小鼠成牙本质样细胞的原代培养及鉴定

目的:原代培养小鼠成牙本质细胞,为诱导胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质细胞分化提供基础。方法:取材于出生1周昆明小鼠的下颌切牙牙胚,分离牙乳头组织,采用消化法对小鼠牙乳头细胞进行分离培养;用细胞平板克隆技术,挑选具有成牙本质细胞形态特征的细胞克隆,扩大培养;并从光镜观察、电镜观察和小鼠牙本质涎磷蛋白(dentinsialophoprotein,DSPP)在mRNA水平上的表达等方面进行鉴定。结果:培养细胞胞质丰富,形态呈梭形,具有较长的细胞突起。超微结构观察,细胞富含高尔基复合体、核糖体和粗面内质网,并特异性表达DSPPmRNA。结论:该研究成功培养出小鼠成牙本质样细胞,该方法可用于成牙本质细胞的体外研究。     

人成牙本质细胞L型钙离子通道特异性基因片段的克隆研究

目的:克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段.方法:选取新鲜拔除的健康恒牙,利用牙科专用慢速切锯制备牙齿切片,采用酶消化法分离出完整的人成牙本质细胞,利用RT-PCR技术直接从人成牙本质细胞中克隆L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段,将其亚克隆入pGM-T载体进行序列测定.结果:从人成牙本质细胞中获得452bp的特异性片段.序列分析表明,其与GenBank中已登录的人L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因序列一致.结论:成功地从人成牙本质细胞中克隆到人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因序列片段.     

颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向诱导分化

外胚间充质细胞具有多向分化潜能。它可以进一步分化为成牙本质细胞等多种细胞,并将形成上下颌骨、颞下颌关节盘软骨、牙本质、牙髓、牙骨质、牙周韧带、听神经等组织器官。该细胞在牙齿发育和牙体牙髓损伤修复过程中起重要作用。本文从外胚间充质细胞的起源和特性、颌突外胚间充质细胞的分离和体外培养、外胚间充质细胞的定向诱导分化、外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向误导分化、诱导分化的成牙本质细胞的鉴定等方面进行了综述。     

人牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中miRNAs表达谱筛选及鉴定

目的:筛选人牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中差异表达的microRNAs(miRNAs)并进行初步鉴定。方法:体外分离、培养和鉴定人牙髓干细胞,miRNAs芯片筛选牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中差异表达的miRNAs,并通过TargetScan数据库预测靶基因,实时定量PCR法对结果进行初步鉴定。结果:人牙髓干细胞vimentin、nestin、GFAP和I型胶原4种细胞表型均表达;成脂诱导3周后细胞内有油红O染色阳性脂滴出现;成牙本质诱导可见钙结节形成;基因芯片结果显示,牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中,发生2倍以上表达变化的miRNAs有6条,其中上调3条,下调3条。通过miRNA靶标预测工具预测靶基因,发现hsa-miR-633和hsa-miR-210有与牙髓干细胞分化相关的靶基因;real time-PCR验证hsa-miR-633和hsa-miR-210表达变化与基因芯片结果相符。结论:人牙髓干细胞经诱导向成牙本质细胞分化过程中miRNAs表达谱具有显著变化,为牙髓干细胞分化机制研究提供了新的提示。     

颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向诱导分化

外胚间充质细胞具有多向分化潜能．它可以进一步分化为成牙本质细胞等多种细胞。并将形成上下颌骨、最下颌关节盘软骨、牙本质、牙髓、牙骨质、牙周韧带、听神经等组织器官。该细胞在牙齿发育和牙体牙髓损伤修复过程中起重要作甩。本文从外胚间充质细胞的起源和特性、颌突外胚间充质细胞的分离和体外培养、外胚间充质细胞的定向诱导分化、外胚间充质细胞向成牙本质细胞的定向诱导分化、诱导分化的成牙本质细胞的鉴定等方面进行了综述。     

成人成牙本质细胞原位培养的初步研究

目的:建立成人成牙本质细胞原位培养模型。方法:取20～30岁成人新鲜、健康、完整的第三磨牙30颗,随机分为拔髓实验组、有血清培养组和无血清培养组,每组各10颗。冠根分离,拔髓,将成牙本质细胞保留在牙冠上,进行有血清和无血清的原位培养,每天换液,连续培养7d。通过光镜检测细胞保留情况,扫描电镜检测细胞形态和分布特征,台盼蓝检测细胞活性,对模型进行鉴定。结果:室温拔髓后,成牙本质细胞保留在髓室壁上,在7d的培养过程中细胞有活性,形态保持良好。结论:采用有血清和无血清培养,均可建立成人成牙本质细胞培养模型。     

人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的蛋白质组学研究

目的 采用蛋白质组学方法分析人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞蛋白表达谱的改变,揭示特征蛋白在分化过程中所起的作用.方法对人牙髓细胞进行矿化诱导,提取诱导前后细胞总蛋白,双向电泳分离蛋白质,DeCyder V6.0软件确定差异蛋白点,质谱鉴定差异蛋白质.结果双向电泳确认46个差异蛋白质斑点,质谱鉴定20个蛋白斑点,差异蛋白质涉及细胞周期调节、能量代谢、信号传导等细胞生物学过程.结论蛋白质组学技术可高通量筛选与人牙髓细胞向成牙本质细胞分化相关的功能蛋白.     

