肿瘤抗原致敏树突状细胞诱导机体产生抗肿瘤作用的实验研究

目的：探讨肿瘤抗原冲击致敏的树突状细胞（Dc）诱导机体产生的特异性抗肿瘤作用。方法：体外培养的小鼠骨髓树突状细胞用小鼠结肠腺癌细胞株CT26细胞抗原冲击致敏；混合淋巴细胞反应检测肿瘤抗原致敏DC刺激同基因型T淋巴细胞增殖的能力；观察小鼠经皮下免疫肿瘤抗原致敏DC后诱导产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抵抗CT26细胞再攻击的能力。结果：肿瘤抗原致敏DC能有效刺激同基因型T淋巴细胞增殖反应；小鼠经肿瘤抗原致敏DC免疫后可诱导强烈的CT[，杀瘤活性，产生免疫保护作用，能有效抵抗CT26细胞再攻击，肿瘤生长明显减缓，与未经抗原致敏DC免疫的小鼠组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：肿瘤抗原致敏的DC能有效诱导机体产生特异性的抗肿瘤作用。     

转染pcDNA3-hCEA的人树突状细胞对MGC803细胞的作用

目的：观察转染含人癌胚抗原（CEA）真核表达质粒pcDNA3-hCEA的人树突状细胞（DC）对胃癌细胞MGC803的抑制作用.方法：采用细胞因子rhIL-4和rhGM-CSF诱导培养法制备人外周血DC并用Lipofectamine向人DC转染pcDNA3-hCEA.RT-PCR检测转染细胞hCEA的表达,观察DC-hCEA细胞诱导的致敏的T淋巴细胞（CTL）对胃癌细胞MGC803的杀伤效应.结果：DC-hCEA诱导的CTL对胃癌细胞MGC803的杀伤效应强于DC（P＜0.05）.结论：编码CEA基因的真核表达质粒转染的人DC能够诱导较强的特异性抗肿瘤免疫效应.     

荷瘤小鼠骨髓来源树突状细胞诱导的抗肿瘤作用

目的:探讨能否从荷瘤小鼠骨髓细胞诱导出功能正常、具有抗肿瘤作用的树突状细胞(DC),与正常小鼠骨髓来源的DC比较有无差异。方法:于体外用mGM-CSF和mIL-4分别从正常小鼠和CT26结肠腺瘤小鼠的骨髓细胞诱导DC,并用CT26肿瘤细胞抗原冲击致敏。用相差显微镜观察DC的形态学变化;流式细胞术检测CT26肿瘤细胞抗原致敏前后DC表面分子变化;3H-TdR掺入法检测肿瘤抗原致敏DC刺激T细胞增殖的能力;乳酸脱氢酶(LDH)4 h释放法检测肿瘤抗原致敏DC诱导同基因T细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤活性。结果:荷瘤小鼠骨髓来源DC与正常小鼠骨髓来源DC的Ia-Kd、H-2Kd、CD80、CD86I、CAM-1表达水平和它们刺激T细胞增殖的能力以及所诱导产生的CTL杀伤活性均无显著性差异。结论:荷瘤小鼠骨髓来源的DC与正常小鼠骨髓来源的DC具有相似的功能和抗肿瘤作用,提示可以从荷瘤机体的DC前体诱导出具有抗肿瘤作用的DC用于肿瘤的免疫治疗。     

负载肿瘤抗原的树突状细胞疫苗诱导CTL的抗肿瘤效应

目的:探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外杀瘤作用及对荷瘤小鼠的治疗作用.方法:体外培养的小鼠骨髓树突状细胞用小鼠结肠腺癌细胞株CT26细胞抗原冲击致敏制备负载肿瘤抗原的DC疫苗;负载肿瘤抗原的DC疫苗激活同源T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),采用乳酸脱氢酶(LDH) 4 h释放法检测CTL在体外对CT26细胞的杀伤活性;建立CT26荷瘤小鼠模型,应用CTL治疗荷瘤小鼠,观察肿瘤大小和小鼠存活期.结果:负载CT26肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导T细胞增殖分化为肿瘤特异CTL,该CTL对CT26细胞有高效而强烈的杀伤作用,杀伤率为(83.95±11.25)%,而对B16细胞、3LL Lewis 细胞无明显杀伤作用,杀伤率分别为(12.75±5.36)%和(11.38±4.57)%.应用CTL治疗荷瘤小鼠能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠存活期.结论:负载肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导高效而特异的CTL杀瘤活性并能治疗荷瘤小鼠.提示负载肿瘤抗原的DC疫苗诱导的CTL可能在肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用.     

