经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞治疗犬急性心肌梗死

背景:近年的研究表明,细胞移植可以修复受损的心肌组织,促进缺血区域新生血管的形成,改善缺血心肌的灌注和收缩功能.目的:观察白体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植至犬心肌梗死模型后在体内的分化及对心功能的影响.设计、时间及地点:随机列照动物实验,于2006-09/2008-04在天津泰达国际心血管病医院动物实验室完成.材料:成年杂种犬16只,体质量15～25 kg,通过结扎冠状动脉前降支中段建立急性心肌梗死模型.方法:16只杂种犬投币法随机分为移植组(n=10)和对照组(n=6),移植组于心肌梗死后2 h经冠状动脉内移植CM-Dil标记的骨髓单个核细胞:对照组注射等量生理盐水.冠状动脉结扎后2 h及6周时行超声心动图检查,移植后6周处死所有动物于梗死区及其邻近部位取材.主要观察指标:①心肌梗死后6局两组心功能指标比较.②荧光显微镜下观察骨髓单个核细胞在心肌组织中的分化情况.③透射电镜观察移植组梗死区心肌组织的变化.结果:纳入杂种犬16只,全部存活.左前降支结扎2 h后可见结扎点远端心肌组织变紫,室壁活动减弱,心电图出现ST段弓背样抬高.①对照组心肌梗死后6周和心肌梗死后2 h相比各项指标均无显著改善(P0.05).移植组术后6周时左心室射血分数、左心室收缩期末内径及左心室短轴缩短率均较心肌梗死后2 h有明显改善(P<0.01),其中左心室射血分数与对照组相比亦有明显改善(P<0.05),移植组射血分数较对照组提高7%左右.②荧光显微镜下可见移植组自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后可分布于梗死区及梗死周边区.并表达肌球蛋白重链:正常心肌组织及对照组心肌组织内未见移植细胞.③透射电镜下可见移植组分化完全的血管内皮细胞及类心肌样细胞.结论:骨髓单个核细胞可在梗死区梗死周边区存活并逐渐分化成心肌样细胞,促进缺血心肌血管新生,改善心功能.     

骨髓单个核细胞移植后心肌梗死区的血管生成及细胞因子分泌

背景：干细胞移植为治疗心肌梗死带来新的希望,但研究结果不一致,存在争议。细胞移植能否长期持久地改善心脏功能、改善缺血心功能的机制这些问题均不明确。目的：观察经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植对急性心肌梗死犬心功能、血管生成和细胞因子分泌的影响。方法：杂种犬分为骨髓单个核细胞组（n=10）和生理盐水组（n=6）,前上嵴或髂后上棘穿刺分离得到骨髓单个核细胞,结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,于心肌梗死后2h分别经冠状动脉内移植骨髓单个核细胞和生理盐水,心肌梗死后2h及6周时分别测定超声心动图指标,骨髓单个核细胞移植后6周vWF免疫组化染色检测心肌组织的毛细血管密度,RT-PCR检测血管内皮生长因子（血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164）、碱性成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶9mRNA的表达。结果与结论：经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植后6周,超声心动图显示,骨髓单个核细胞组射血分数和每搏输出量比生理盐水组显著升高;梗死边缘区新生血管数量明显高于生理盐水组。骨髓单个核细胞组梗死区血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164和碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达水平显著高于生理盐水组。骨髓单个核细胞组梗死区基质金属蛋白酶9mRNA表达水平显著低于生理盐水组。结果说明自体骨髓单个核细胞经冠状动脉内注射移植,改善急性心肌梗死后心功能,促进梗死边缘区血管生成,提高促血管生长因子血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164和碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达水平,减少基质金属蛋白酶9mRNA表达水平。     

