人胰激肽释放酶基因的克隆及融合蛋白的表达

目的开发激肽释放酶基因工程产品，为开展基因治疗高血压奠定基础。方法提取人胰腺组织总RNA，逆转录后PCR扩增激肽释放酶cDNA。回收、补平后插入质粒KS，构建出中间载体KSKK，酶切鉴定后双向测序分析激肽释放酶基因序列。从KSKK中切出激肽释放酶原及激肽释放酶基因，插入真核表达载体PET-28b（＋），经酶切鉴定后，进行核苷酸序列分析和融合蛋白表达。结果本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比，有一个碱基不同，同源性为99．8％。将IPTG诱导表达进行SDS—PAGE电泳，与蛋白标准品比较在31800处可见明显的高表达带。免疫印迹实验表明重组蛋白具有KK的抗原性。结论已成功克隆并表达了人组织激肽释放酶基因，为进一步开发基因工程产品及进行基因治疗高血压研究奠定了基础。     

国内医学新闻

高血压治疗基因——激肽释放酶基因克隆成功 广东深圳市卫生局办公室(518020)袁立新报道 深圳市人民医院李体远博士、戴勇博士等,不久前在国内率先成功克隆出对治疗高血压病具有重要意义的激肽释放酶基因。经权威机构上海Sangon生物工程公司测序分析,这种新克隆的中国人体组织激肽释放酶基因与国际报道的基因序列完全一致。该成果为我国在高血压基因治疗方面又增添了新的候选基因,     

人组织激肽释放酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人组织激肽释放酶基(h-TKK)基因真核表达质粒。方法 设计含pnI和BamH Ⅰ酶切住点的人组织激肤释放酶基因引物，采用PCR法从原核pBluescripe Ⅱ KSKK( )中扩增KKcDNA片段，亚克隆至padtrack-CMV真核表达裁体，转化感受态大肠杆菌DHl0B，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经 PCR能扩增出738bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论 成功构建了人组织激肽释放酶基因真核表达重组体pAdtrack-CMV KK。     

利用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达人胰激肽释放酶

目的　建立表达人胰激肽释放酶杆状病毒 /昆虫细胞表达系统 ,制备人胰激肽释放酶。方法　将中国人胰脏组织激肽释放酶基因克隆至pBacPAK9载体上 ,测序分析后 ,和BacPAK6病毒DNA共转染Sf2 1细胞 ,在细胞内同源重组。筛选出重组的杆状病毒 ,鉴定表达的重组人胰激肽释放酶。结果　经电位滴定法检查 ,其感染的Sf2 1细胞上清具有激肽释放酶活性。结论　重组病毒在昆虫细胞Sf2 1中表达了中国人胰激肽释放酶 ,其产物可用于基因工程产品及基因药物的深入研究工作     

人C型利钠肽基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：为开展C型利钠肽基因治疗，克隆人C型利钠肽基因并构建其真核表达载体。方法：通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆人C型利钠肽基因全长编码区，将该DNA片段亚克隆至克隆载体pBS-T中，用SmaⅠ单酶切筛选出负向插入片段，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，然后用双酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，人C型利钠肽基因全长编码区被准确插入至pcDNA3．1（＋）酶切位点HindⅢ和BamHⅠ之间，并且未发现有碱基突变或移位。结论：含人C型利钠肽基因真核表达质粒的成功构建并鉴定，为开展C型利钠肽基因治疗奠定了物质基础。     

人组织激肽释放酶基因家族研究进展

人组织激肽释放酶(HK)是一组分泌型丝氨酸水解酶,由激肽释放酶(KLK)基因编码,有15个家族成员,是迄今所知人类丝氨酸蛋白酶最大的家族.HK主要在前列腺、乳腺、卵巢以及睾丸等产生类固醇激素的组织或激素依赖性的组织中表达~([1]),可分为组织激肽释放酶和血浆激肽释放酶两大类,这两种激肽释放酶在相对分子质量大小、底物特异性、免疫学特性、基因结构以及释放的激肽类型等方面都存在着显著的差异~([2]).     

