重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫保护作用的研究

目的研究重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫对感染小鼠的免疫保护作用。方法大量制备重组日本血吸虫32kDa蛋白(rSjGST-Sj32)和铁蛋白(GMCSF-SjFer)。48只昆明小鼠随机分为A,B,C,D4组,每组12只。B组和C组分别为rSjGST-Sj32和GMCSF-SjFer免疫组,每鼠注射50μg重组蛋白加弗氏完全佐剂(FCA);D组为联合免疫组,每鼠注射50μg重组32kDa蛋白和50μg铁蛋白的混合物加FCA;A组为FCA对照组。分别于0、2、6w共免疫3次。第3次免疫后2w,每鼠经腹部皮肤攻击感染40±1条尾蚴,感染后第45天剖杀所有小鼠,比较各组间减虫率和鼠肝卵减少率。结果联合免疫组与FCA对照组相比,获得了36.53%的减虫率和68.44%的每条雌虫肝组织产卵减少率,而单独rSjGST-Sj32免疫组的减虫率及每条雌虫肝组织产卵减少率分别为22.80%和43.12%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001);单独GMCSF-SjFer免疫组分别为21.05%和41.91%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001)。结论rSjGST-Sj32蛋白和GMCSF-SjFer蛋白联合免疫可显著地提高这两种蛋白单独应用时的免疫保护作用。     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗不同免疫途径免疫保护效果研究

目的:观察本室所构建日本血吸虫大陆株31kDa组织蛋白B DNA疫苗在BALB/c小鼠体内的不同免疫途径的免疫保护效果.方法:用纯化的空白质粒载体VR1012、重组质粒VR1012-Sj31免疫BALB/c鼠,将36只6～8周龄BALB/c鼠随机分为3组,每组12只,对照组(A组)肌肉注射空白质粒载体VR1012,实验组(B组)皮下注射重组质粒VR1012-Sj31,C组肌肉注射重组质粒VR1012-Sj31.质粒剂量均为100μg,每隔2w免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后第21d,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,42d后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数,观察诱导产生的减虫和减卵效果,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果:ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与空白质粒对照组比较,2个实验组的减虫率分别为15.0%(P＞0.05)和25.0%(P＜0.05),减卵率分别为38.22%和54.90%(P＜0.001).与皮下免疫组相比,VR1012/Sj31肌肉免疫组的减卵率分别为26.99%(P＜0.001).结论:DNA疫苗VR1012-Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,肌肉注射的保护效果大于皮下注射.     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态观察及免疫保护力的研究

为检测血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态变化和免疫保护力,采用106CFU疫苗皮下1次和3次接种小鼠,接种后8周用日本血吸虫尾蚴攻击感染。感染后6周剖杀小鼠,计算减虫率和减卵率,同时设有BCG对照组。结果发现实验组免疫后血清IgG抗体迅速升高并持续于高水平;减虫率分别为39.74%和39.74%,减卵率分别为62.86%和55.62%,与对照组相比均有非常显著的差异（P<0.01）。而免疫3次和免疫1次小鼠血清IgG抗体水平及减虫率、减卵率均无显著差异。血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗皮下注射1次即能诱导小鼠较高水平的IgG抗体和免疫保护力,是一种比较理想的新型疫苗,值得进一步研究。     

日本血吸虫多价DNA疫苗pBK-Sj26(Sj32)-Sj23免疫效果的观察

为了观察血吸虫病多价DNA疫苗的保护力,将小鼠分成5组空白对照组、空质粒对照组、单价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj23组、多价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj26-Sj23和pBK-CMV-Sj32-Sj23组.大量提取各组质粒DNA后,各组于0、3、5周在BALB/c小鼠股四头肌注射相应质粒DNA,9周用血吸虫尾蚴攻击感染,15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率.结果显示与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性差异(P<0.01);与单价pBK-CMV-Sj23组比较,多价DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性差异.提示血吸虫多价DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗.     

