人脐带间充质干细胞源性心肌细胞的纯化及生物学特性鉴定

目的 探讨基因修饰的方法纯化人脐带间充质干细胞源性心肌细胞的可行性,为临床心肌细胞移植寻找新的干细胞来源。方法 将人心肌球蛋白轻链（MLC-2v）基因启动子与嘌呤霉素抗性基因融合,然后转染人脐带间充质干细胞,通过嘌呤霉素筛选,纯化培养出 MLC-2v阳性细胞,用5-氮杂胞苷进行诱导,检测诱导后 MLC-2v阳性细胞是否表达心脏相关标记物。结果 纯化培养出的 MLC-2v阳性细胞经5-氮杂胞苷诱导后表达心肌细胞的标记物肌钙蛋白Ⅰ(troponin Ⅰ)、MLC-2v和结蛋白(desmin)。RT-PCR检测证实,人脐带间充质干细胞在转染及诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经筛选诱导后细胞表达Nkx2.5和desmin。结论 人脐带间充质干细胞通过基因修饰方法可以得到相对纯化的心肌样细胞,可能成为心脏细胞移植治疗重要的细胞来源。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

脐带干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的 研究5-氮胞苷能否诱导脐带干细胞向心肌细胞分化.方法 取无污染的足月剖宫产健康胎儿脐带,采用胶原酶胰酶消化法分离脐带干细胞.取克隆化生长的4～6代脐带干细胞,经流式细胞仪和骨、脂肪细胞诱导鉴定后,采用5 μmol/L 5-氮胞苷作用24 h,对细胞进行诱导,连续观察5周,倒置显微镜下观察其形态变化.RT-PCR分析肌钙蛋白T基因的表达,免疫细胞化学鉴定心肌特异性肌球蛋白、肌动蛋白α-actin的表达,电镜对细胞的超微结构进行分析.结果 诱导后,细胞的形态不断发生变化,但没有观察到可以跳动的心肌细胞.RT-PCR检测显示分化后的细胞表达心肌特异性基冈肌钙蛋白T,免疫组织化学发现诱导后的细胞表达心肌特异性肌球蛋白和α-肌动蛋白.电镜下观察,诱导4周后有明显的肌丝样结构形成.结论 脐带干细胞具有分化为心肌细胞的潜能,可作为心肌组织丁程和细胞移植研究新的干细胞来源.     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的分子机制及其微环境

近年来,大量实验证明骨髓间充质干细胞(MSCs)能在体外被诱导成心肌样细胞,并在宿主心肌内大量存活并分化为心肌样细胞,但均与成熟的功能性心肌细胞有一定差异.探讨影响MSCs分化为心肌细胞的分子机制及其微环境因素,提高MSCs分化程度,可为MSCs在临床上移植治疗心肌疾病、改善心功能提供有效的实验和理论依据.     

应用5-杂氮脱氧胞苷诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的体外研究

目的 探讨5-氮杂脱氧胞苷(5-AzaC)体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的可行性.方法 B超引导下穿刺抽得孕中期羊水,体外分离、培养得到羊水来源间充质干细胞,传代后计数细胞并绘制生长曲线.体外成骨、成脂诱导观察人羊水来源间充质干细胞多向分化能力.采用5-AzaC对羊水来源间充质干细胞成肌诱导2周,观察细胞形态学变化,RT-PCR、免疫荧光染色方法鉴定成肌细胞特异mRNA及蛋白表达.结果 人羊水来源间充质干细胞体外培养后迅速进入对数生长期,培养7 d未达到平台期.茜素红和油红O染色证实人羊水来源间充质干细胞可诱导分化为成骨、成脂细胞样细胞.人羊水来源间充质干细胞经5-AzaC诱导2周逐渐变长梭形.而对照组细胞呈扁平多角形.免疫荧光染色及RT-PCR结果提示实验组细胞表达肌结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白I(Tn I)、横纹肌辅肌动蛋白(α-Actinin)及mRNA;对照组呈阴性.结论 人羊水来源间充质干细胞体外增殖能力强,能分化为成骨、成脂细胞样细胞.5-AzaC能在体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化.     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的探讨先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）向心肌样细胞诱导分化的可行性，为心肌组织工程提供新的种子细胞的来源。方法无菌条件下抽取先天性心脏病婴幼儿胸骨骨髓3～5ml，经密度梯度离心（Percoll分离液，T为1．073），接种获得BM～SCs，常规培养。流式细胞仪检测细胞表面抗原。将已传2代的细胞应用5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5Aza）诱导24h，更换为完全培养基（LG-DMEM）后继续培养，2周后行免疫细胞化学及透射电镜行超微结构检查。结果先心病婴幼儿BMSCs基本上为梭型成纤维细胞样形态，表面标记为CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性，CD3、CD14、CD34、CD45、HLA-DR不表达。BMSCs经5-Aza诱导2周后α-actin，Desmin，cTnI，Cx-43免疫细胞化学染色阳性，透射电镜示诱导后的细胞有明显的肌丝，单个细胞核呈椭圆形，位于细胞的中央。结论先心病婴幼儿骨髓阃充质干细胞可在体外经5-Aza诱导分化为心肌样细胞，有望成为应用自体细胞体外构建工程化心肌重要的种子细胞。     