NF-κB与基质金属蛋白酶在骨髓单个核细胞心肌移植后的变化

背景:骨髓干细胞能够修复受损心肌,改善不利的心室重构及恶化的心功能,但细胞移植后对梗死心室重构影响的分子机制仍不清楚.目的:观察骨髓单个核细胞心肌移植后,心肌组织NF-κB、基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-05在解放军总医院心血管外科实验动物中心和解放军军事医学科学院病原微生物生物安全国家重点实验室完成.材料:成年健康雄性杂种犬24只,随机分为急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组,6只/组.方法:急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组在冠状动脉左前降支主干结扎1h,观察缺血梗死区仍然呈暗红色,确认急性心肌梗死模型建立成功.陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组在移植前行超声心动图检查,证实左室前壁和心尖部可见节段性室壁运动异常,确认陈旧心肌梗死模型建立成功.Ficoll分离法获得犬自体骨髓单个核细胞悬液,急性心肌梗死移植组在造模后1h于梗死区及梗死边缘区分多点注射细胞悬液,每点注射0.5 mL,(1～2)×107个细胞/mL;陈旧心肌梗死移植组于造模后4周开胸确认梗死区,同法行细胞移植.主要观察指标:RT-PCR法检测心肌组织基质金属蛋白酶及其抑制因子mRNA的表达,Western免疫印迹法检测心肌组织NF-κB 的表达.结果:移植后6周与相应对照组比较,急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死移植组的梗死区、梗死周围区基质金属蛋白酶2,9mRNA及NF-κB 表达均显著降低(P<0.01),基质金属蛋白酶抑制因子1,2 mRNA表达均显著升高(P<0.01).结论:犬自体骨髓单个核细胞心肌移植可能通过抑制NF-κB活化,导致基质金属蛋白酶mRNA表达减少及其抑制因子mRNA表达增加,从而抑制梗死后心室重构过程.     

不同种类自体骨髓干细胞移植对梗死心肌左室重构的效果比较

背景:骨髓干细胞移植可改善心功能、预防心室重构,目前用于移植的成体骨髓干细胞有骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞等,不同种类的骨髓干细胞移植后的效果及具体机制尚不清楚。目的:比较自体骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞冠状动脉移植对急性心肌梗死后心室重构的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-03/2006-12在河北省人民医院临床研究中心、河北医科大学电镜室及大连宝生物进行。(basic fibroblast growth factor,bFGF)材料:36只冀中白猪随机分为4组:假手术组6只、模型组10只、骨髓单个核细胞组10只、骨髓间充质干细胞组10只。方法:采用梯度密度离心法分离培养猪自体骨髓单个核细胞,以贴壁法分离培养猪自体骨髓间充质干细胞,移植前均行胶体金标记。除假手术组外,其余3组均以球囊导管压迫冠状动脉前降支的方法建立猪急性心肌梗死模型。造模后90min,经导管由冠状动脉腔内骨髓单个核细胞组移植自体骨髓单个核细胞(6.0±1.3)×107个,骨髓间充质干细胞组移植自体骨髓间充质干细胞(4.5±2.1)×107个,培养28d。主要观察指标:光镜及电镜观察心肌组织病理学改变;超声检查心功能变化;免疫组织化学检测心肌血管数、心肌细胞凋亡、心肌组织核因子κB及肌钙蛋白I阳性表达情况,及其与心功能的关系;RT-PCR法检测心肌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)mRNA的表达,及其与心功能的关系。结果:①骨髓间充质干细胞组在梗死区、梗死边缘区均可见大量血管增生,冠脉血管周围可见异常细胞团生长,骨髓单个核细胞组有较多的毛细血管"芽生"现象。②细胞移植前各组心功能指标基本相似(F=1.550,P>0.05)。移植后28d与模型组比较,其余3组左心室射血分数均明显降低(F=5.30,P<0.05)。③与模型组比较,骨髓单个核细胞组梗死区及梗死边缘区的血管数明显增加(F=29.56～34.87,P<0.01),骨髓间充质干细胞组无变化;移植细胞两组的梗死区、梗死边缘区心肌细胞凋亡率均显著降低(F=14.31～35.34,P<0.01),肌钙蛋白I阳性率均明显升高(F=19.05,P<0.01);梗死边缘区核因子кB阳性率均明显降低(F=19.05,P<0.01)。④骨髓单个核细胞组梗死边缘区VEGF基因的表达显著高于模型组、骨髓间充质干细胞组(F=49.41,P<0.01)。骨髓间充质干细胞组梗死边缘区bFGF基因的表达显著高于模型组、骨髓单个核细胞组(F=4.71,P<0.01)。⑤左室射血分数与心肌细胞凋亡率、心肌核因子κB呈负相关(r=-0.4411,P<0.05;r=-0.5796,P<0.01);与血管数、VEGF及bFGF表达呈正相关(r=0.775,P<0.01;r=0.5651,P<0.05;r=0.5735,P<0.05)。结论:经冠脉自体骨髓单个核细胞或骨髓间充质干细胞移植均可减轻心肌梗死后左心室重构,心功能的改善与干细胞移植后增加心肌血管数量及心肌VEGF,bFGF表达、减少心肌细胞凋亡及核因子κB水平有关。骨髓单个核细胞移植促心肌血管增生及VEGF的表达均优于骨髓间充质干细胞,而后者促bFGF基因表达的作用优于前者。     