趋化因子CXCL10与肿瘤细胞RNA修饰树突状细胞抗前列腺癌研究

目的探讨肿瘤细胞RNA和趋化因子CXCL10基因共同修饰的树突状细胞(DC)瘤苗对小鼠抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法将小鼠RM 1前列腺癌细胞RNA加载小鼠骨髓来源的DC后,通过脂质体转染法将CXCL10基因导入DC,制备前列腺癌瘤苗;体内外实验检测该瘤苗诱导的抗前列腺癌免疫治疗作用。结果转染CXCL10基因的DC上清对淋巴细胞有较强的趋化作用;DC瘤苗所诱导的特异性效应细胞(CTL)对RM 1细胞具有特异性杀伤作用;经DC瘤苗治疗的荷瘤小鼠模型瘤体生长减慢,存活期延长;该瘤苗还具有明显的免疫保护作用。结论构建的前列腺癌DC瘤苗能够有效诱导抗肿瘤免疫反应和免疫保护功能。     

转染pcDNA3-hCEA的人树突状细胞抑制MGC803裸鼠移植瘤的生长

目的:探讨转染癌胚抗原基因pcDNA3-hCEA的人树突状细胞(DC)对胃癌细胞MGC803裸鼠移植瘤生长的影响. 方法:采用细胞因子rhIL-4和rhGM-CSF诱导培养法制备人外周血DC,并用Lipofectine向人DC转染pcDNA3-hCEA. RT-PCR检测转染人CEA真核表达质粒的表达. 使用DC(pcDNA3-hCEA)疫苗体外诱导人T淋巴细胞靶向性杀伤反应,并在体内实验中观察DC(pcDNA3-hCEA)对MGC803在裸鼠上致瘤性的影响. 结果:针对特定引物DC(pcDNA3-hCEA)在588 bp处有CEA片段的表达;DC(pcDNA3-hCEA)能够诱导的人T淋巴细胞靶向性杀伤活性(%),在效靶比分别为10∶ 1,20∶ 1,40∶ 1时的结果为19.4±3.8, 24.7±3.7, 38.1±5.4;DC(pcDNA3-hCEA)能显著抑制MGC803的生长,其肿瘤生成日期较对照组延长(中位数10 d vs 6 d, n=5),瘤体生长速度较对照组缓慢,d 23瘤体体积明显小于对照组[(0.24±0.10) cm3 vs (0.65±0.17) cm3, (1.36±0.42) cm3, n=5, P<0.05]. 结论:转染pcDNA3-hCEA的人DC能有效抑制MGC803在裸鼠体内的生长.     

人胃癌细胞RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的：观察人胃癌细胞株RNA转染的树突状细胞（DC）所诱导的行异性抗肿瘤免疫效应，探讨肿瘤细胞RNA直接转染DC进行胃癌生物治疗的可能性。方法：胃癌细胞株AGS体外培养，提取RNA；正常人外周血，进行体外DC的培养扩增；胃癌RNA直接转染DC，MTT法检测胃癌RNA活化DC所诱生的淋巴细胞对胃癌AGS、视网膜母细胞瘤SoRb-70的体外杀伤效应。结果：正常人外周血来源的DC，经胃癌AGS细胞株RNA直接转染后，成功诱导特异性抗肿瘤免疫反应，AGS RNA组CTL在靶效比为20：1时对AGS、SoRb-70的杀伤率分别为84．54％、1．53％，而对照组对这两种细胞的杀伤率分别为1．34％和1．70％。结论：肿瘤RNA转染DC可以诱导特异性抗肿瘤免疫，是一种有前景的胃癌治疗手段，有进一步研究的价值。     

白细胞介素-23基因修饰树突细胞获取凋亡癌细胞抗原诱导的抗胰腺癌免疫治疗

目的 探讨白细胞介素23（IL-23）基因转染的树突状细胞（DC）负载凋亡癌细胞抗原后诱导的免疫应答对小鼠胰腺癌的治疗作用。方法 克隆并构建IL-23基因真核双表达载体,转染DC后检测其表型及自分泌IL-23和IL-12的能力;观察各组脾脏T淋巴细胞γ干扰素（IFN-γ）和IL4的分泌量以及DC诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对胰腺癌细胞的杀伤作用。转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗对小鼠抗肿瘤的免疫保护作用和肿瘤抑制作用。结果基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功,转染后DC对共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强;DC自分泌IL-23和IL-12的能力显著增强。DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Th1细胞的产生,IL-23转染组每24hIFN-γ的分泌（最高为535pg／ml／10^6）与其他各组比较（对照组每24h为60pg／ml／10^6）,P〈0．01;转染的DC疫苗在体内诱导出高水平的CTL活性（P〈0．05）。接种IL-23修饰DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强;对肿瘤的生长有明显抑制作用,治疗组荷瘤鼠生存期与其他各组比较差异有显著意义。结论IL-23使DC抗原递呈能力更强,IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的CTL免疫应答,使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力。     

