损伤局部的免疫荧光强度高于正常脊髓内的荧光强度,在脊髓损伤后第3天,其荧光强度达到高峰.脊髓损伤后Laminin阳性血管主要分布于损伤坏死组织周围并逐渐向坏死组织内生长,血管密度经历由低到高的过程.结论:脊髓损伤后损伤部位残存神经元可能通过表达高HIF-1α诱导VEGF表达增加,后者通过旁分泌模式作用于周围血管内皮细胞以促进内皮细胞增殖和血管再生.     

脊髓损伤后毛细血管新生与血管内皮生长因子mRNA的表达

目的探讨脊髓损伤后毛细血管新生与血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达。方法采用改良Allen＇s重量打击法大鼠急性脊髓损伤模型,用马松三色染色法观察脊髓损伤后毛细血管的新生情况,原位杂交法观察急性损伤后大鼠脊髓VEGF mRNA表达的动态变化。结果脊髓损伤后引起脊髓组织中血管密度和血管分布改变,脊髓急性损伤后损伤局部出现短暂的血管新生过程。同时,原位杂交结果显示VEGFmRNA的表达上调,表达时间与血管变化的时间重叠。除了时间上的相互关联外,脊髓损伤后毛细血管新生与VEGF mRNA的表达在空间分布上是一致的。结论脊髓急性损伤可上调VEGFmRNA在脊髓血管内皮细胞、胶质细胞和巨噬细胞内的表达,有短暂的血管新生过程,损伤组织中VEGFmRNA的表达与其毛细血管新生的调节密切相关。     

斑马鱼脊髓损伤后细胞因子和再生相关分子的表达分析

目的 探讨成年斑马鱼脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后不同时间点细胞因子和再生相关分子的表达水平变化。 方法 56条斑马鱼随机分为脊髓损伤组（spinal cord injury group, SCI组,n=28）和假手术组（sham-operated group, Sham组, n=28）,分别在SCI后的12 h、3 d、11 d和25 d进行组织取材（每个时间点n=7）,脊髓组织的取材以损伤位点为中心,分为脊髓上段、中段（包含SCI位点）和下段,每段各2 mm。采用RT-qPCR法检测斑马鱼脊髓组织中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和白介素-10（interleukin-10, IL-10）和再生相关分子（thymosin β4, TBETA4和annexin A2a, ANXA2A）的mRNA表达水平。 结果 相比于Sham组,损伤位点所在的脊髓中段在SCI后3 d,细胞因子TNF-α和IL-10表达水平显著降低,分别降低了93.5%和90%,再生相关分子TBETA4和ANXA2A的表达水平显著升高,分别升高了2.39倍和1.87倍;而在SCI后12 h和11 d/25 d,以上分子在脊髓中段的表达均无显著差异。提示SCI后3 d可能是损伤局部微环境改变的活跃期,因此,进一步检测和比较SCI后3 d的脊髓各段各基因的表达情况。相比于Sham组,细胞因子TNF-α和IL-10的表达水平仅在中段降低,上段及下段无显著差异;再生相关分子TBETA4的表达水平在上段升高了1.90倍,在下段升高了3.69倍;ANXA2A的表达水平在上段升高了3.45倍,在下段升高了2.63倍。 结论 斑马鱼SCI后3 d是损伤位点处细胞因子和再生相关分子发生显著变化的时间节点,在该时间点,细胞因子（TNF-α、IL-10）表达下调,其信号局限于损伤位点处,再生相关分子（ANXA2A、TBETA4）在脊髓的上段、中段和下段有不同程度的表达上调。     

褪黑素对大鼠脊髓损伤后iNOS表达的影响

目的：探讨褪黑素对大鼠脊髓损伤后诱生型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法：采用改良Allen’S撞击法制备脊髓损伤模型;成年SD大鼠110只随机分为假损伤组、损伤组和药物治疗组3组,其中损伤组和药物治疗组各50只,分5个时间点（8小时、24小时、72小时、7天、14天）处死;假损伤组10只,于手术后14天处死,采用HE染色和免疫组化检测脊髓损伤后脊髓组织中iNOS蛋白的表达。结果：与损伤组比较,药物治疗组大鼠损伤后脊髓组织iNOS表达明显降低,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：褪黑素可通过抑制iNOS蛋白表达对大鼠脊髓损伤起保护作用。     