经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性前壁心肌梗死:12个月疗效评价

目的:经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植有助于急性心肌梗死后左心室功能的恢复,但关于移植后远期疗效的临床报道较少.采用随机、对照、前瞻性的临床实验,随访12个月,评价经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性前壁心肌梗死远期疗效.方法:实验于2005-05/2006-09在复旦大学附属华山医院心导管室完成.①实验分组:入选华山医院心内科26例ST段抬高的急性前壁心肌梗死住院患者,随机分组:骨髓单个核细胞移植组(n=14)行经皮冠状动脉介入治疗联合经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植,经皮冠状动脉介入术当天,选取左髂后上棘为穿刺点行骨髓单个核细胞的分离纯化:对照组(n=12)仅接受经皮冠状动脉介入治疗.患者对治疗知情同意,治疗经医院伦理委员会批准.②实验评估:术后6,12个月,应用超声心动图评价心脏收缩功能和几何构犁参数改变;应用电化学发光免疫学方法检测血清氮末端脑钠素前体水平,间接评价心功能的变化;明尼苏达心力衰竭问卷评价患者生活质量.结果:①超声心动图显示,经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植6个月后,骨髓单个核细胞移植组左室射血分数明显升高(P＜0.05),而随访至12个月时,移植组左事射血分数有进一步增加的趋势,但与6个月时比较则无统计学意义,心脏几何构型参数改变均无统计学意义.②骨髓单个核细胞移植术后6个月,骨髓单个核细胞移植组血清氮末端脑钠素前体水平明显降低(P=0.001):而术后6个月与12个月比较,血清氮末端脑钠素前体水平仍有进一步下降的趋势,但无统计学意义.③心力衰竭问卷评分提示,骨髓单个核细胞移植有利于急性前壁心肌梗死患者生活质量的改善.结论:经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性前壁心肌梗死,可以改善患者临床症状,由于样本量较小,对心肌梗死后心力衰竭的远期疗效仍然尚不确定.     

经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞用于治疗心肌梗死后的心力衰竭

目的:观察经冠状动脉直接注射进行自体骨髓单个核细胞移植时细胞能否进入心肌组织并有效改善心肌梗死后的心脏功能。方法:成年犬24只,随机分为对照组与移植组,移植组于移植前一天抽取骨髓液分离骨髓单个核细胞(数量约为2×108)。结扎冠状动脉左前降支后,移植组于冠状动脉内注射骨髓单个核细胞悬液,对照组注射培养基。6周后处死动物,比较其心肌梗死面积、瘢痕区毛细血管数量、超声心动图指标及血流动力学指标的变化。结果:对照组和移植组各死亡4只犬,分别有8只犬进入结果分析。①各组犬心脏标本病理研究结果:骨髓单个核细胞经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性率约为50%;移植6周后于梗死区的心肌组织内能够检测到5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记阳性的细胞;移植组的梗死区面积和梗死范围比对照组分别下降了30.9%和35.0%,但无显著性差别(P均>0.05);瘢痕区每个高倍视野(0.2mm2)的毛细血管数量,移植组为5.33±0.58,明显高于对照组2.03±0.46(P<0.01)。②血流动力学指标的变化:移植组与对照组相比,6周时左室内压最大上升速率、最大下降速率及心输出量均显著上升[(3039±1164)比(1569±618)mmHg/s,P<0.01;(2951±793)比(1465±647)mmHg/s,P<0.01;(1.88±0.33)比(1.41±0.29)L/min,P<0.05]。③超声心动图心功能指标的变化:移植组左室射血分数明显高于对照组(46.01%,35.28%,P<0.05)。④不良事件和副反应:在实验中仅在移植组1例实验犬的细胞注射部位观察发现一炎性包块,移植后6周时观察未见明确的恶性心律失常出现及肿瘤组织形成。结论:经冠状动脉直接注射进行骨髓单个核细胞移植可行且安全,它能够促进梗死区的新血管生成并有效改善心肌梗死后的心脏功能。     