SOCS1受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞（BMDC），体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原，并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸（AS1）处理DC，制备负载肝癌抗原DC疫苗；流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度；通过体外细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下，疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高（P〈0．01），能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力（P〈0．01）。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度，并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

腺病毒载体转导GM—CSF基因制备肿瘤疫苗对小鼠肿瘤模型预防及治疗的实验性研究

目的：评价重组腺病毒载体转导粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）、γ－干扰素（IFN－γ）、单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因所制备的肿瘤疫苗对同源性小鼠肿瘤模型的预防和治疗功效。方法：巨细胞病毒（CMV）起动子、特定的细胞因子cDNA片段和SV40多聚腺苷信号组成细胞因子基因表达载体，通过基因重组产生重组腺病毒（Adv/GM-CSF、Adv/IFN-γ、Adv/MCP-1）。重组腺病毒直接人肾胚胎细胞系293细胞，选择最佳感染滴度，以不同的效靶比转染不同的肿瘤细胞系CT26、RENCA和BALB／3T3纤维母细胞，经照射灭活后制备不同的肿瘤疫苗，用于各种肿瘤模型。结果：表明经基因转导后的肿瘤细胞以及照射灭活经基因转导后的肿瘤细胞可以分泌转导的细胞因子。接种经照射灭活的转导GM－CSF结肠癌细胞系CT26后，90％的同源性小鼠对原代CT26细胞的攻击起到了保护作用，而接种转导IFN-γ和MCP－1基因制备的肿瘤疫苗对小鼠经原代CT26细胞的攻击未有保护作用。同源性小鼠接种分泌GM－CSF的肿瘤疫苗后，对CT26原代细胞的多次 攻击在整个观察期间未见肿瘤生长。接种分泌GM－CSF的肿瘤疫勒后机体长期、特异性的抗肿瘤免疫的建立需要GM－CSF及肿瘤抗原在接种部位的同时存在，CD8T细胞亚群的缺失，明显阻断了分泌GM－CSF肿瘤疫苗的功效。皮下注射分泌的GM－CSF肿瘤疫苗能够有效地阻止预先植入小鼠体内小负荷肿瘤细胞的生长，同时也可以有效的阻止接种前7天或后3天静脉内注射原代CT26瘤细胞在肺内转移灶的生长。结论：在本研究实验性肿瘤模型中，皮下注射重组病毒载体转导GM－CSF基因制备的肿瘤疫苗不仅能够有效地预防皮下接种原代CT26肿瘤细胞的生长而且也可消除原有的肿瘤病灶及转移瘤灶，使机体建立了长期、特异性的抗肿瘤免疫反应。     

小鼠AFP/DC疫苗体外免疫活性检测及对小鼠皮下移植瘤抑制作用

目的将已构建的Balb/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突状细胞(DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用和对小鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法脂质体转染PcDNA3.1( )/AFP1、PcDNA3.1( )/AFP2至DCs细胞进行表达、鉴定,将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,MTT比色法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤肝癌细胞的活性。随后建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型,用AFP1/DCs和AFP2/DCs进行皮下注射,观察其对Balb/c小鼠皮下移植瘤的抑制作用;观察各组治疗后皮下移植瘤的体积的大小,治疗组小鼠的存活期,取瘤组织行免疫组化观察Bax凋亡基因的表达情况,观察另一半荷瘤小鼠的生存时间。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1( /-)/AFP1和pcD-NA3.1( /-)/AFP2在小鼠树突状细胞中获得稳定高效表达,AFP2/DCs明显刺激T淋巴细胞的增殖及提高CTL的特异性杀伤作用,AFP1/DCs和AFP2/DCs皮下注射可显著抑制肝癌H22细胞移植瘤的生长,以AFP2/DCs的效果更明显,治疗2周后AFP2/DCs组小鼠的肿瘤体积(726.7±298.2)mm3明显小于AFP1/DCs组的肿瘤体积(1486.2±457.2)mm3和空质粒对照组的肿瘤体积(2137±547.2)mm3,两组间有统计学差异(P<0.05),AFP2/DCs治疗组、AFP1/DCs治疗组的抑瘤率可达79.2%和39.7%,空质粒对照组和生理盐水对照组的抑瘤率为0;AFP2/DCs治疗组、AFP1/DCs治疗组的小鼠存活期分别为(54.5±4.2)d、(40.2±4.8)d,较空质粒对照组(30.6±6.2)d显著延长。AFP2/DCs治疗组移植瘤组织中Bax阳性细胞的百分率为92%,显著高于AFP1/DCs组(64%)和pcDNA/DCs(21%)和生理盐水组(23%),两组间差异有显著性(P<0.05)。结论成功地构建了真核表达载体PcDNA3.1( )/AFP1和PcDNA3.1( )/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA真核表达载体转染的小鼠树突状细胞,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应。其机制可能与诱导肝癌细胞凋亡有关。     