日本血吸虫复合DNA疫苗的组织表达及免疫保护效果研究

目的 :观察本课题组所构建日本血吸虫大陆株复合DNA疫苗VR10 12 SjGST和VR10 12 SjGST Sj32在小鼠肌肉组织中的表达 ,并进行免疫保护效果测定。方法 :用纯化质粒免疫昆明鼠 :4 8只小鼠分为 4组 ,两个对照组的小鼠分别于股四头肌注射生理盐水 10 0 μl或空质粒VR10 12 10 0 μg,两个实验组的小鼠则同法分别注射VR10 12 SjGST和VR10 12 SjGST Sj32各 10 0 μg。末次免疫后 ,每组解剖两只小鼠 ,以间接免疫荧光法观察SjGST、Sj32在肌肉组织中的表达。其余每只鼠经腹部感染 10条尾蚴 ,4 5d后剖杀计数各小鼠成虫数和肝卵数。结果 :小鼠肌肉组织表达出抗原特异性蛋白质抗原分子。与生理盐水组比较 ,两个实验组的减虫率分别为 33.9%和及 2 7.14 %(均为P <0 .0 5 ) ,减卵率分别为 6 1.86 %和 6 8.87% (均为P <0 .0 0 1)。与VR10 12 SjGST组相比 ,VR10 12 SjGST Sj32组的减卵率为 18.5 1% (P <0 .0 5 )。结论 :DNA疫苗VR10 12 SjGST和VR10 12 SjGST Sj32能在组织中正常表达 ,能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用 ,复合疫苗的保护效果要大于单价疫苗     

重组核酸疫苗诱导小鼠抗血吸虫感染的免疫学研究

目的为日本血吸虫病的防治寻求新的高效联合基因免疫策略。方法构建共表达日本血吸虫相对分子质量23000表膜蛋白(Sj23)基因与鼠IL12基因的核酸疫苗质粒pVIVO2IL12Sj23,转染HEK293细胞,通过RTPCR,Westernblot及ELISA法检测Sj23和IL12蛋白的表达。接种并攻击感染BALB/c小鼠,以减虫率和减卵率评价其免疫保护力,同时设攻击感染对照组、空白质粒pVIVO2组、pVIVO2IL12组和pVIVO2Sj23组。用ELISA法和WesternBlot分析免疫小鼠血清中抗体。以脾细胞培养法检测经SEA刺激后,小鼠脾细胞分泌IFNγ和IL4的水平。并以FCM分析脾细胞亚群。结果经瞬时转染HEK293细胞证明质粒pVIVO2IL12Sj23能在体外进行表达。免疫小鼠后获得了4553%的减虫率和5835%的减卵率,较单价DNA疫苗pVIVO2Sj23免疫效果好(P<005)。ELISA法和WesternBlot检测抗体结果表明免疫小鼠产生了抗Sj23特异性IgG抗体。pVIVO2IL12Sj23免疫组IFNγ的水平较对照组显著升高而IL4水平较对照组低。攻击感染后各实验组小鼠脾细胞的CD4+,CD8+亚群比率无显著差别(P>005)。结论pVIVO2IL12Sj23DNA疫苗具有诱导BALB/c小鼠产生较好的抗血吸虫感染免疫保护效果。细胞因子IL12作为基因佐剂,具有诱导Th1型免疫反应从而增强DNA疫苗免疫保护性的作用。     

日本血吸虫HGPRT重组抗原与不同佐剂联合应用对小鼠免疫保护作用的研究

目的:观察日本血吸虫(大陆株)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase, HGPRT)重组抗原(reSjc HGPRT)与ISA206或弗氏佐剂联合免疫对小鼠诱导抗日本血吸虫感染的保护作用. 方法:雌性C57BL/6小鼠随机分为5组:reSjc HGPRT加ISA206佐剂免疫组、reSjc HGPRT加弗氏佐剂组、ISA206佐剂对照组、弗氏佐剂对照组和感染对照组.20 μg重组抗原和ISA206或弗氏佐剂乳化后小鼠项背部多点皮下注射,共免疫3次,每次间隔2周.佐剂对照组小鼠仅注射ISA206或弗氏佐剂和生理盐水,感染对照组不注射任何重组抗原或生理盐水.于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部皮肤感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴,6周后剖杀小鼠,门脉灌注收集成虫,计数成虫数、雌雄合抱数和小鼠肝组织虫卵数.在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前分别采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体. 结果:重组抗原加ISA206佐剂或弗氏佐剂免疫组均诱导小鼠产生特异性IgG抗体应答,与感染对照组和弗氏佐剂对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);诱导小鼠产生的减虫率、减雌雄合抱率和肝组织减卵率分别为53.7%、59.3%、44.9%和43.3%、44.1%、33.0%,与感染对照组和2种佐剂对照组相比均有统计学意义(P<0.05).结论:reSjc HGPRT与ISA206或弗氏佐剂联合免疫,可诱导小鼠产生抗血吸虫感染保护作用.     

