人canstatin基因的克隆及其真核载体的构建

[目的]克隆人canstatin基因,构建并鉴定其真核表达载体pSecTag2/canstatin.[方法]采用RT-PCR方法从中国人胎盘脐带组织中扩增canstatin cDNA,T-A克隆到pUCm-T载体中,酶切后将人canstatin cDNA亚克隆入pSecTag2,构建真核表达载体pSecTag2/canstatin,重组质粒经限制性内切酶鉴定并进行测序分析.[结果]人canstatin基因片断正确插入载体,与Genebank中报道的序列一致.[结论]pSecTag2/canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达、活性鉴定和作用机制研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础.     

胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位研究

目的：研究胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位。方法：采用聚合酶链反应（PCR）技术,从pGEM—T质粒上选择性扩增出包含完整ORF在内的人胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,将目的片段两端分别引入限制性内切酶PstI和BamHI识别位点,克隆至真核表达载体pEGFP-N1。将测序正确的阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213采用脂质体瞬时转染COS-7细胞,激光共聚焦技术检测GCRG213基因在真核细胞内的蛋白定位。结果：经测序证实,GCRG213正确克隆入真核表达载体pEGFP—N1,组成阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213。测序正确的pEGFP-N1～GCRG213重组子经脂质体转染COS-7细胞,激光共聚焦显微镜观察GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。结论：GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。     

RT-PCR构建人甲胎蛋白全长基因真核表达载体

目的采用反转录PCR(RT—PCR)构建人甲胎蛋白(Alpha—Fetoprotein，AFP)全长基因真核表达载体，为下一步应用以AFP蛋白为靶点的基因治疗作准备。方法体外培养人肝癌细胞HepG2，Trizol裂解细胞，提取总mRNA。设计含有特定酶切位点BglⅡ，SalⅠ和真核启动元件Kozak序列的RT—PCT正反向引物，采用RT—PCR法克隆AFP全长cDNA，使用BglⅡ SalⅠ双酶切载体pEGFP—C3载体和AFP cDNA，将AFP cDNA连接载体pEGFP—C3，构建新的真核表达载体，命名为pEGFP—AFP。结果通过测序证明pEGFP—AFP真核表达载体含有AFP全长基因：结论：本研究成功构建人甲胎蛋白基因真核表达载体pEGFP—AFP，为进一步的分子试验和基因治疗打下了基础。     

人LY6D基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人LY6D真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达和定位。方法:提取HEK293T细胞的mRNA，反转录为cDNA。PCR扩增LY6D基因的CDS序列，并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定，并转染到工具细胞HEK293T中，提取细胞总蛋白进行Western blot检测。然后利用激光扫描共聚焦显微镜观察LY6D在HEK293T细胞内的定位，最后Q-PCR检测过表达LY6D真核表达载体影响EMT关键基因的表达。结果:LY6D基因cDNA的编码区序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中，酶切鉴定片断为387 bp，并进一步测序成功。Western blot检测到了pEGFP-LY6D融合蛋白的表达，分子量约为41 kDa。pEGFP-LY6D融合蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。过表达LY6D真核表达载体减少E-cadherin的表达。结论:成功构建了LY6D基因cDNA的CDS序列的真核表达载体，pEGFP-LY6D蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质，LY6D过表达可以降低E-cadherin的表达。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

靶向遗传印记基因PEG10 的siRNA 真核表达载体的构建及鉴定

 目的 构建并鉴定针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体。方法 根据PEG10基因cDNA序列，设计针对目的基因的4个siRNA靶序列，将其插入H1启动子下游，克隆到真核表达载体psiRNA-hHlneo中，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论 本研究成功构建针对PEG10的真核表达载体，可能成为肝癌基因治疗中的一种新型、高效的治疗载体。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

sFv及重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的 :构建pEGFP sFv rhTNF α表达载体 ,观察其在成骨肉瘤细胞 990 1中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM T Easy测序后 ,以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv rhTNF α ,并将其亚克隆至pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,成功构建表达载体pEGFP sFv rhTNF α ,并在该载体转染人成骨肉瘤细胞 990 1后观察融合蛋白表达情况。结果 :酶切鉴定证实sFv rhTNF α融合基因片段已克隆到pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,并在转染人成骨肉瘤细胞 990 1中观察到sFv rhTNF α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论 :pEGFP sFv rhTNF α表达载体便于观察转染细胞中sFv rhTNF α融合蛋白的表达情况及蛋白定位 ,为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