PHEX蛋白在小鼠成牙本质细胞分化过程中的定量表达

目的:探讨PHEX在小鼠成牙本质细胞分化过程中的定量表达及其可能的生物学作用.方法:制备小鼠牙胚发育各阶段标本,免疫组织化学方法检测PHEX蛋白在小鼠磨牙牙胚发育各时期成牙本质细胞中的表达情况.对成牙本质细胞中的阳性信号进行定量,并进行统计分析.结果:PHEX蛋白主要表达于分化成熟的成牙本质细胞.在时间上,牙胚帽状期(E16)中未分化的牙乳头细胞无明显表达,钟状期(E18)靠近基底膜处的牙乳头细胞有弱阳性表达,硬组织形成期(P5)可见到成熟的成牙本质细胞中有强烈表达;在硬组织形成期(P5)的空间分布上,颈环处未分化的牙乳头细胞中无明显表达,而未来牙尖处分化成熟的成牙本质细胞则有强烈表达.结论:PHEX蛋白表达具有特定的时间-空间分布特征,PHEX参与了小鼠成牙本质细胞的分化过程,可能在牙本质矿化过程发挥重要的作用.     

人成牙本质细胞样细胞的原代培养

目的：培养人原代牙本质细胞。方法：取引产的8月龄死胎，剥离乳磨牙胚牙乳头，组织块法培养。然后采用滤纸片法挑取了3个与成牙本质细胞形态相似的细胞克隆，扩大培养。对培养细胞从形态学、矿化结节、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、人牙本质基质蛋白-1（human dentin matrix protein-1,hDMP-1）和人牙本质涎磷蛋白（human dentin sialophosphoprotein,hDSPP）在mRNA水平上的表达等方面进行鉴定。结果：有一个克隆来源的细胞呈梭形、有单侧较长细胞突起，未见核极化，同时它们具矿化功能，表达人成牙本质细胞特异性标志hDMP-1、hDSPPmRNA。结论：该培养细胞为人成牙本质细胞样细胞，为进一步的有关研究奠定了基础。     

4种牙本质粘结剂对牙髓成纤维细胞毒性作用的比较

目的:对比研究4种第七代牙本质粘结剂对人牙髓成纤维细胞的毒性作用,初步探讨其生物安全性。方法:组织块培养法原代培养人牙髓成纤维细胞,免疫组织化学染色SP法鉴定细胞来源,采用四甲基偶氮唑盐比色法和浸提液法,双盲观察4种新一代牙本质粘结剂(G-Bond、i-Bond、xeno V、Clearfil S3Bond)的不同体积分数浸提液(12.5%、25%、50%、100%)作用不同时间(24、48、72 h)对人牙髓成纤维细胞的毒性作用。结果:4种牙本质粘结剂不同体积分数浸提液的作用下,人牙髓成纤维细胞形态均发生不同程度的变化。24、48 h时,xeno V细胞毒性影响较小,i-Bond细胞毒性影响较大,G-Bond与Clearfil S3 Bond细胞毒性无明显差异;72 h时,4种牙本质粘结剂对细胞毒性影响无明显差异。结论:4种牙本质粘结剂毒性趋于0～2级,随着作用时间延长,细胞毒性无明显差异。     

新生大鼠牙乳头细胞的体外培养和矿化特征

目的：观察体外培养的新生大鼠牙乳头细胞的生物学特征。方法：体外培养出生1d大鼠磨牙牙乳头细胞，进行组织学染色，透射扫描电镜观察。结果：体外培养的新生大鼠牙乳头细胞能形成细胞克隆，第3代细胞在含2mmol／L β-甘油磷酸钠、50mg／L抗坏血酸、10^-8moL/L地塞米松的培养液中培养7～8d后可呈现复层生长，培养14～16d后细胞结节中出现矿化，茜素红染色呈阳性反应；透射电镜观察细胞内出现大量含有致密小体的基质小泡样超微结构。结论：发育阶段较早的大鼠牙乳头细胞具有增殖和矿化能力。     