汉族人群组织激肽释放酶基因调控序列多态性分析

目的　分析组织激肽释放酶基因 5’端启动子区域多态性在四川地区汉族人群中的分布。方法　应同PCR技术结合等位基因特异寡核苷酸片段分析的方法 (ASO)对 13 2例四川地区健康汉族人的组织激肽释放酶基因用十种探针进行检测 ,分析等位基因频率的分布。结果　组织激肽释放酶基因的A、B、C、D、E、H、K、P的频率分别为 2 2 .7%、9.8%、9.8%、3 .0 %、9.1%、2 3 .1%、16.3 %、6.1%。结论　在我国四川地区的健康汉族人群中 ,该位点确实存在多态性。     

组织激肽释放酶基因与2型糖尿病关系的研究

目的初步探讨组织激肽释放酶基因调控序列启动子多态性与中国人2型糖尿病的相关性。方法应用PCR技术结合等住基因特异寡核苷酸片段分析（ASO）方法,对30例2型糖尿病患者和40例正常人的组织激肽释放酶基因用A、B、C、D、E、F、H、I、K、P10种探针检测,比较组间的等位基因频率差异,初步分析该SNP位点与2型糖尿病的关系。结果组织激肽释放酶基因启动子A、B、H、K型在2型糖尿病组中的分布频率分别为46．67％、35．0％、15．0％、3．33％,在对照组中分别为45．0％、37．5％、17．5%、0％,两组比较有差异,但无统计学意义。结论在中国汉族人群中,该位点确实有多态性,A、B、H、K型均有分布,以A型最广。     

激肽释放酶激活纤溶酶原机理的研究

作者研究了血浆和组织激肽释放酶激活纤溶酶原的机制。经SDS-PAGE和HPLC分析,提示血浆激肽释放酶裂解纤溶酶原的位点与t-PA、UK的相同,只是前者的酶反应速度明显低于后二者。组织激肽释放酶裂解纤溶酶原的位点除了与血浆激肽释放酶相同的部份外,尚有其它作用位点。因此认为这两种激肽释放酶激活纤溶酶原的机制不完全相同。     

人组织激肽释放酶基因7与肿瘤侵袭转移的关系

人类组织激肽释放酶7（kalliklein 7,KLK7）最先从皮肤角化细胞文库分离出,并证明是一种丝氨酸蛋白。该基因是组织激肽释放基因家族成员之一,编码hk7蛋白,与其它组织激肽释放酶基因有相似的基因及蛋白结构。它主要在角质层上皮细胞中表达,参与皮肤脱屑、皮肤疾病等生理病理过程。近年研究发现它广泛存在于人体组织和体液中,并与肿瘤的生长、肿瘤细胞的脱落和转移存在密切的关系。     

Cloning of Integral Mature Peptide Gene of Human GDF-5

The integral mature peptide gene of human growth differentiation factor-5 (GDF-5) was出人物cloned to provide the essential foundation for study on the biological characteristics of GDF-5 at gene and protein levels. Two primers were chemosynthesized according to the hGDF-5 sequence reported in Genbank. The hGDF-5 gene was gained by RT-PCR methods from the total RNA extracted from human fetus cartilage tissue, and was cloned into vector pMD18-T. The sequence of recombinant plasmid pMD18-T-hGDF-5 was analyzed by sequence analysis. DNA agarose gel electrophoresis showed that the product of RT-PCR was about 380bp, and double enzyme digestion of the recombinant plasmid corresponded with it. The result of sequence assay was in agreement with the reported hGDF-5 sequence in Genbank. Our results showed that the integral mature peptide gene of human GDF-5 was cloned successfully from human fetal cartilage tissue, and totally identified with the seouence of human GDF-5 in Genhank.     

梅花鹿两个管家基因部分 cDNA序列的克隆

目的 :开发吉林双阳梅花鹿的基因资源 ,在分子水平上揭示鹿药材的药理作用。方法 :从鹿脾脏细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA,构建 c DNA质粒文库 ,从中克隆 2个管家基因并进行序列分析。结果 :成功克隆的管家基因的一个核酸序列及其对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠蛋白酶体 α3型亚单位 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源 ;另一个管家基因的序列及对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠转录激活因子 - 4部分 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源。结论 :新发现的双阳梅花鹿蛋白酶体α3型亚单位部分 c DNA序列和转录激活因子 - 4部分c DNA序列 ,已在 Genbank中登录 ( BG67371 3,BG67371 4 )。     

人抵抗素基因cDNA的克隆

目的克隆人抵抗素基因(hRETN)cDNA,为进一步研究RETN的结构和功能提供实验基础.方法应用RT-PCR方法从中国人网膜脂肪垫总RNA中扩增出RETN 基因cDNA,克隆入载体pMD18-T中,形成重组载体pMD18-T/hRETN.通过蓝白斑筛选出阳性克隆,限制性内切酶酶切鉴定后对其进行测序.结果从脂肪组织总RNA中扩增得到363 bp片段hRETN基因,其cDNA序列与Genbank hRETN基因序列基本相同.结论成功地克隆中国人hRETN cDNA.     