心肌及冠状动脉内移植骨髓单个核细胞对猪缺血心肌侧支血管的生成

背景:目前有研究表明,心肌内直接注射骨髓单个核细胞可以使心肌梗死瘢痕区血管新生,改善缺血心肌血供。目的:观察心肌内及冠状动脉内移植自体骨髓单个核细胞对猪急性心肌梗死后缺血心肌侧支血管生成的作用。方法:22只小型猪制备急性心肌梗死模型后分为4组:心肌内移植组造模后即刻在缺血心肌内注射自体骨髓单个核细胞悬液;心肌内对照组同样方法即刻心肌内注射Hank’s平衡盐溶液;冠状动脉内移植组在造模后1周,左冠状动脉内注射自体骨髓单个核细胞悬液;冠状动脉对照组在造模后1周,同样方法左冠状动脉内注射Hank’s平衡盐溶液。结果与结论:心肌内及冠状动脉内移植骨髓单个核细胞后1周,血清碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮细胞生长因子水平差异无显著性意义,但明显高于各自对照组(P<0.01);移植后4周,心肌内移植组与冠状动脉内移植组小血管密度差异无显著性意义,但明显高于各自对照组(P<0.01);左室舒张末压差异无显著性意义,但明显低于各组对照组(P<0.01)。提示心肌内及冠状动脉内移植骨髓单个核细胞均有助于促进猪缺血心肌血管新生及侧支循环形成。     

兔骨髓单个核细胞自体移植对缺血心肌修复重建及心功能的改善

目的:观察兔骨髓单个核细胞自体移植至缺血心肌后的修复重建能力,以及心功能的改善状况。方法:实验于2005-07/2006-04在安徽省干细胞研究和治疗中心完成。①选取清洁级健康雄性新西兰白兔20只,随机数字表法分为心肌梗死模型组、骨髓单个核细胞组,10只/组。②两组兔均于左心耳下缘结扎前降支冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,心电图出现S-T段弓背样抬高为结扎成功。③2周后于股骨处行骨髓穿刺取5mL骨髓,分离纯化骨髓单个核细胞。骨髓单个核细胞组将Dil标记的含2.5×107细胞数目的细胞悬液400μL注射至心肌梗死周边区域,心肌梗死模型组仅注射等量L-DMEM培养基。③两组分别于造模前、细胞移植前及细胞移植后2,4周行多普勒心脏超声心动图检查,计算左室射血分数、左室短轴短缩率,进行心功能评价。④细胞移植8周后处死全部动物,制备组织冰冻切片,病理学检查移植细胞在梗死区的生长状况,镜下见有Dil标记阳性的细胞认为是存活的移植细胞。普通光学显微镜200倍视野下计数毛细血管数量。结果:骨髓单个核细胞组10只均进入结果分析;心肌梗死模型组因造模死亡4只,6只兔完成整个实验过程。①不同时相点心功能指标超声心动图检查结果:两组造模前、细胞移植前、细胞移植后2周左室射血分数、左室短轴短缩率均基本相似(P>0.05);移植后4周,骨髓单个核细胞组左室射血分数、左室短轴短缩率均明显高于心肌梗死模型组犤(69.1±5.3)%,(62.4±7.8)%;(34.3±8.4)%,(27.2±5.3)%;P均<0.05犦。②骨髓单个核细胞在梗死心肌中的存活情况:荧光显微镜下,骨髓单个核细胞组梗死灶边缘有Dil标记的细胞存活,免疫组化结果显示Dil阳性细胞表达心肌细胞特异性标志α-sarcomericactin。两组均未见炎性细胞浸润,但骨髓单个核细胞组新生毛细血管密度明显高于心肌梗死模型组犤(38.5±2.0)mm-2,(21.4±3.9)mm-2,P<0.05犦。结论:兔骨髓单个核细胞自体移植8周后存活于梗死心肌中,并表达心肌细胞特异性标志,移植后可明显改善左室收缩功能,增加毛细血管密度,但短期内未减轻心室重构的进程。     