Sj31与鼠IFN-γ基因融合DNA疫苗免疫保护效果的研究

目的构建表达mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗,并探讨其免疫保护作用。方法在Sj31基因上游引物与mIFN-γ下游引物的5’分别设计与克隆载体相匹配的酶切位点,在mIFN-γ上游引物与Sj31基因下游引物的5’设计相同的酶切位点。分别进行PCR扩增,再通过引物的5’端相同的酶切位点进行2个PCR产物的酶切与连接,以连接产物为模板,应用Sj31的上游引物和mIFN-γ下游引物进行PCR扩增,将此次PCR产物经常规方法克隆入载体pcDNA3.0(简称为pc),构建成多价DNA疫苗pc-Sj31-mIFN-γ。对重组质粒鉴定后,大量制备纯化质粒免疫昆明小鼠,48只小鼠分为A、B、C、D4组,对照组的小鼠于股四头肌注射质粒pcDNA3.0100μg,3个免疫组的小鼠分别注射pc-Sj31、pc-mIFN-γ和pc-Sj31-mIFN-γ质粒DNA各100μg。在0、2、6周免疫共3次,第3次免疫后2周,每只小鼠经腹部贴片感染尾蚴40±1条,感染后第42天剖杀,计数各小鼠检获成虫数及肝卵数。结果pc-Sj31-mIFN-γ(D组)免疫组的减虫率和肝组织减卵率分别为28.56%和60.20%,但是表达鼠mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗并未明显优于单纯表达日本血吸虫组织蛋白酶B(Sj31)DNA疫苗的免疫保护作用。结论pc-Sj31-mIFN-γ多价DNA疫苗构建成功,但其诱导小鼠抗血吸虫病免疫保护效果不明显优于pc-Sj31。     

日本血吸虫Calpain的DNA疫苗诱导小鼠免疫保护性研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株Calpain的DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫保护性作用。方法　大量制备pVAC质粒DNA和pVAC -CalpainDNA疫苗 ,Balb/c小鼠 5 0只 ,随机均分为对照组和实验组 ,对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 μgpVAC质粒DNA ,实验组以同样方式注射 10 μgpVAC -CalpainDNA疫苗 ,第 3周加强免疫一次。第 4周每只小鼠经腹部皮肤感染 ( 2 5± 1)条尾蚴 ,感染 6周后剖杀 ,从门静脉灌流收集计成虫数、碎脾计T淋巴细胞总数、从各鼠肝脏的同一部位切下小块肝组织 ,置 5 %KOH溶液消化后 ,计算每克肝组织虫卵数 ,比较减虫率、减雌率和减卵率。于免疫前、第一次免疫后 2周和感染后 2周分别从尾静脉采血 ,用ELISA测定抗体水平。结果　与对照组相比 ,实验组获得 36.84%的减虫率、36.36%的减雌率和 43.31%的减卵率 ,感染后实验组小鼠IgG抗体水平升高幅度大于对照组 ,对照组T淋巴细胞数显著多于实验组。结论　CalpainDNA疫苗可诱导小鼠产生较好的免疫保护作用 ,具有较大的发展潜力     

表达mIFN-γ的重组链球菌的构建及其对重组Sj-F1链球菌疫苗免疫调节作用研究

目的 构建表达mIFN-γ的重组链球菌,并与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗进行联合免疫,观察IFN-γ对重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗的免疫调节效应.方法 用PCR法扩增mIFN-γ基因,亚克隆至链球菌重组质粒pGMB1,经PCR、限制性酶切和测序鉴定筛选阳性重组子.将阳性重组质粒转化链球菌载体,经抗生素抗性转化及染色体PCR鉴定筛选阳性重组链球菌.用Streak blot和Westem blot分析鉴定重组链球菌的表达情况.鉴定后的重组mIFN-γ链球菌与重组Sj-F1链球菌疫苗联合应用,经滴鼻接种免疫昆明小鼠,观察诱导产生的减虫和减卵效果.结果 成功构建了分泌mIFN-γ重组链球菌.Streak blot和Westem blot分析表明重组链球菌能分泌mIFN-γ并可稳定遗传.免疫保护性实验表明,重组mIFN-γ链球菌与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗联合免疫,减虫率和减卵率分别为31.56％和47.48％,与单用重组Sj-F1链球菌疫苗比较减虫率和减卵率均增加.结论 结果表明,重组mIFN-γ链球菌能增强重组Sj-F1链球菌疫苗抗日本血吸虫感染的保护力.     

