小鼠毛囊细胞注射移植实验研究

目的 研究小鼠皮肤毛囊细胞注射移植的再生机制及影响因素.方法 取3～5dC57BL/6J近交系小鼠背部皮肤,Dispase酶消化后剥离表皮,将真皮剪成小块置胶原酶中,过滤、低速离心、密度梯度离心后收集毛囊并制备单细胞悬液,经Dio标记后以不同的浓度和细胞组合进行皮内和皮下注射移植,并于移植后2、4d,以及1、3、6周观察其变化.结果 小鼠毛囊细胞皮内注射移植后4d,注射部位轻微隆起,外表呈灰色,镜下可见大量再生的毛囊,毛球部呈黑色,无明显毛干.移植后1周,注射点均可见明显隆起,外表呈现黑色,镜下可见大量毛囊伴有明显的黑色毛干,局部见密集分布的血管,管径增粗.移植后3周小鼠皮内注射部位形成一个含有灰白色内容物的囊肿,镜下可见密集的黑色毛发,冷冻切片荧光检测见明亮绿色荧光.移植后6周,见囊内充满大量毛干,镜下可见大量脱落的杵状毛干及处于生长期的毛囊.而毛囊细胞皮下注射移植3周后,皮下仅散乱分布大小不等的灰白色囊肿,新生毛囊数量少,方向杂乱.毛囊细胞经过培养或移植数目低于1×105个时无新生毛囊形成.结论 毛囊细胞注射移植后能自发聚集,协同发育成新的毛囊.新生毛囊具有正常的生长周期.毛囊重建的效果不仅取决于所移植的细胞类型,同时还受到移植部位和细胞数量的影响.     

毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究

目的 探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性。方法 采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞，进行毛囊组织工程重建，或用游离细胞混合移植于棵鼠，组织学观察毛囊形成情况。结果 毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤，在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构，移植于棵鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊。低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊，并有肉眼可见的毛发纤维产生。结论 毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力，通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用，可诱导毛囊形成。     

富含血小板血浆对组织工程脂肪移植效果的影响

目的:在移植的组织工程脂肪组织中加入含激活剂的富含血小板血浆(PRP)或不含激活剂的富含血小板血浆,通过观察脂肪组织各个时间段的成活率来证明PRP的作用。方法:根据Landesberg二次制备法制备PRP。按1000U凝血酶溶于1ml质量百分比为10%的CaCl2配制激活剂。从兔背部取脂肪组织制备好,按实验分组分别加入不同的成分移植到兔子耳部。分别在术后1月、3月、6月测量体积变化。结果:含激活剂的PRP加入组织工程脂肪移植后3个时间段的体积成活率均高于对照组。结论:加入激活剂的PRP释放生长因子增多,释放速度增加,间接促进了脂肪干细胞分裂、分化、成活,促进了移植脂肪组织的更新,使脂肪移植成活率增加。     

抗凝剂对富含血小板血浆质量的影响

目的 探讨抗凝剂对富含血小板血浆中血小板活性的影响,以明确抗凝剂的选择是否影响富含血小板血浆的质量.方法 分别用肝素钠、枸橼酸钠、抗凝枸橼酸葡萄糖、枸橼酸-茶碱-腺苷-潘生丁作为抗凝剂,抽取志愿者全血,分离血小板、制备富含血小板血浆.电镜观察血小板的微观结构;检测血浆中可溶性P-选择素浓度,以观察血小板的自发激活情况;测定富含血小板血浆激活后转移生长因子释放量.结果 枸橼酸-茶碱-腺苷-潘生丁抗凝剂和抗凝枸橼酸葡萄糖与肝素钠和枸橼酸钠相比,能长时间保持血小板结构完整,减少血小板在富含血小板血浆制备过程中的自发激活.抗凝枸橼酸葡萄糖对血小板的保护作用较枸橼酸-茶碱-腺苷-潘生丁弱,但二者与肝素钠和枸橼酸钠相比,均能使富含血小板血浆释放较多的生长因子.结论 不同抗凝剂对富含血小板血浆的质量和生物活性有显著影响.复合试剂抗凝枸橼酸葡萄糖、枸橼酸-茶碱-腺苷-潘生丁能更长时间地保持富含血小板血浆的生物活性,提高其质量.     

富含血小板血浆对牵引成骨过程中新骨生成的影响

目的　探讨富含血小板血浆 (PRP)对成骨细胞以及牵引成骨过程中新骨生成的作用。方法　通过体外成骨细胞的培养及牵引成骨动物模型的制备 ,采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况 ,采用组织化学、四环素标记等方法观察骨组织新骨生成情况。结果　PRP可以促进体外培养成骨细胞的增殖 ,促进牵引成骨过程新骨的生成。结论　PRP可以加快牵引成骨过程的新骨生成 ,临床应用可能缩短牵引成骨的治疗过程。     

富含血小板血浆和骨髓基质干细胞复合物修复兔颅骨缺损

目的:在骨缺损中植入骨髓基质细胞和富含血小板血浆(Platelet Rich Plasma, PRP)的复合物,观察缺损的修复情况,为临床骨缺损的修复探索新的途径。方法:体外扩增兔骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cell, MSCs),将MSCs与PRP混合形成MSCs/PRP复合物,使细胞的终浓度为5×106个/ml。将MSCs/PRP复合物用牛凝血酶固化为凝胶体,植入细胞供体兔颅骨直径15mm缺损中,以单纯植入PRP作为对照。术后8周取材,通过大体观察、X线检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。结果:MSCs/PRP凝胶植入8周后,缺损大部分获得修复,组织学分析显示缺损中有大量新骨形成。结论:应用PRP复合MSCs可以提高骨缺损的修复效果。     

