汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白基因表达载体的构建及表达

摘要：目的构建汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达载体并将其在Vero E6细胞中进行表达,观察细胞融合现象。方法采用PCR和基因克隆技术,将GM04 38株G1、G2基因分别克隆到表达载体pCAGGS／MCS,酶切和测序鉴定正确后,将表达载体pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共转染Vero E6细胞,酸性MEM处理后观察细胞融合现象的产生,并以间接免疫荧光试验(IFA)观察糖蛋白的表达情况。结果显示在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2,IFA显示荧光信号分布在细胞浆中。二者的共表达可产生良好的生物学活性,在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合,而转染pCAGGS-NP的细胞没有融合现象发生。共表达也未出现明显的促进效应。结论成功构建了糖蛋白G1、G2的表达载体,并在Vero E6细胞中呈有效表达,二者的共表达可在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上融合肽的初步确定

目的  初步确定汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上潜在的融合肽区域。  方法  采用基因定点突变技术将潜在融合肽区域的十个关键氨基酸突变成性质相左的氨基酸,转染Vero E6细胞后,间接免疫荧光（IFA）检测糖蛋白表达,采用Giemsa染色法观察细胞融合现象。  结果   在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白,IFA显示关键氨基酸突变前后细胞中均有荧光信号,呈胞浆分布,但细胞融合现象在突变后消失。  结论 潜在融合肽区域的十个氨基酸突变均对细胞融合产生明显的影响,提示该段区域很可能是病毒的融合肽。     

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６－１１８,３９）Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物和一条探针,按异硫酸氰胍－酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ,采用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６份对照组血清、４０份ＨＦＲＳ急性期（１～５天）血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ,所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０份     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

肾综合征出血热汉坦病毒分型及序列特征的研究

目的 分析黑龙江省肾综合征出血热（HFRS）患者携带汉坦病毒的基因型别及序列特征.方法 采集临床诊断为肾综合征出血热病人的全血60例,其中通过金标法检测出血热特异性抗体阳性40例、阴性20例,血凝块提取汉坦病毒RNA,应用RT-Nest-PCR及核苷酸序列测定分型技术对黑龙江地区的汉坦病毒进行分型研究,设计汉坦病毒M片段通用引物（MOF,MOR）及HTNV和SEOV的M片段特异性引物（HTNMF、HTNMR,SEOMF、SEOMR）,应用Nest-PCR进行扩增,回收阳性扩增产物进行基因序列测定,将所测基因序列与国内外HV病毒株序列进行核苷酸同源性分析,构建M基因种系进化树.结果 出血热特异性抗体阳性的病例中扩增出HTN型19份,抗体阴性的病例中扩增出HTN型1份、SEO型l份.总体来看黑龙江省流行的汉坦病毒毒株主要为HTN型和SEO型,以HTN型为主.经核苷酸及氨基酸同源性和种系进化分析表明其黑龙江地区的病毒株同源性较高,其中HTN型与76 ～ 118株同源性较高,SEO型与Z37株的同源性较高.结论 黑龙江省的HV感染病例多为HTN型,与其他GenBank中的各地标准株的核苷酸及推导的氨基酸序列均有一定差异,在系统进化树中分析HTN型与76-118株较为接近.SEO型与国内Z37较为接近.结合临床症状发现其临床症状较为相似的在系统进化发生树中较为接近.     

江苏省2009—2013年汉坦病毒分离株全基因序列测定及分析

目的:从分子水平分析2009—2013年江苏省分离汉坦病毒(Hantavirus,HV)的型别及变化,为疾病的预防控制提供实验依据?方法:采集2009—2013年江苏省肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)急性期患者血清及监测点鼠肺标本?采用胶体金法检测血清样本中汉坦病毒的IgM?IgG抗体,采用免疫荧光检测鼠肺样本中汉坦病毒抗原,并用VERO E6细胞分离病毒,RT-PCR检测标本培养物中病毒M片段以鉴定HV病毒,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,MEGA6.0软件对其进行序列比对和进化分析?结果:分离到的11株病毒与陕西分离株LR1?四川分离株S85-46以及汉坦病毒原型株76-118遗传距离最为接近,属于汉滩(Hantean,HTN)型病毒?分离株与2002年分离的江苏(A9?HTN型)株以及浙江株?安徽株处于不同的进化分支上,表明遗传关系较远?结论:江苏的汉坦病毒优势株发生了变化,而且发生了宿主转换?目前疫苗仍具有保护效力,但需加强监测?     