重组日本血吸虫SjGT—Sj32蛋白诱导小鼠保护免疫的研究

应用基因工程技术分别表达出ＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２,Ｓｊ３２和ＳｊＧＳＴ,用于保护性免疫的动物实验及其体液免疫机制的初步探讨。结果：与对照组相比,重组ＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２＋ＳｊＧＳＴ组均有明显的减虫效果。上述三组及ＳｊＧＳＴ组的肝脏虫卵计数的均较对照组为少。提示重组Ｓｊ３２ｋＤ蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护性免疫及抗生殖免疫效果,而ＳｊＧＳＴ仅表现出一定的抗     

重组日本血吸虫SjGST-Sj32蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

应用基因工程技术分别表达出ＳｊＧＳＴＳｊ３２,Ｓｊ３２和ＳｊＧＳＴ,用于保护性免疫的动物实验及其体液免疫机制的初步探讨。结果：与对照组相比,重组ＳｊＧＳＴＳｊ３２组,Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２＋ＳｊＧＳＴ组均有明显的减虫效果（Ｐ＜０．０５）。上述三组及ＳｊＧＳＴ组的肝脏虫卵计数均较对照组为少（Ｐ＜０．０１）。提示重组Ｓｊ３２ｋＤ蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护性免疫及抗生殖免疫效果,而ＳｊＧＳＴ仅表现出一定的抗生殖免疫效果。     

Immune responses against Schistosoma japonicum after vaccinating mice with a multivalent DNA vaccine encoding integrated membrane protein Sj23 and cytokine interleukin-12

Background The vaccination of mice with DNA encoding single candidate antigens has failed to induce significant protection against Schistosoma japonicum ( S. japonicum) challenge infections. In this study, we evaluated the feasibility of using a multivalent DNA vaccine which co-expressed S.japonicum integral membrane protein Sj23 and murine cytokine IL-12 to induce protective immune responses.Methods The plasmid pVIVO2-IL12-Sj23, a eukaryotic expression vector expressing Sj23 and murine IL-12 simultaneously, was constructed, identified, and tested for expression in vitro. Its ability to protect against S. japonicum challenge infections was analyed according to worm reduction rate and egg reduction rate after vaccination of BALB/c mice. The serum levels of specific IgG antibody were determined by enzyme-linked-immuno sorbent assay (ELISA) and Western blot analysis. Using cultured spleen cells, IFN-γ and IL-4 post-stimulation were quantified by ELISA. The phenotypes of splenocyte populations were analyzed by flow cytometry (FCM).Results The plasmid DNA pVIVO2-IL12-Sj23 was proven to express well in vitro by transient transfection of HEK-293 cells. Immunization resulted in a worm reduction rate of 45. 53% and egg reduction rate of 58.35%. ELISA and Western blot analysis indicated that immunized mice generated specific IgG against Sj23. Spleen cells showed significant increases in IFN-γ but decreases in IL-4.No significant differences in CD4^ and CD8^ subgroup ratios were observed after the challenges.Conclusions The multivalent DNA vaccine pVIVO2-1L12-Sj23 is sufficient to elicit moderate but highly significant levels of protective immunity against challenge infections. Cytokine IL-12, as a gene adjuvant, was able to enhance the Thl responses and, hence, the protective immunity.     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗诱导小鼠脾细胞IL-6变化的研究

目的：研究日本血吸虫重组BCG－Si26GST疫苗对小鼠脾细胞IL－6的影响,方法：实验1采用该疫苗皮下免疫小鼠,免疫后8周用日本血吸虫尾缦进行攻击感染,感染后6周剖杀小鼠,同时设有PBS对照组,实验2用该疫苗皮下和静脉注射分免疫小鼠,于免疫后,0,4,8,10,14和16周各剖杀4只,分离脾脏,用Si26或PHA刺激脾细胞,用ELISA法检测5 清液中IL－6含量,结果：疫苗免疫尾缦攻击后,IL－6水平无明显变化;动态观察发现IL－6于疫苗免疫后8－10周达最高水平,结论：IL－6可能与日本血吸虫重组BCG－Si26GST疫苗诱导的保护性免疫力无关。     