糖尿病大鼠脊髓损伤后血小板衍化生长因子的表达研究

目的观察糖尿病大鼠脊髓机械性损伤后损伤处脊髓血小板衍化生长因-7-（PDGF）在星型胶质细胞中的表达量,以探讨脊髓损伤过程中PDGF的作用。方法将36只大鼠随机分为假手术对照组、脊髓损伤组和糖尿病脊髓损伤组并制作相关模型,观察脊髓损伤24h和7d后大鼠运动功能的改变、损伤脊髓的病理变化及PDGF在星型胶质细胞中的表达情况。采用UTHSCSA Image Tools 3．0图像分析处理系统进行分析,统计各张切片单位面积（mm^2）内PDGF阳性细胞的数量和光密度：BIO-RAD软件Quantityone测定并用相对灰度值表示PDGF蛋白的表达量：然后对所得数据进行分析。结果脊髓损伤24h后,两组大鼠均出现严重运动功能障碍,BBB功能评分分别为（0.7±0．4）、（0．7±0.5）分：损伤7d后,脊髓损伤组大鼠恢复为（6．7±1.2）分,而糖尿病脊髓损伤组仅恢复为（3．9±0.7）分,两组差异有统计学意义（P〈0．01）：而假手术对照组大鼠运动自如,术后24h和7d评分均为（21．0±0．0）分,与另两组比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）。术后24h脊髓损伤组和糖尿病脊髓损伤组脊髓损伤部位白质中可见肿胀的轴突和大量空泡。灰质中存在极少量的神经元和胶质细胞;7d后损伤范围确定,损伤段变细,脊髓内有空洞形成,其中糖尿病脊髓损伤组的空洞大于脊髓损伤组,并且周围有炎性细胞浸润。PDGF阳性表达部位为星形胶质细胞,术后24h、7d假手术对照组PDGF表达少,没有太大的变化：24h后脊髓损伤组和糖尿病脊髓损伤组损伤部位的PDGF表达增多,且脊髓损伤组明显多于糖尿病脊髓损伤组（P〈0．01）：7d后脊髓损伤组PDGF持续高表达,仍明显多于糖尿病脊髓损伤组（P〈0．01）。在Western blot检测中,假手术对照组在两个时段均仅有少量PDGF蛋白表达,24h后脊髓损伤组PDGF表达明显多于糖尿病脊髓损伤组（P〈0．01）,损伤7d后脊髓损伤组PDGF持续高表达,仍明显高于糖尿病脊髓损伤组（P〈0．01）。结论糖尿病脊髓损伤大鼠脊髓损伤后BBB评分明显低于脊髓损伤组大鼠,PDGF表达量亦明显减少,可能与高血糖状态加重脊髓的损伤以及抑制其损伤后恢复有关。     

Wnt4、Wnt7a在不同程度脊髓损伤小鼠中的差异表达

【目的】观察非经典Wnt信号通路相关基因、平面细胞极性（PCP）相关基因在不同程度脊髓损伤（SCI）后的表达变化。【方法】采用LISA脊髓撞击器构建小鼠脊髓损伤模型,实验分为SCI0.65组（损伤深度为0.65mm）、SCI0.45组（损伤深度为0.45mm）和Sham组（假手术）;通过BMS评分和CatWalk9.0步态分析系统测试小鼠术后运动功能;应用VonFrey纤毛和冷热板检测小鼠术后神经病理性疼痛;利用Real-time PCR法检测小鼠脊髓损伤节段和腰4腰5（L4-5）节段非经典Wnt信号通路相关基因和PCP相关基因的表达变化。【结果】①在损伤后第7、10、25、42天,SCI0.65组BMS评分明显低于SCI0.45组（P<0.05）;CatWalk9.0步态分析结果表明SCI后损伤组小鼠四肢协调率低于Sham组（P<0.01）。②脊髓损伤后第28天损伤组小鼠均出现机械性痛觉超敏并且持续至42d,且损伤程度越重,机械性痛阈值越低（P<0.001）;脊髓损伤后小鼠冷热痛异常,但是与损伤程度无关。③脊髓损伤造模后42d,SCI0.45组和Sham组小鼠脊髓组织中Wnt4与Wnt7a表达无显著变化,SCI0.65组Wnt4表达上调、Wnt7a表达下调（P<0.05）。【结论】①小鼠SCI后产生神经病理性疼痛。不同程度的脊髓损伤对机械痛表现出不同的敏感性。②Wnt4和Wnt7a的表达变化提示它们可能在脊髓损伤后运动神经回路的可塑性中起重要作用。     

大鼠不同程度脊髓损伤后再生基因蛋白-2的表达变化

目的比较大鼠不同程度脊髓损伤（SCI）后再生基因蛋白（Reg）-2的表达差异。方法30只SPF级Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、轻伤组（致伤能量25g·cm）、中度损伤组（50g·cm）和重伤组（75g·cm）。各损伤组大鼠采用自制打击装置建立SCI动物模型,并于伤后1、3、5和7d采用联合行为评分（CBS）检查大鼠神经功能恢复情况。伤后7d处死动物,取损伤节段脊髓组织,采用RT．PCR和免疫组织化学SABC法检测Reg-2mRNA和Reg-2的表达。结果各损伤组大鼠CBS较正常组显著升高（P〈0．05）,并随损伤时间的延长而逐渐降低,各损伤组组内比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）;Reg-2mRNA表达链和Reg-2阳性细胞数在各损伤组均显著高于正常组（P〈0．05）,并且随损伤程度的加重而升高,各损伤组之间比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）。轻伤组Reg-2阳性细胞以神经元为主,而在重伤组以神经胶质细胞为主。结论SCI后Reg-2表达丌始升高．其表扶水平具有一定的损伤程度依籁忡。     