细胞周期蛋白C基因克隆与重组质粒pCMV-tag2B-CCNC的构建与鉴定

[目的]克隆人细胞周期蛋白C基因（human cvclin C，CCNC），构建真核表达载体，诱导并鉴定其表达。[方法]利用逆转录多聚酶链反应mT-PCR）法，以急性淋巴细胞性白血病细胞株6T-CEMmRNA为模板，扩增CCNC基因，将克隆获得的CCNC全长cDNA片段构建重组表达载体pCMV-tag 2B—CCNC，用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染至6T-CEM细胞系，诱导其表达，Western Blot鉴定其表达。[结果]电泳获得944bp预期序列，pCMV-tag2B—CCNC经双酶切鉴定及序列分析证实为正确的有完整读码框的CCNC基因，将pCMv-tag2B_Sorcin导入6T-CEM细胞并成功表达，目的蛋白经Western blot鉴定具有生物学活性。[结论]经测序及酶切鉴定，成功克隆了CCNC的cDNA，并成功构建了CCNC真核表达质粒pCMV-tag2B—CCNC，重组质粒能表达具有生物学活性的CCNC蛋白，为研究CCNC的功能打下了基础．     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，构建真核表达载体，本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因，并与pcDNA3．1定向连接，构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3．1-CD，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。结果克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了真核表达载体，经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性。结论 pcDNA3．1-CD真核表达载体构建成功。     

pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体的构建及其对人鼻咽癌细胞增殖的影响

目的：构建 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体并观察其对鼻咽癌细胞株 CNE1体外增殖的影响。方法：提取 CNE1细胞中总 RNA,RT －PCR 扩增 NPRL2并克隆至 pEGFP －N1载体,鉴定出阳性克隆送测序,以重组质粒转染 CNE1细胞。通过 Western blot 检测转染细胞中 NPRL2蛋白的表达,CCK －8法检测细胞增殖的变化。结果：成功构建了 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体,Western blot 法检测到 NPRL2蛋白的表达, CCK －8法检测发现 NPRL2能够明显抑制肿瘤细胞增殖（P ＜0．05）。结论：成功构建 pEGFP －N1－NPRL2真核表达载体并转染至 CNE1细胞,NPRL2可抑制肿瘤细胞的增殖。     

重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定

目的: 克隆并表达canstatin基因，初步检测其抑制血管生成的活性。方法: 采用RTPCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA，克隆入pMD18T载体中，并测序鉴定。在QIA表达系统中表达，Ni柱亲和层析纯化。进行生物学活性鉴定。结果: 经序列分析所获684 bp人canstatin基因与报道一致，重组进pQE30表达载体，IPTG诱导表达并纯化成功，表达产物能明显抑制血管生成。结论: 成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达。纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）实验中具有明显抑制血管生成活性     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株HCT-116中的表达

 目的　构建并鉴定含有APC蛋白不同功能区域的真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5,转染人类结直肠癌细胞HCT-116,观察重组质粒在细胞内的表达。方法　根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,设计特异性引物扩增APC基因特异性的功能区域片段。将扩增出的5个APC片段克隆到pEGFP-N3载体的N端,经测序分析对重组质粒pEGFP-N3-APC1～5进行鉴定。使用脂质体转染法将重组质粒转染人类结直肠癌细胞HCT-116,通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测APC功能区域在细胞内的表达。以RT-PCR法进一步验证重组质粒在细胞中的表达。结果　构建5个pEGFP-N3-APC结构区域的重组真核表达载体,重组真核表达载体转染HCT-116细胞后,细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,5个重组质粒在HCT-116细胞中均可表达。结论　真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能,筛选结直肠癌基因治疗的有效且易于基因操作的靶标片段提供了基础。础。     

突变型自杀基因HSV1-sr39tk真核表达载体的构建与鉴定

 目的 克隆突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV1-sr39tk并构建其真核表达载体。方法 通过PCR扩增HSV1-sr39tk基因,用BamHⅠ和BglⅡ双酶切纯化的PCR产物,在T4DNA连接酶作用下于室温将其连接于经BamHⅠ单酶切的慢病毒载体转移质粒pTK151上,重组质粒经PstⅠ酶切及测序鉴定。结果 阳性重组质粒酶切及测序鉴定与预期结果完全相符。结论 成功克隆出突变型自杀基因HSV1-sr39tk,并成功构建其真核表达载体。     

小鼠Ras激酶抑制剂(KSR)基因氨基端和羧基端真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

背量与目的已有的实验证据表明，Ras激酶抑制剂（kinase suppressor of Ras，KSR）的功能主要是作为一个支架蛋白组装MAPK及其上游调控子形成多蛋白的复合体。但KSR是否存在激酶活性，一直是争论的焦点。本研究的目的是构建小鼠KSR基因氨基端（N-KSR）和羧基端（C-KSR）的真核表达载体，并观察其在293T细胞中的表达。方法通过PCR方法扩增N-KSR和C-KSR目的片段，利用基因重组技术构建pCMV-Tag2b-N－KSR和pCMV-Tag2b-C－KSR真核表达载体，并进行酶切和测序鉴定。鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞，通过Western blot方法检测目的蛋白的表达。结果通过酶切和测序鉴定，pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表达载体序列正确，编码框正确。转染后的293T细胞经Western blot检测，能够表达目的蛋白。结论成功构建了pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表达载体并可在293T细胞中表达，为以后的研究奠定了基础。