人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的实验研究

目的 探讨人脐带华尔通胶质来源的问充质干细胞(MSCs)分化为胰岛素分泌细胞的可能性.方法 从足月剖宫产的新生儿脐带华尔通胶质中分离培养出MSCs,传至第5代用含尼克酰胺和β巯基乙醇的低糖达尔伯克必需基本培养基预诱导,以含尼克酰胺和β巯基乙醇的高糖达尔伯克必需培养基诱导其向胰岛素分泌细胞分化,应用免疫细胞化学法检测其胰岛素的表达,以双硫腙染色鉴定胰岛β细胞,并用放射免疫法检测诱导后细胞培养液中胰岛素水平,检测均以未诱导细胞作为实验对照.结果 免疫细胞化学法检测结果显示,经尼克酰胺和β巯基乙醇联合诱导后的人脐带MSCs表达胰岛β细胞的标记胰岛素.双硫腙染色发现脐带华尔通胶质来源的MSCs经尼克酰胺和β巯基乙醇诱导后细胞内锌离子增加.通过胰岛素放射免疫法检测诱导前后细胞培养液中胰岛素水平,实验组和对照组分别为(6.63±1.80)U/L和(3.39±0.21)U/L,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 人脐带MSCs经尼克酰胺和β巯基乙醇联合诱导后可表达胰岛素β细胞的表面标记,增加细胞内锌离子水平,使之具备胰岛β细胞的特点,诱导后的细胞也可分泌胰岛素.用尼克酰胺和β巯基乙醇可诱导人脐带MSCs分化成为胰岛素分泌细胞,从而为1型糖尿病的细胞移植治疗提供新的细胞来源.     

脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下的生殖细胞特性

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞(MSCs)在精原细胞培养条件下向精原细胞方向分化的潜能.方法 采用组织块贴壁法获得MSCs,取第3代MSCs分组进行诱导培养:对照组用基本培养液培养,实验组用条件培养液培养.用倒置显微镜和扫描电镜观察对照组和实验组细胞的外部形态差异;透射电镜观察2组细胞内部的超微结构变化;免疫组织化学方法 检测2组细胞是否表达精原细胞的标记物CD117及CD49f;Western blot进一步检测2组细胞表达精原细胞特异性标记物CD49f的情况.结果 以人脐带华尔通胶为原料培养获得的贴壁细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记,并可以维持在未分化状态稳定生长、增殖;实验组细胞形态发生了明显变化,由成纤维细胞形变为圆形,并发现极少数变圆的细胞继续分化呈形似蝌蚪状,对照组细胞形态不发生类似变化,超微结构也显示了很大的差异;免疫组织化学证实实验组细胞表达精原细胞的标记物CD117、CD49f,而对照组细胞不表达CD49f,CD117弱阳性表达;Westem blot进一步证实人脐带MSCs诱导前不表达精原细胞标记CD49f,而诱导后表达CD49f.结论 用组织块贴壁法获得人脐带来源的MSCs,在精原细胞培养条件下进行诱导培养,不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程,而且能表达精原细胞的特征性标记,证实人脐带来源的MSCs具有向精原细胞方向分化的潜能.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新,分化增殖和多向分化潜能的特点,在体外通过化学物质5-氮胞苷的诱导作用,可分化为心肌样细胞;在体内通过干细胞因子和粒细胞集落刺激因子等作用,也可动员骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞,能有效改善心功能,具有广阔的临床应用前景。     

脐带血间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的疗效

目的探讨混合培养的人脐血间充质干细胞(MSCs)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠的疗效。方法无菌条件下收集20份健康足月新生儿脐血,采用密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞,再通过贴壁细胞培养法培养出人脐血MSCs。当细胞传至第3代时,随机取培养的8份脐血MSCs(半量)为A组,8份脐血MSCs(半量)为B组,将A、B组剩余的半量脐血MSCs混合为C组,3组细胞密度均为1×106L-1。混合培养的第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD105的表达。选择P4代人脐血MSCs作为移植细胞,并经5-溴-2-尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)体外标记。7日龄SD大鼠45只制备HIBD模型,造模中死亡3只,余42只分为混合移植组(n=16)、单份移植组(n=16)和对照组(n=10)。造模第3天,在立体定位条件下,移植组大鼠经左侧大脑皮质注入人脐血MSCs,对照组在相同部位注入相同体积的PBS。在细胞移植第7天,随机选择6只移植组大鼠处死取脑,采用免疫组织化学方法观察移植细胞在脑内的存活、迁移和分化情况。移植第1、7、14、21、28天采用改良神经功能损害评分(mNSS)对3组大鼠...     