RT-PCR检测癌胚抗原基因转染树突状细胞的表达

目的 :通过向人DCs转染含人CEA真核表达质粒 ,使DCs特异性的表达和提呈CEA。方法 :RT -PCR检测转染人CEA真核表达质粒DCs的表达。结果 :转染CEA质粒的DCs,RT -PCR检测有一特异性扩增带。结论 :用脂质体能成功将人CEA真核表达质粒转入DCs并表达     

细胞因子IL-18基因对Ag85A DNA疫苗诱导产生抗体水平的影响

目的 :研究表达含白介素 (IL) 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (MTB)H37Rv Ag85A基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将分别表达人IL 18基因的真核表达质粒pcIL18与MTBpcAg85A基因疫苗联合肌注免疫BALB c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。每次免疫后 2周采血 ,分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗Ag85A抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBCs的RNA中扩增IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。联合应用pcIL18,三次免疫后血清抗Ag85A抗体的滴度明显较单独应用pcAg85A增高。结论 :pcIL18与pcAg85A基因疫苗联合免疫 ,可显著增强Ag85A抗原的特异性体液免疫应答。pcIL18+pcAg85A基因联合免疫是否具有增强Ag85A抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。     

小鼠脾来源树突状细胞与NS_1骨髓瘤细胞融合体的抗肿瘤作用

目的：观察ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾来源树突状细胞（ｓｐｌｅｅｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｓ,ｓＤＣ）与肿瘤细胞融合体的抗肿瘤效应。方法：以灭活的ＮＳ１细胞免疫活化ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取其ｓＤＣ与ＮＳ１骨髓瘤细胞融合,并筛选出融合细胞;用此融合细胞作为瘤苗,免疫治疗皮下荷ＮＳ１瘤的小鼠２次,间隔１周。结果：融合细胞瘤苗本身无致瘤性。用融合细胞瘤苗免疫治疗荷瘤小鼠后,其瘤体消失,且在观察期６０ｄ内未见肿瘤转移和复发。结论：脾来源树突状细胞与ＮＳ１细胞融合瘤苗免疫荷瘤小鼠后,激发其体内存在的抗ＮＳ１肿瘤效应。     

以CpG为佐剂的犬细小病毒基因疫苗的初步研究

目的研制犬细小病毒(CPV)基因疫苗。方法以CPV VP2基因为基因免疫的目的基因,以pcDNA3和pcDNAK质粒为基因免疫的载体,以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的免疫刺激序列为免疫佐剂,构建重组质粒并免疫BALB/c小鼠和毕格犬。结果经pcDNA3-VP2C1(含1个拷贝CpG基序)基因免疫的BALB/c小鼠能产生抗CPV血凝抑制抗体;对于经CPV灭活苗初次免疫的毕格犬,用pcDNAK-VP2C2(含2个拷贝CpG基序)质粒免疫产生的再次免疫应答优于pcDNA3-VP2C1。结论VP2基因、pcDNAK和犬源CpG可用于CPV基因疫苗的进一步研究。     

融合基因GM-CSF/IL-2转基因瘤苗在肝癌特异性免疫治疗中的应用

目的 制备人白细胞介素2(hIL-2)与鼠粒-单核细胞集落刺激因子(mGM-CSF)融合基因修饰的H22肝癌全细胞瘤苗,探索融合基因GM.CSF/IL-2转基因瘤苗,在肝癌主动免疫治疗中特异性抗肿瘤作用.方法 用含hlL-2与mGM-CSF融合基因的真核表达载体在体外转染H22肝癌细胞,制成疫苗,皮下接种Balb/c小鼠,同时建立Balb/c小鼠荷瘤模型,ELISA法检测H22/pcDNA3.1( ).GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(分别接种H22/pcDNA3.1( )瘤苗、H22瘤苗、PBS)血清中IL-10、IFN- γ水平,观察小鼠存活期;同时用51Cγ释放法测定H22/pcDNA3.1( )-GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(单纯荷瘤组、正常组)脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤活性.结果 成功制备了含有hIL2与mGM-CSF融合基因的H22肝癌瘤苗,转基因瘤苗免疫组小鼠的脾细胞在体外对亲本H22肝癌细胞的杀伤率为38.3%,显著高于对照组小鼠的脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤率(分别为13.6%和7.5%),也高于其对S180细胞的杀伤率(9.1%)(P＜0.05).转基因瘤苗免疫组小鼠血清IFN-γ较对照组明显升高(P＜0.01),血清IL-10较对照组明显降低(P＜0.01).同时,转基因瘤苗免疫组小鼠生存期亦有明显延长.结论 转染hIL-2与mGM-CSF融合基因的同系肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应,延长荷瘤小鼠生存期.