中国湖北地区汉坦病毒M片断基因变异的研究

目的:了解中国湖北地区汉坦病毒的遗传学特征。方法:采集2000~2001年肾综合征出血热(HFRS)患者的血液标本,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增汉坦病毒M片断基因。22例IgM阳性患者中,从5例患者的血凝块中扩增得到特异性PCR产物。结果:对550bp和403bp扩增产物进行的系统进化分析揭示汉坦病毒至少存在3个不同分支。W613株和W1141株与原型株HTN76-118,CUMC-B11(韩国),cl-l和cl-2(日本)同一分支;W1219株和H8205同一分支;另外两株与A9和HV114同一分支。结论:首次发现湖北地区人类汉坦病毒株与韩国和日本的HTN型具有高度序列同源性。     

汉滩型与希望山型汉坦病毒的体外重组

目的：探明汉坦病毒汉滩型与希望山型之间能否发生巧克力理排，以及发生重排的频率和特点，方法：用汉坦病毒汉滩型76－118株与希望山型PHV株混合感染VeroE6细胞，空斑形成实验挑取子代病毒克隆株，传代培养后用RTPCR方法鉴定子代病毒基因型。结果：子代病毒14／36来源于PHV株；12／36来源于76－118株；5／36汉滩型与希望山型分型引物扩增均为阳性；1株子代病毒L，S片断均来源于76－118株，而M片段两种引物扩增均为阳怀；2株子代病毒L片断来源于76－118株，S片断来源于PHV株，M片段两种引物扩增均为阳性。1株子代病毒L，S片断均来源于76－118株，而M片段来源于PHV株，结论：汉坦病毒汉滩型与希望山型之间可以发生基因片段的重排。     

肾综合征出血热患者血清样本中汉坦病毒RNA检测及其临床意义

目的观察病毒血症在病程各期的变化。方法根据汉坦病毒血清Ⅰ型76-118株及血清Ⅱ型80-39株M基因G1区设计两对公有引物及一条探针,应用RT-nestedPCR方法对57例96份肾综合征出血热(HFRS)患者血清中HV-RNA检测,所有PCR产物用DOT-Blot证实。结果96份样本中68份阳性,阳性率70.8%;在病程第1、2、3周,HV-RNA检测率分别为94.7%、47.5%、25%,P<0.05;重型病人持续2周HV?RNA阳性检测率100%,而轻、中型分别为12.5%及42.8%,P<0.05。结论在HFRS病程中,病毒血症是一个急性过程,与发热期相平行,病毒血症持续时间与病情轻重密切相关。     

汉坦病毒的分型及致病性

目的：从血清学及分子生物学两方面，对汉坦病毒属的各型别和致病性进行了系统概述。方法收集有关汉坦病毒分型及致病性资料加以综合归纳。结果：自然界至少存在１１个血清型或基因型汉坦病毒，其致病性从轻型至重型不等。有些型别的致病性尚不清楚。结论：新型汉坦病毒的不断发现，特别是最近在美国出现的汉坦病毒肺综合征，说明自然界很可能 新型汉坦病毒，有必要对其进行系统研究。     

河北省肾综合征出血热主要流行区鼠携带汉坦病毒基因序列分析

目的了解河北省肾综合征出血热（haemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）主要流行区汉坦病毒主要流行株的基因型及其变异情况。方法收集2012年河北省东北部地区捕获的啮齿动物,均为褐家鼠,取鼠肺组织,用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测,抗原阳性的标本进行汉坦病毒（Hantavirus,HV）M部分片段扩增并测序,与该地区以往序列及其他部分标准株进行系统发生树及同源性分析。结果收集164份鼠肺标本,经IFA检测26份阳性,挑选9份有代表意义的标本进行逆转录巢式PCR扩增,9份鼠肺标本经RT-PCR检测均为汉城（SEO）型HV,病毒间变异不大,同源性达95.2%~100.0%。以往测序株与新测序株比较同源性为99.0%~100.0%。系统发生树分析结果表明9份标本均为SEO型HV,且为S3亚型。结论河北省HFRS主要流行区HV以SEO型为主,亚型为S3亚型。同型HV基因相对保守,具有区域稳定性特征。     