日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫的研究

为探讨血吸虫ＤＮＡ疫苗保护性免疫效果,首先构建、鉴定和表达日本血吸虫ＤＮＡ疫苗（ｐＣＤ－Ｓｊ３２）。实验结果表明：ｐＣＤ－Ｓｊ３２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠能诱导产生抗日本血吸虫感染免疫力,减虫率为３５．６％～４４．４％,减卵率为３９．４％～６９．０％;１００μｇＤＮＡ一次肌肉注射,免疫后８周攻击感染组的效果好;ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞、ＩＬ－２、ＴＮＦ和ＩＮＦ－γ可能在血吸虫病免疫功能调控中起重要作用;ｐＣＤ－Ｓｊ３２能诱导宿主产生高滴度特异性抗体,并在体外能介导巨噬细胞产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ＡＤＣＣ）免疫效应。结果提示,ｐＣＤ－Ｓｊ３２有可能发展为新的预防血吸虫病的亚单位疫苗。     

日本血吸虫抗原的表位模拟肽筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雄虫抗原的表位模拟肽 ,并探讨其诱导小鼠抗日本血吸虫的免疫保护性。　方法　用日本血吸虫可溶性雄虫抗原的IgG对噬菌体随机 1 2肽库进行亲和筛选。 3轮筛选后 ,经Dot-ELISA检测获得阳性噬菌体克隆 ,并用混合特异性噬菌体克隆免疫小鼠及进行抗日本血吸虫免疫保护性分析。　结果　 1 8个特异性噬菌体克隆均显示有抗原性 ,其噬菌体混合克隆免疫诱导小鼠产生了特异性抗体 ,以及 31 72 %的减虫率和 51 54%的减卵率 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 0 1 )。　结论　筛选噬菌体肽库获得的日本血吸虫可溶性雄虫抗原的表位模拟肽分子能诱导小鼠产生抗日本血吸虫的保护性免疫。     

核酸疫苗Sj31BIN联合IL-12免疫抗日本血吸虫攻击感染的实验研究

目的：在证明日本血吸虫重组蛋白酶B核酸疫苗Sj31BIN具有抗生殖免疫作用的基础上,联合使用IL-12,观察IL-12是否具有佐剂效果。方法：分别用Sj31BIN IL-12和IL-12免疫Balb／C小鼠。攻击感染后6周计数成虫负荷和组织内虫卵数及肝脏表面虫卵结节数。结果：Sj31BIN IL-12免疫小鼠可降低成虫发育率。肝组织减卵率为59．74％;肠组织减卵率为59．60％;肝脏表面虫卵结节减少率为71．30％;单独使用IL-12有一定的免疫保护作用。结果：Sj31BIN IL-12能诱导小鼠产生较强的抗生殖免疫作用。     

噬菌体随机肽库筛选日本血吸虫22.6kDa蛋白有效抗原表位的初步研究

目的：从噬菌体随机12肽库中筛选出中国大陆株日本血吸虫22.6kDa蛋白（Sj22.6kDa抗原表达的短肽分子，探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。方法：以纯化的抗日本血吸虫22.6kDa的多克隆抗体IgG为配基，对噬菌体12肽库进行5轮亲和筛选，富集特异性噬菌体，挑取克隆，经序列分析，免疫识别和动物初筛后获得阳性克隆。结果：经过5轮筛选，特异性噬菌体得到有效富集。随机挑选的24个噬菌体克隆中获得4个有效抗原表位。结论：利用噬菌体随机肽库筛选可获得类似日本血吸虫22.6kDa有效抗原表位的短肽分子，这些短肽分子能诱导抗血肿虫的保护性免疫。     

核酸疫苗Sj31BIN联合IL-12免疫抗日本血吸虫攻击感染的实验研究

目的 :在证明日本血吸虫重组蛋白酶B核酸疫苗Sj31BIN具有抗生殖免疫作用的基础上 ,联合使用IL 12 ,观察IL 12是否具有佐剂效果。方法 :分别用Sj31BIN +IL 12和IL 12免疫Balb/C小鼠。攻击感染后 6周计数成虫负荷和组织内虫卵数及肝脏表面虫卵结节数。结果 :Sj31BIN +IL 12免疫小鼠可降低成虫发育率。肝组织减卵率为5 9 74% ;肠组织减卵率为 5 9 6 0 % ;肝脏表面虫卵结节减少率为 71 30 % ;单独使用IL 12有一定的免疫保护作用。结论 :Sj31BIN +IL 12能诱导小鼠产生较强的抗生殖免疫作用。