中国人Canstatin基因的克隆

目的Canstatin是新近发现的血管生成抑制剂,具有很强的抑制肿瘤血管生成的功能,本研究拟克隆和鉴定中国人的Canstatin基因,为进一步研究Canstatm基因的功能奠定基础.方法用RT-PCT法从中国人肝组织中获得Canstatin的cD-NA,克隆到pCMV-Script载体中测序,并在GenBank中进行同源性分析.结果成功克隆了Canstatin基因cDNA编码序列并获得测序证实.结论中国人Canstatin基因编码序列,经同源性分析与国外文献报道序列一致,初步证明该基因可能属于人类基因中序列保守的基因.     

细粒棘球蚴中国大陆株线粒体苹果酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基因片段，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选基因奠定基础。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴mMDH（线粒体苹果酸脱氢酶）基因的已知序列设计一对引物，采用RT—PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏mMDH基因。将PCR产物纯化后，亚克隆到pGEM—T载体并构建成基因工程菌株后进行序列测定和分析。结果 用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中囤大陆株mMDH基因，测序表明该基因开放阅读框为1017bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％，理论蛋白编码的氩基酸序列同源性为99％。结论 在国内首次获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基囚序列，为进一步构建重组表达基因工程菌株打下良好的基础。     

人脂联素基因全长cDNA克隆

目的克隆人脂联素(ADPN)基因cDNA,为进一步研究ADPN的功能提供实验基础.方法应用RT-PCR方法从中国人大网膜脂肪垫总RNA中扩增出ADPN cDNA全长基因,克隆入载体pMD18-T中,形成重组载体pMD18-T/人 ADPN.筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定后对其进行测序.结果从脂肪组织总RNA中扩增得到745bp片段ADPN基因,其cDNA序列与GenBank人ADPN基因序列相同.结论成功地克隆ADPN基因全长cDNA.     

吉林双阳梅花鹿核蛋白体蛋白L27 cDNA的克隆

目的 为了开发我国珍稀动物——吉林双阳梅花鹿的基因资源，在分子水平上揭示鹿药材的药理作用。方法 构建了梅花鹿脾脏细胞cDNA质粒文库，克隆了一些看家基因并进行了序列分析。结果 其中的一个序列在核酸及推导的氨基酸序列水平上与编码人、犬、大鼠、小鼠核蛋白体蛋白L27(ribosomal protein L27)cDNA序列和对应的氨基酸序列高度同源，并具有完整的开放阅读框架(ORF)。结论 发现了双阳梅花鹿核蛋白体蛋白L27全长cDNA序列，此序列已经在(Genbank中登录，登录号为：AF373231。     

细粒棘球蚴中国大陆株zw-5基因的克隆和生物信息学分析

目的获得细粒棘球蚴zw-5基因序列,进行序列分析,为研究包虫病疫苗候选基因作好前期工作。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据国外细粒棘球蚴Eg-CWGRS-12D11基因的已知序列设计一对引物,采用RT—PCR技术扩增,将PCR产物纯化后,将其克隆到pGEM—T载体后进行序列测定以及生物信息学分析。结果用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株zw-5基因,测序表明该基因开放阅读框为624bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99％。结论在国内首次获得细粒棘球蚴zw-5基因序列,对进一步研究其结构和功能以及包虫病的防治具有重要意义。     

人腺体激肽释放酶基因重组表达载体pPICZαChK2的构建

目的：构建人腺体激肽释放酶（hK2）基因的酵母表达载体。 方法：利用RT-PCR法从人正常前列腺组织中扩增出hK2基因,先将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析,然后将hK2基因亚克隆至酵母pPICZαC表达载体上,进行鉴定。 结果：获得一个核苷酸长度为738 bp的基因,同源比较结果表明,与GenBank（NCBI:AF188746）公布的hK2的基因序列有99%的同源性,序列分析表明有一个氨基酸出现变异。酶切表明hK2基因正确插入酵母表达载体pPICZαC。 结论：成功构建出hK2基因的酵母表达载体pPICZαChK2。