逆转录—半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究，方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性，特异性及临床应用研究。结果所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测为阴性，８６份级ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血     

云南省2010年肾综合征出血热监测分析

目的对云南省肾综合征出血热人间和鼠间疫情进行监测,分析流行病学特点,提供防治参考。方法收集监测点本病疫情资料,并在监测县采集人血清以及鼠型动物肺脏和鼠血清作汉坦病毒抗原或抗体检查。结果 2010年全省共报告出血热病例15例,死亡1例,病死率6.67%,其中大理州8例和楚雄州3例。2010年在红河州泸西县、昆明市五华区、大理州祥云县的居民区和野外共捕获鼠形动物10种406只。其中居民区以黄胸鼠和褐家鼠为优势鼠种,野外以大绒鼠、中华姬鼠为优势鼠种,鼠间汉坦病毒总带毒率为8.33%(33/396),阳性鼠型动物为黄胸鼠、褐家鼠、大绒鼠、小家鼠、灰麝鼩,带病毒率依次为2.02%(2/99)、6.38%(3/47)、22.03%(26/118)、16.67%(1/6)、50.00%(1/2)。结论滇中和滇西地区为本病主要发病地区。调查地区广泛存在以褐家鼠为主要传染源的家鼠型HFRS疫源地,泸西县还存在以大绒鼠为主要传染源的野鼠型HFRS疫源地。     

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的：研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法：采用RT-PCR扩增G2基因，转化感受态大肠杆菌DH5α，DNA序列分析后，SnaBI、NotI两次酶切下G2，再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上，构建表达载体pPIC9K-G2，SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115，G418筛选转化子，1％甲醇诱导、摇瓶培养。结果：序列分析表明，克隆序列与设计相符，12％SDS-PAGE显示重组蛋白为50KD，Western-Blot证实其生物学活性。结论：成功地在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了汉坦病毒G2膜蛋白基因。     

PCR-SSCP法分析汉坦病毒在乳鼠中的基因变异

目的：研究汉坦病毒在感染乳鼠体内有无基因变异．方法：用陈株病毒感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞并继之感染３ｄ龄乳鼠，提取病毒ＲＮＡ并反转录成ｃＤＮＡ，以ＰＣＲ分别从感染细胞和乳鼠中克隆出病毒的部分Ｇ２编码区序列，继而用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对之进行单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析．结果：从感染细胞和乳鼠中克隆出的此位置和大小完全相同的ｃＤＮＡ片段单链电泳构像明显不同，从感染乳鼠中克隆的基因片段单链电泳速率明显快于从感染细胞中克隆的相应基因片段．结论：汉坦病毒的基因序列可因寄生宿主的不同而发生变异．     

深圳市2010—2019年肾综合征出血热流行病学特征

目的 分析2010—2019年深圳市肾综合征出血热病例的流行病学特征,为制定防控措施提供科学依据。方法 对中国疾病预防控制信息系统中报告的深圳市2010—2019年肾综合征出血热病例进行描述性流行病学分析,分析肾综合征出血热病时间、地区、人群发病的变化情况。结果 2010—2019年深圳市共报告肾综合征出血热468例,死亡病例3例,发病率波动在0.34/10万~0.58/10万之间,年平均发病率为0.56/10万人,年平均病死率为0.64%, 2010—2015年间发病率有升高趋势,之后回落,但发病率趋势差异无统计学意义（χ²=0.15, P=1.00）。发病高峰时间为 1—4月,占了总发病数的50.96%;男性病例（76.23%）要明显高于女性（23.77%）,高发人群为青壮年及中年人群。深圳市发病较高的区依次为宝安区（31.05%）、龙岗区（20.56%）、南山区（13.49%）、福田区（13.28%）和罗湖区（11.99%）。结论 2010—2019年间深圳市肾综合征出血热发病平稳,冬春季为防控重点期,对于高发辖区需加强监测,并强化疫苗接种意识和落实防鼠灭鼠工作,应重点关注30~<45岁人群。