大鼠胚胎神经干细胞移植治疗类脊髓栓系综合征的实验研究

目的将胎鼠的神经干细胞移植到脊髓栓系综合征大鼠的病变脊髓中，观察治疗效果。方法从孕17d大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞并诱导分化，通过免疫组化技术研究证实其特性。制作大鼠脊髓栓系模型，3d后将未分化的神经干细胞注人病变脊髓内，2个月后观察大鼠的运动功能，处死大鼠，研究移植后的干细胞在体内存活、迁移及分化情况。结果实验中分离、培养的神经干细胞能够被诱导分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。脊髓栓系大鼠移植干细胞后运动功能改善，神经元数目增多，显著好于未移植组。免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可以存活、迁移、分化成神经细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞体内、体外均具有多向分化潜能，移植神经干细胞是治疗脊髓栓系神经变性的一种有效途径。     

人脐血及脐带间充质干细胞的分离培养及表面标记分析

目的探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记。方法人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton’s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代。将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况。利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原。结果经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一。人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代。经冷冻保存,复苏后仍能较好生长。人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达。结论人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源。     

人脐带血间充质干细胞在缺氧缺血性脑病新生鼠脑内的定植

目的探讨脐带血间充质干细胞(MSCs)培养及其在缺氧缺血性脑病(HIE)新生鼠脑内的定植。方法用出生7 d的新生SD大鼠制作HIE模型,同时在当天分别用2种方法(定向注射和尾静脉注射方式)接受经Hoechst 33258标记24 h的MSCs移植,15~30 d观察MSCs存活情况。结果用改良Rice法可制备7日龄新生鼠单侧脑损伤为主的HIE模型;经定向注射和尾静脉注射移植的MSCs能在HIE脑内定植,分布在患侧大脑皮层、海马等部位,并主要以额叶为多,和宿主脑组织融合在一起。结论在体外培养条件下,人脐血MSCs可以生长,当MSCs移植到HIE模型鼠后,细胞能和脑实质融合在一起,并更多地向脑损伤部位迁移聚集。     

人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程免疫特性的研究

目的研究人脐带间充质干细胞(huMSCs)向胰岛素分泌细胞(IPCs)分化过程中的免疫学特性,为huMSCs作为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的细胞来源提供依据。方法以流式细胞术检测huMSCs及huMSCs源性IPCs的免疫表型;RT-PCR法检测huMSCs及huMSCs源性IPCs的HLA-A、HLA-DR基因的表达;CCK8法测定细胞增殖率,观察huMSCs及huMSCs源性IPCs对外周血单个核细胞增殖的影响。结果 huMSCs在体外培养条件诱导下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能;huMSCs及huMSCs源性IPCs均不表达CD80、CD86、CD40、CD40L、HLA-DR,均表达HLA-A;huMSCs能够抑制PHA刺激的外周血单个核细胞的增殖,但huMSCs源性IPCs未见该作用。结论 huMSCs及huMSCs源性IPCs均具有低免疫原性,可作为胰岛细胞移植的细胞来源,huMSCs对免疫反应具有负调节作用,但huMSCs源性IPCs不具有该作用。     

人脐带间充质干细胞、人脐带间充质干细胞源男性生殖细胞样细胞的免疫学特性

目的研究人脐带间充质干细胞(huMSCs)及其诱导分化为男性生殖细胞样细胞后的免疫学特性,为进一步研究huMSCs的移植特性提供实验依据。方法分离培养huMSCs,在男性生殖细胞培养条件下定向诱导其分化为huMSCs源男性生殖细胞样细胞。采用FACScan流式细胞仪检测诱导前后huMSCs表面抗原CD40、CD40L、CD80、CD86。半定量反转录(RT)-PCR检测诱导前后huMSCs的人类白细胞抗原(HLA)-Ⅰ、HLA-DR基因表达水平。采用CCK-8法检测诱导前后的不同数量级huMSCs对混合淋巴细胞反应体系中经植物血凝素(PHA)激活的同种异体外周血淋巴细胞(PBMC)增殖的影响。采用酶联免疫吸附试验检测诱导前后huMSCs对经PHA活化的T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的影响。结果 HuMSCs在男性生殖细胞培养条件下能分化为男性生殖细胞样细胞,诱导前后的huMSCs均表达HLA-Ⅰ,不表达CD40、CD40L、CD80、CD86和HLA-DR。huMSCs能抑制经PHA激活的T淋巴细胞增殖,并抑制T淋巴细胞IFN-γ的分泌,但huMSCs源男性生殖细胞样细胞并不能抑制经PHA激活的T淋巴细胞增殖及IFN-γ的分泌。结论 HuMSCs在体外定向诱导为男性生殖细胞样细胞后,诱导后的细胞与huMSCs一样具有低免疫源性,同时huMSCs在体外具有免疫抑制性,但诱导获得的huMSCs源男性生殖细胞样细胞不能抑制T细胞的增殖。