运用PCR-RFLP技术研究耐喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA基因的突变

目的 研究临床分离的耐喹诺酮类铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa.PA)gyrA基因突变情况.方法 以铜绿假单胞菌gyrA基因序列为靶序列,用PCR-RFLP、DNA测序等方法,对铜绿假单胞菌gyrA基因突变进行研究.结果 在57株耐喹诺酮类铜绿假单胞菌中,有35株(61.4%)菌gyrA基因的83位出现突变,其突变方式为Thr83(ACC)→Ile(ATC),其余22株(38.6%)耐喹诺酮类铜绿假单胞菌未发现基因位点突变.33株喹诺酮类敏感临床分离铜绿假单胞菌菌株未发现上述突变.gyrA基因的PCR扩增产物Sac Ⅱ酶切片段与它们测序结果一致.结论 gyrA基因83位氨基酸密码子突变(Thr-83→Ile)是临床分离铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的主要机制之一.     

我国铜绿假单胞菌耐氨基糖苷类基因分布的文献研究

目的了解我国铜绿假单胞菌的氨基糖苷类耐药基因分布状况。方法计算机检索CBM、CNKI、VIP和WanFang Data数据库,收集报道我国铜绿假单胞菌耐氨基糖苷类基因的研究,检索时限均从建库至2012年12月。由2位评价员按照纳入与排除标准筛选文献、提取资料后,采用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果共纳入10个省市1 144株耐氨基糖苷类铜绿假单胞菌。氨基糖苷类修饰酶基因aac(3’)-Ⅰ、aac(3’)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅱ、ant(2’’)-Ⅰ、ant(3’’)-Ⅰ和aph(3’)-Ⅵ在淮河以北地区的检出率分别为13.3%、40.1%、21.6%、40.3%、38.1%、23.7%和2.9%,而淮河以南地区的检出率分别为3.2%、20.2%、15.9%、37.6%、28.3%、28.5%和9.1%。16S rRNA甲基化酶基因rmtA、rmtB和armA检出率分别为20.4%、19.4%和0.7%,而其余16S rRNA甲基化酶基因均未检出。结论氨基糖苷类修饰酶是我国铜绿假单胞菌耐氨基糖苷类药物的主要机制,而16S rRNA甲基化酶是其次要机制。     

铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药机制的研究

目的研究30株铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法用PCR及测序法研究拓扑异构酶Ⅱ和Ⅳ的gyrA、gyrB、parC和parE基因;同时用琼脂稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星的MIC和加入羰基氢氯苯腙(CCCP)后的MIC,以确定存在外排机制。结果菌株中23株(76.7%)有gyrA突变,主要为Thr-83→Ile,第87位突变3株;10株(33.3%)parC基因突变,其中5株为Ser-87→Leu,3株第91位突变;gyrB和parE突变较少见。CCCP能显著降低环丙沙星和左氧氟沙星的MIC。结论铜绿假单胞菌的耐药性日趋严重,两类拓扑异构酶基因突变和外排泵机制是铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的主要机制。     

铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究进展

铜绿假单胞菌是一种致病性很强的条件致病菌，对大部分抗生素具有天然的、或者获得的多重耐药性，增加临床治疗的难度，甚至导致治疗失败。目前对铜绿假单胞菌的耐药机制的研究取得了较大的进展，尤其对氟喹诺酮类药物的耐药机制的探索成为目前研究的热点之一，本文综合近年来文献对铜绿假单胞菌耐氟喹诺酮类药物机制的研究进展进行综述。     

铜绿假单胞菌耐药性及氟喹诺酮类耐药相关基因的研究

目的 了解医院临床分离的铜绿假单胞菌耐药情况及氟喹诺酮类相关耐药基因存在状况.方法 用BD Phoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药物敏感试验,用聚合酶链反应（PCR）检测parC、gyrA两种氟喹诺酮类耐药相关基因.结果 70株铜绿假单胞菌呈现多重耐药,对环丙沙星、左旋氧氟沙星的耐药率分别为51.4%、50.0%,其余11种的耐药率在10.0%～100.0%.在70株铜绿假单胞菌中,39（55.7%）株分离菌检出parC基因,18（25.7%）株分离菌检出gyrA基因.结论 临床分离的铜绿假单胞菌多重耐药严重,携带parC和gyrA基因是本组试验菌株对氟喹诺酮类抗生素耐药的重要机制.     

耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌的质粒基因研究

目的研究耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌(PA)的质粒基因,并分析其耐药机制。方法临床分离的耐喹诺酮类药物的PA 100株,采用PCR法检测质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr,并对阳性结果进行测序分析。结果 100株PA中检测出含有qnrA基因的菌株34株(34%);qnrB基因79株(79%);qnrD基因14株(14%);qnrS基因8株(8%);aac(6′)-Ib-cr基因55株(55%);未检测出qnrC和qepA基因的菌株。结论质粒携带的qnrA、qnrB/aac(6′)-Ib-cr耐药基因是PA耐喹诺酮类药物的主要机制。     

宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性研究

目的 检测宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况,探讨染色体介导DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变或(和)质粒介导qnrA基因存在与宋内志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性.方法 用K-B纸片扩散法对58株宋内志贺菌进行耐药性检测;PCR法检测宋内志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因,并根据药敏结果 挑选5株菌扩增片段进行DNA测序;PCR法扩增qnrA基因片段.分析宋内志贺菌gyrA、parC基因突变或(和)qnrA基因存在与喹诺酮类药物耐药性的关系.结果 宋内志贺菌对萘啶酸的耐药率高达94.8%.58株宋内志贺菌中,8株检出qnrA基因,5株测序gyrA、parC基因的菌株中,4株萘啶酸耐药菌株均在gyrA 83位发生有义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),但未发生parC基因突变,gyrA基因突变菌株对萘啶酸全耐药.qnrA基因阳性菌株对5种喹诺酮类药物抑菌圈中位数比较都缩小;对NAL、氧氟沙星的耐药率高于qnrA基因阴性菌株(P<0.05),差异有统计学意义.结论 gyrA Ser83分→Leu突变是导致宋内志贺菌临床分离株对喹诺酮类药物耐药的关键突变,宋内志贺菌若携带质粒介导qnrA基因则会导致对喹诺酮类药物的敏感性下降,若两者同存也可引起喹诺酮类药物耐药增强,除萘啶酸耐药外对其他喹诺酮类药物也可呈中介.     

基层医院与三级医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药表型及耐药机制研究

目的分析北京地区基层医院与三级医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药表型及其耐药机制,为临床的合理用药提供依据。方法采用K-B法检测两所医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药表型,应用PCR方法对耐亚胺培南铜绿假单胞菌相关基因(金属酶基因IMP、VIM;主动外排系统基因OprM、mexA、mexB;外膜蛋白Opr D2基因)进行检测。结果两所医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦敏感性均排在前三位;检出基因IMP(11.4%、5.0%)、OprM(90.9%、97.5%)、mexA(100.0%、100.0%)、mexB(100.0%、100.0%)和OprD2(52.3%、60.0%),VIM基因均未检出。结论外排泵系统和外膜蛋白OprD2基因缺失是两个医院介导铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制,具有流行病学意义。     

铜绿假单胞菌对耐喹诺酮药物质粒基因的研究

目的：探讨铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药质粒与周围共生菌耐药质粒染色体相互转移的关系。方法收集深圳市第七人民医院2011年1月～2013年12月481份各种样品培养出的铜绿假单胞菌31例,药敏实验结果对喹诺酮耐药的15例为研究对象,运用质粒转化、提取实验证实其耐药质粒的存在,PCR扩增、基因序列分析,与周围共生菌耐药质粒的基因序列比对。结果铜绿假单胞菌耐药株的耐药质粒与周围共生菌质粒发现有相同基因序列（χ2检验,χ2＝1.207,P＜0.01）。结论耐药质粒能在不同种属细菌之间传递。     

用喹诺酮诱导铜绿假单胞菌获得耐药质粒的研究

目的探讨对喹诺酮敏感的铜绿假单胞菌经诱变后耐药质粒基因的变化。方法收集该院2011年1月至2013年12月从各种合格临床标本培养出的铜绿假单胞菌共31例,将其中16例用K-B药敏试验证明对喹诺酮敏感的细菌作为研究对象。挑选环丙沙星药敏纸片敏感圈外生长的铜绿假单胞菌进行连续转种诱变,直至铜绿假单胞菌对喹诺酮产生耐药。对新产生耐药性的铜绿假单胞菌进行质粒转化、提取质粒并确定其耐药质粒的存在,通过PCR扩增、基因序列分析,确定获得的耐药质粒类型。结果 16例对喹诺酮敏感的铜绿假单胞菌在喹诺酮诱变下连续转种第9次以后有2例发生突变产生qnrS耐药质粒。结论抗菌药物在抑菌浓度附近使用,细菌容易突变产生耐药质粒基因。     

大肠埃希菌临床菌株对氟喹诺酮类的耐药机制

DNA旋转酶编码基因（gyrA和gyrB）和拓扑异构酶编码基因（parC和parE）的染色体突变、多重药物外排泵AcrAB表达水平升高以及存在质粒介导aCC（6’）-Ib-cr和各种qnr基因等耐药机制均可导致氟喹诺酮类药物对大肠埃希菌的MIC升高。已有报道环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星和诺氟沙星对氟喹诺酮类药物耐药大肠埃希菌临床菌株的MIC高,并有很大差异。作者等对153株流行病学信息已知的菌株中选择78株代表不同氟喹诺酮类药物MIC范围的菌株,进行上述各种喹诺酮类药物耐药基因测序,发现：①所有氟喹诺酮类药物耐药菌株（58株）均存在gyrA突变;     

铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类耐药关系研究

目的：了解铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药的关系。研究其临床意义。方法：通过PCR HinfⅠ酶切分析,PCR－单链构象多态性分析（SSCP）等方法检测铜绿假单胞菌ATCC27853及36株铜绿假单胞菌临床分离株的gyrA基因突变情况。结果HinfⅠ酶切结果显示,所有13株环丙沙星耐药株,3株环丙沙星中介株中的2株,20株环丙沙星敏感株中的1株存在gyrA基因HinfⅠ酶切酶点突;SSCP分析结果显示,所有耐药菌株和中介菌株的gyrA基因基因HinfⅠ酶切位点突变密切相关,但gyrA基因突变不局限于该位点,在常规药敏试验的基础上开展gyrA基因突变检测有重要的临床意义。     

75株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌ERIC-PCR菌种分型及其主要耐药机制研究

目的探讨碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌同源性及其主要耐药机制。方法收集临床标本946份,分离出碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌,采用琼脂稀释法进行体外药物敏感性试验;采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行耐药菌株同源性分析;筛选其金属β-内酰胺酶并测定主动外排系统表型来分析碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌的耐药性。结果共检测出75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌;ERIC-PCR同源性分析显示75株菌株共分为8个型别,其中A型占34.7%(26株)、B型占22.7%(17株);75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中有13株为产酶株,产酶率为17.3%;外排泵抑制剂MC207110可以使34株美罗培南耐药株的最低抑菌浓度(MIC)较单药时下降4倍或以上,占63.0%。结论本院分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌主要有两种类型,产生碳青霉烯水解酶和外排泵机制是碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌耐药的重要机制。     

志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药

目的探讨DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变与志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因并挑选11株菌扩增片段进行DNA测序,分析突变位点与药敏结果的关系。结果11株扩增片段测序结果显示,9株耐萘啶酸菌均在gyrA 83位发生有意义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),宋内志贺菌未发生parC基因突变,5株耐萘啶酸、诺氟沙星和/或环丙沙星中介敏感福氏志贺菌在parC 80位发生有意义突变AGC(Ser)→ATC(Ile)。结论志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重,福氏志贺菌比宋内志贺菌更耐此类药物,靶酶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一,gyrA Ser83→Leu突变是导致志贺菌临床株对萘啶酸耐药的关键突变。parC基因突变在gyrA基因突变的基础上才会发生,parC突变可能引起诺氟沙星和/或环丙沙星不敏感。     

IRPA对β-内酰胺酶类抗菌药物主要耐药机制研究

目的研究该院耐亚胺培南的铜绿假单胞菌β-内酰胺酶的基因分布、膜孔蛋白OprD2的缺失情况及外排泵MexAB-OprM的表达情况。方法收集该院2015年4月至2016年7月由全自动细菌鉴定仪筛选出来的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌,采用K-B法进行耐药表型确认,采用聚合酶链反应(PCR)检测耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属酶基因IMP、VIM、SIM、GIM、SPM,超广谱β-内酰胺酶基因TEM、VEB、SHV、PER、OXA-2、OXA-10;对扩增阳性产物进行基因测序,采用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌膜孔蛋白OprD2的缺失情况及mexA的表达水平。结果该院耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属酶基因均未检出;超广谱β-内酰胺酶基因TEM阳性20株(83.3%),其他型未有检出;阳性产物基因测序经比对确认为TEM-1型;膜孔蛋白OprD2缺失6株(25%),外排泵MexAB-OprM过度表达6株(25%)。结论该院耐亚胺培南铜绿假单胞菌对β-内酰胺酶类的耐药机制主要以由超广谱β-内酰胺酶基因TEM-1型介导为主,膜孔蛋白OprD2缺失以及主动外排泵MexAB-OprM过度表达为辅。     

志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药

目的探讨DNA旋转酶A亚单位（gyrA）和拓扑异构酶Ⅳ C亚单位（parC）基因突变与志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用聚合酶链反应（PCR）检测志贺菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）相关gyrA、parC基因并挑选11株菌扩增片段进行DNA测序，分析突变位点与药敏结果的关系。结果11株扩增片段测序结果显示，9株耐萘啶酸菌均在gyrA83位发生有意义突变TCG（Ser）→TTG（Leu），宋内志贺菌未发生parC基因突变，5株耐萘啶酸、诺氟沙星和／或环丙沙星中介敏感福氏志贺菌在parC80位发生有意义突变AGC（Ser）→ATc（Ile）。结论志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重，福氏志贺菌比宋内志贺菌更耐此类药物，靶酶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一，gyrA Ser83→Leu突变是导致志贺菌临床株对萘啶酸耐药的关键突变。parC基因突变在gyrA基因突变的基础上才会发生，parC突变可能引起诺氟沙星和／或环丙沙星不敏感。     