干细胞移植联合电针治疗对脊髓损伤修复的影响

目的研究人脐血干细胞移植联合电针刺激治疗脊髓损伤过程中对于类胰岛素样生长因子-1（IGF-1）表达的影响。方法将SD大鼠利用随机数字表法随机分成3组,所有大鼠均为脊髓横断损伤。脊髓损伤（SCI）组,干细胞移植（UCBSC）组,干细胞移植＋电针刺激（UCBSC＋EA）组,每组均为12只。UCBSC、UCBSC＋EA组在损伤处注射脐血干细胞,SCI组以等量PBS缓冲液代替,UCBSC＋EA组每天固定时间取损伤处上、下部位的＂大椎＂＂命门＂进行电针刺激。各组均在损伤后的7天、14天和28天于损伤处取材,观察神经元细胞的形态、数量及IGF-1表达。结果常规HE组织学检查发现横断处灰质内神经元细胞变性、减少,并伴星形胶质细胞增生,细胞体肥大。免疫组化显示,损伤后IGF-1表达均上调,UCBSC、UCBSC＋EA两组表达进一步上调,IGF-1的表达在前14天显著上调,14天后表达放缓。Western Blot结果显示,与单纯的人脐带血移植（UCBSC）相比较,UCBSC＋EA更能促进IGF-1的表达,且有统计学意义（P〈0.05）。RT-PCR电泳结果显示UCBSC＋EA组,IGF-1mRNA的表达明显高于其他两组,有显著性差异（P〈0.05）。结论 UCBSC＋EA在大鼠脊髓损伤处可更有效分泌神经营养因子IGF-1,弥补脊髓损伤后维持神经元细胞生存所匮乏的营养因子,促进神经元细胞存活。     

MCI-186对脊髓损伤大鼠炎症因子释放及神经营养因子表达的影响

目的：研究MCI-186对脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠炎症因子的释放及神经营养因子表达的影响。方法：建立大鼠脊髓半切SCI模型,随机分成两组,分别予MCI-186或磷酸盐缓冲液（PBS）治疗,在术后1、3、7 d和14 d动态测定受损伤脊髓组织丙二醛（MDA）超氧化物歧化酶（SOD）的含量以及脑原性神经生长因子（BDNF）mRNA的表达,ELISA法测定血清及受损伤脊髓局部组织白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）;神经营养因子-3（NT-3）、BDNF蛋白表达。并同时与假手术组对比。结果：与模型组比较,MCI-186能显著降低SCI大鼠血清炎性因子IL-6、IL-8的浓度,促进脊髓组织NT-3、BDNF表达。结论：MCI-186可抑制炎症因子释放,增加内源性神经营养因子表达。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2和血管内皮生长因子表达的影响

目的：观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达的影响。方法大鼠随机分为3组：A为假手术组,B为细胞培养基（DMEM）对照组,C为BMSCs移植组。B组和C组大鼠进行脊髓压迫损伤模型制作。脊髓损伤后, B组和C组大鼠分别给予DMEM培养液或BMSCs脊髓损伤周围区注射。术后应用Western Blot方法检测COX-2、VEGF蛋白在损伤脊髓组织中的表达变化。结果 COX-2、VEGF蛋白在A组大鼠未损伤脊髓组织中均低水平表达。B组与A组相比,脊髓损伤后COX-2蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）,VEGF蛋白表达水平则短暂显著增加（P＜0.05）。C组与B组相比, COX-2和VEGF蛋白表达水平均显著增加。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2、VEGF蛋白的表达。     

夹脊电针干预脊髓损伤大鼠再髓鞘化的研究

[目的]观察夹脊电针干预脊髓损伤大鼠髓鞘再生和运动功能恢复作用.[方法]108只SD（Sprague Dawley）肇性大鼠随机分为假手术组、模型组、夹脊电针治疗组（EA组）,每组再分为术后1天、7天、14天三个时间点组（n=12）.假手术组只切除椎板,其余两组建立脊髓损伤模型后模型组不予治疗,EA组取损伤周围夹脊穴进行电针治疗（疏密波,2/100HZ,1mA）,每次20min,每天一次.各组大鼠于各时间点进行BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）运动功能评分,应用LFB（Luxol Fast Blue）法进-行髓鞘染色,western blot方法检测髓磷脂碱性蛋白（Myelin Basic Protein,MBP）的表达.[结果]术后1天EA组与模型组BBB评分无明显差异（P=-0.724）,7天和14天时EA组大鼠BBB评分逐渐增高,与模型组比具有显著性差异（P＜0.01）;LFB髓鞘染色发现脊髓损伤后白质区域有较大面积的染色变浅,间隙变稀疏、排列不均匀,且有大量空泡存在,术后1天模型组大鼠髓鞘平均积分光密度值（Integrated Optical Density,IOD）较假手术组明显降低（P＜0.01）,EA组较模型组无明显差异（P=0.945）;7天和14天EA组髓鞘含量显著增多,与模型组比较具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）;术后EA组MBP蛋白相对表达逐渐增多,在各时间点较模型组均具有显著性差异（P＜0.01）.[结论]夹脊电针可能通过增加MBP的表达,有效促进脊髓损伤后的轴变再髓鞘化,从而进一步促进大鼠神经功能的恢复.