脂肪干细胞和骨髓单个核细胞自体移植治疗心肌梗死作用的比较

背景：关于骨髓单个核细胞促使梗死心肌再生存在很大争议，早期研究均认为非常有效，甚至可以分化为心肌细胞，但最近的文献却基本否认了这种说法，认为单个核细胞仅可以有限的促进血管生成。目的：比较体外培养的脂肪干细胞和骨髓单个核细胞自体移植后对促进心肌细胞再生、血管新生及心肌梗死后心功能改善之间的差别。设计、时闻及地点：随机对照动物实验，于200401／2005-09在解放军总医院心内科实验室与沈阳军区总医院实验室完成。材料：清洁级4月龄雄性新西兰白兔55只，10只用于骨髓单个核细胞标记追踪，剩余兔随机分为脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组、空白对照组，15只/组。方法：各组兔均结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型，造模同时取少量腹部脂肪组织分离培养脂肪干细胞，抽取髂骨骨髓分离培养骨髓单个核细胞，用于自体移植。3周后再次开胸，脂肪干细胞组、骨萌单个核细胞组分别于梗死心肌直接注射自体脂肪干细胞和骨髓单个核细胞，空白对照组注射磷酸盐缓冲液。继续培养5周，将专用于骨萌单个核细胞标记追踪的10只免行DAPI和BrdU标记，脂肪干细胞组的移植细胞行Brdu标记。主要观察指标：移植细胞标记情况。移植后心功能变化。苏木精．伊红染色和免疫组织化学检测结果。结果：脂肪干细胞组心肌梗死区可见大量移植细胞存在，可分化为心肌细胞、内皮细胞、参与新血管形成；骨髓单个核细胞组DAPI及BrdU标记后均未于梗死心肌组织发现单个核细胞存在。细胞移植前3组动物心功能基本相似；细胞移植后5周与空白对照组比较，脂肪干细胞组超声心动图及左心室压力曲线检测均显示心功能显著改善（P〈0.05），骨髓单个核细胞组仅等容收缩期左心室压力最大上升速率明显改善（P〈0.05）。脂肪干细胞组、骨萌单个核细胞组的血管密度均大于空白对照组（P〈0．01，P〈0.05），但前者于心肌梗死中心和边缘均可见大量血管，而后者仅在梗死区边缘血管密度增高。结论：脂肪干细胞移植可以促进心肌再生和新血管形成，进而改善心功能；而骨萌单个核细胞移植仅能促进血管新生，对心功能改善效果有限。     

同种异体骨髓单个核细胞移植急性心肌梗死大鼠:心肌细胞凋亡及相关基因的表达

背景:细胞凋亡增加所导致的进行性心肌细胞丢失是引起急性心肌梗死后充血性心力衰竭的主要原因之一,通过降低肿瘤坏死因子α浓度及Bax蛋白、PDCD5 mRNA表达可以抑制急性心肌梗死后心肌细胞凋亡.目的:探讨同种异体骨髓单个核细胞移植对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-01/11在华中科技大学附属协和医院完成.材料:体质量为(240±20)g的Wistar大鼠60只,随机分为假手术组、模型对照组、细胞移植组,20只/组.另取体质量为100～150 g的Wistar大鼠60只用于制备骨髓单个核细胞.方法:模型对照组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死模型;假手术组大鼠仅开胸,不结扎冠状动脉左前降支.造模后,细胞移植组大鼠在梗死心肌周围分4点于心外膜下植入骨髓单个核细胞悬液,每点100 μL(107个细胞);假手术组、模型对照组同法注射等量DMEM培养基,培养4周.主要观察指标:血清及非梗死区心肌组织中肿瘤坏死因子α的水平,左室非梗死区心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白和PDCD5mRNA的表达.结果:移植后4周,细胞移植组在发生凝固坏死的宿主心肌内可以看到局灶BrdU标记阳性的骨髓单个核细胞.与假手术组比较,移植后4周模型对照组、细胞移植组血清和心肌组织中肿瘤坏死因子α水平均显著升高(P<0.05),但细胞移植组升高幅度明显小于模型对照组(P<0.05).与假手术组比较,模型对照组和细胞移植组左心室非梗死区心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白和PDCD5 mRNA(PDCD5/GAPDH)均明显升高(P<0.05),但细胞移植组升高幅度明显小于模型对照组(P<0.05).结论:同种异体骨髓单个核细胞移植可以抑制大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡的发生,其机制可能与其抑制肿瘤坏死因子α的表达、降低Bax蛋白和PDCD5基因的促凋亡作用有关.