多重及泛耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌医院感染调查及产碳青霉烯酶表型研究

目的 了解铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌院内感染分布、耐药特点以及产碳青霉烯酶表型情况。方法 回顾性收集2012年7月到2013年7月该院分离非重复铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌医院感染菌株及病例。采用纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验,改良Hodge试验进行碳青霉烯酶初筛,初筛阳性菌株应用2-巯基丙酸协同法进一步检测金属酶。结果 在研究期间,共纳入非重复铜绿假单胞菌250株,鲍曼不动杆菌132株。菌株标本类型以痰液(55.5%)为主,科室分布以重症监护病房(20.9%)为主。药敏试验显示:铜绿假单胞菌对测试药物敏感性较好,均大于70%以上,对IPM和MEM耐药率较低分别为8.5%、9.5%,然而鲍曼不动杆菌对测试药物耐药率较高达35.2%~77.4%,对IPM和MEM耐药率分别为35.2%、39.1%。多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌医院感染发生率要高于铜绿假单胞菌分别为44.7%和24.0%;9.1%和2.8%。40株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌,碳青霉烯酶初筛阳性11株占27.5%,金属酶表型阳性2株占18.2%;49株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌,碳青霉烯酶初筛阳性37株占75.5%,金属酶表型阳性1株占2.7%。结论 该院铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物呈现不同耐药性,应加强监测。产碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类药物主要机制之一。产金属酶铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌检出率较低。     

gyrA和parC介导的铜绿假单胞菌对环丙沙星耐药机制研究

目的了解十堰地区耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌(PA)的药敏情况及gyrA和parC基因突变情况。方法用Vitek32对110株PA进行鉴定和药敏检测,对临床常用抗生素的药敏情况进行分析,琼脂稀释法测定60株耐环丙沙星(CIP)的PA对CIP的最低抑菌浓度(MIC),限制性长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测耐CIP的PAgyrA和parC基因突变情况。结果耐药菌株对哌拉西林/他唑巴坦的敏感率最高(68.3%)。在60株耐CIP的PA中有42株(70.0%)耐药菌株发生gyrA基因的83位点突变,密码子发生ACC→ATC改变,编码83位氨基酸的碱基发生突变Thr→Ile(ACC→ATC),有38株(63.3%)耐药菌株发生parC基因87位点突变Ser→Leu(TCG→TTG),同时发生两种突变的共36株(60.0%)。结论耐氟喹诺酮类PA对临床常用抗生素的敏感性降低,并呈多重耐药,药物作用靶位gyrA和parC的基因突变为其耐氟喹诺酮类药物的主要机制。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药特征及其耐药机制研究

目的分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药特征,并研究对亚胺培南的耐药机制。方法采用Micro-Walkaway-40进行细菌鉴定和药物敏感试验,应用PCR法对铜绿假单胞菌亚胺培南耐药相关基因（IMP、VIM、GIM、OXA）和膜微孔蛋白基因oprD2进行检测,琼脂稀释法检测氰氯苯腙（cccp）对耐亚胺培南铜绿假单胞菌MIC的影响。结果 65株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对舒普深、特治星、阿米卡星的耐药率分别为38.5%、43.1%和44.6%,对头孢他啶、马斯平和环丙沙星的耐药率分别为50.8%、53.8%和55.4%;65株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中,IMP阳性11株（16.9%）、VIM 4株（6.2%）,oprD2基因缺失5株（7.7%）,其余耐药基因未检出;CCCP检测阳性时,亚胺培南的MIC值下降,提示存在主动外排机制的菌株7株（10.8%）。结论耐亚胺培南铜绿假单胞菌多重耐药现象较为严重,其耐药机制主要与细菌产IMP型金属β-内酰胺酶、细胞主动外排机制以及膜微孔蛋白基因oprD2缺失有关。     

铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制探讨

目的探讨铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。方法取铜绿假单胞菌55株。采用外膜蛋白图谱,紫外吸收法测定外膜微孔蛋白OprD2基因含量;采用纸片协同试验检测β-金属酶;采用Etest试验观察氰氯苯腙对亚胺培南最低抑菌浓度(M IC)的影响。结果铜绿假单胞菌耐药株OprD2基因相对含量明显低于敏感株(P<0.01),且检出产β-金属酶4株,有17.4%菌株存在主动外排泵出机制。结论OprD2基因的减少,产生β-金属酶及存在主动外排泵出机制是唐山地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。