小鼠重组OSF-2对人牙周膜细胞附着和伸展的影响

目的：观察小鼠重组牙周膜细胞特异性因子2（OSF-2）对牙周膜细胞附着和伸展的作用。方法：采用固相结合分析实验及四唑盐比色等细胞生物学技术,观察牙周膜细胞在OSF-2基质上的附着能力和伸展率。结果：牙周膜细胞在OSF-2基质上附着和伸展良好,当浓度在20ug／ml以上时,作用尤其显著（P〈0．01）,与在FN基质的生长结果相似。结论：小鼠重组OSF-2可有效促进牙周膜细胞的附着和伸展。     

大鼠颌下腺肌上皮分化的研究

目的 :观察组织块原代培养法是否可用于涎腺肌上皮细胞发育分化的研究 ,并探讨肌上皮细胞的组织发生。方法 :采用组织块原代培养法 ,通过相差显微镜、透射电镜及免疫组化染色等检测手段 ,对不同时期大鼠颌下腺肌上皮细胞进行研究。结果 :肌上皮样细胞及含有分泌颗粒的分泌细胞见于体外培养第 3d。肌微丝及Actin阳性细胞分别最早出现于培养第 6d和 7d。此结果与体内研究结果相一致。结论 :肌上皮细胞可能来源于上皮干细胞 ;体外组织块培养方法亦适用于细胞分化研究。     

体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响

目的利用牙胚细胞（TGC）作为诱导成牙环境,将牙髓干细胞（DPSC）、外胚间充质干细胞（EMSC）分别与其共培养,观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4 d的大鼠TGC作为诱导成牙环境,将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养,免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白（DSP）的表达和碱性磷酸酶（ALP）活性的变化,免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果共培养7 d后,EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组（P<0.05）。免疫组化染色图像分析结果表明共培养7 d后,共培养组与TGC单独培养组差异显著（P<0.05）。共培养组3、7 d后ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高。结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,EMSC分化能力高于DPSC。     

Analysis and optimisation of the behaviour of a certain class of intermediates in electrosynthesis

The behaviour of an electrochemically generated Cypridina luciferin analogue system in non-flow, tank-flow, and piston-flow cells is analysed via simplified substance balance models. The existence of optimal species-capture conditions is demonstrated to be a function of (mean) residence times in the cells.     

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??Objective    To investigate effects of dental papillae cells on the proliferation of dental pulp stem cells??DPSCs?? and its mechanism. Methods    DPSCs and dental papillae cells were cultured??the co-cultured systems of DPSCs and dental papillae cells were established. The intracellular mineralization nodes were observed. The cell cycle of DPSCs was detected by flow cytometry. Finally??when the inhibitor of Notch??PHI??was administrated??the expression of Notch1??Jagged1 mRNA and protein was examined. Results    The obvious mineralization nodules were observed in DPSCs after 14 d of co-culture. Flow cytometry results showed that stratified co-culture promoted the proliferation of DPSCs. RT-PCR and western blot results showed that the expression of Notch1??Jagged1 mRNA and protein in the co-culture group was significantly increased compared with control group. Conclusion    Stratified co-culture of DPSCs and dental papillae cells might promote the mineralization and proliferation by activating Notch signal pathway.     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的 :体外分离、培养人牙髓干细胞 ,从不同角度对其进行鉴定。方法 :采用胶原酶和Dispase酶联合消化法培养人牙髓干细胞 ,有限稀释法分离纯化 ,将克隆形成的细胞通过透射电镜观察其超微结构、流式细胞仪细胞周期分析及抗波形丝蛋白 (Vimentin)、CD44、骨粘素 (ON)、牙本质涎蛋白 (DSP)免疫组化染色方法进行鉴定。结果 :通过有限稀释法获得了人牙髓干细胞克隆 ,透射电镜下观察这种克隆形成细胞具有干细胞典型的超微结构特点 ,大多数细胞处于G0 /G1期 ,为细胞周期的静止期 ,并具有牙源性未分化间充质细胞的表型特点。结论 :克隆化培养是人牙髓干细胞较为有效的分离纯化方法 ,该方法分离的人牙髓干细胞具有干细胞的结构、细胞周期及表型特点。     

外胚间充质干细胞的体外分离和鉴定

目的 :探讨SD大鼠外胚间充质干细胞的超微结构及经体外长期传代后变化程度。方法 :电镜分析组织细胞的超微结构 ;用流式细胞仪检测传代细胞的干细胞特异性标志CD57和P75的变化。结果 :细胞增殖旺盛 ,代谢活跃 ,处于未分化状态。P0 -P5期间 ,CD57和P75阳性细胞的比例没有明显降低 ,从P6开始 ,下降迅速 ,至P8-P10 期间已不可测。结论 :①干细胞可以在体外维持生长并增殖 ;②长期培养后 ,干细胞比例下降 ,甚至消失 ,这可能存在两种原因 :其一 ,干细胞经过体外培养已经完全分化了 ,失去了原有的表型 ;其二 :干细胞仍然存在 ,但缓慢增殖 ,被增殖迅速的瞬时扩增细胞稀释 ,以至无法检测