富含血小板血浆双相接种法构建组织工程骨

目的：传统的细胞接种法接种效率低,影响组织工程骨的成骨质量。本研究预探讨富含血小板血浆双相接种法是否可以提高细胞接种效率、优化组织工程骨的构建。方法：分别用富含血小板血浆、乏血小板血浆重悬BMSCs,灌注于三维多孔PLGA支架中,凝血酶促凝,体外培养。通过扫描电镜观察支架表面的细胞分布;通过检测支架内DNA含量、ALP含量、成骨基因表达情况分析细胞的接种效率、增殖和分化情况,并与传统的接种方法进行比较。结果：富含血小板血浆和乏血小板血浆双相接种法均能提高细胞与三维支架的结合效率;富含血小板血浆还可以促进支架内细胞的增殖,同时不影响细胞的分化。结论：双相接种法可以提高细胞的接种效率;与普通双相接种法相比,富含血小板血浆双相接种法可以进一步优化组织工程骨的构建。     

微囊化人头皮毛乳头细胞诱导小鼠耳毛囊再生的研究

目的 观察人头皮毛乳头细胞海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-polylysine-alginate，APA）微囊是否具备诱导小鼠耳部毛囊再生的功能；寻找理想的微囊直径。方法 以APA微囊包裹体外分离培养的人头皮毛乳头细胞；将毛乳头细胞微囊移植至小鼠耳部皮下，6周后局部取材行组织学检查；共聚焦显微镜下观察葡聚糖-荧光素在APA微囊中的扩散速度和扩散方式，并对比相同时间、不同直径的APA微囊中葡聚糖-荧光素的强度，综合分析确定最佳的微囊直径。结果 组织学检查显示：移植部位皮下有密集的同心圆状毛囊结构形成，其数量、大小、分化程度等与对照组明显不同。荧光素以同心圆状、逐层渗透的方式向APA微囊中扩散；相同时间内荧光强度比较：小囊组〉中囊组〉大囊组。结论 微囊化毛乳头细胞具备诱导毛囊再生的生理功能；微囊理想的直径是400μm。     

富含血小板血浆在医疗美容领域的应用进展

血小板是血液中的组成成分，其生理功能主要是止血、凝血并维持毛细血管的完整性等。富含血小板血浆（Platelet—Rich Plasma，PRP）是白体全血经离心分离、血小板含量高于普通全血4～8倍的浓缩血浆。因其含有多种高浓度的生长因子，这些生长因子相互协同作用，有促进组织再生、创面愈合、新生血管形成、减少瘢痕等作用，临床已有大量报道PRP应用于骨科、眼科、皮肤科、颌面外科、烧伤整形等学科取得了良好的效果。尤其近年来，随着组织工程、基因工程和干细胞培养等研究的深入和广泛的发展，有关PRP的应用发挥出了更大的优势，显示出独特的作用。PRP在医疗美容领域的研究和应用，也成为目前众多学者聚焦的热点。     

富血小板血浆对大鼠许旺细胞生物学行为的影响

目的 观察不同浓度的富血小板血浆(PRP)对体外培养的许旺细胞(SCs)增殖、分泌功能及迁移的影响,探讨其促进周围神经再生的可能作用机制. 方法 从SD大鼠心脏穿刺取血,利用二次离心法制备PRP,对全血和PRP中血小板计数和血小板源性生长因子BB (PDGF-BB)和转化生长因子(TGF-β1)浓度测定;取3～5d龄的大鼠坐骨神经培养纯化SCs,将P1细胞分为实验组与对照组分别进行处理,实验组以含40.0％、20.0％、10.0％、5.0％和2.5％ PRP的条件培养液干预,并设立空白对照组.于干预不同时间点采用CCK-8法测定SCs增殖活性情况,用实时荧光定量PCR方法检测细胞神经生长因子(NGF)和胶质细胞源神经营养因子(GDNF) mRNA表达的变化,ELISA检测SCs分泌NGF和GDNF的水平,Transwell小室检测各组SCs的迁移能力. 结果 PRP血小板回收率达65％,PDGF-BB和TGF-β1浓度明显高于血清(P＜0.01);与空白对照组相比,低于20 0％浓度的PRP呈浓度依赖性促进SCs增殖和迁移,而40.0％浓度组细胞增殖和迁移受到抑制;SCs分泌的NGF和GDNF和其mRNA表达均较对照组明显增加,同样在低于20.0％浓度的范围内呈现量效关系,40.0％浓度组则显示抑制作用.结论 PRP在适当浓度范围可以促进SCs的分裂增殖,合成分泌NGF和GDNF以及迁移的能力,具有潜在的促周围神经再生的作用.     

Induction of hair follicle regeneration in rat ear by mi-croencapsulated human hair dermal papilla cells

Objective: To induce hair follicle regeneration in rat ear by microencapsulated dermal papillae (DP) cells.Methods: Intact dermal papillae were obtained from human scalp follicles which were digested with collagenase I. The human hair DP cells were encapsulated with alginate-polylysine-alginate (APA) by a high-voltage electric field droplet generator. The diameters of the DP cell microcapsules were optimized by regulating the voltage, the distance be-tween the needle head and the solution surface and the injection speed. Then DP cell microencapsulations were xenotransplanted into ears of 20 SD rats with a novel method. One rat was killed every week at the postoperative 2-12 weeks and the implantation sites were biopsied for histo-logical observation.Results: The DP cell microencapsulations were found in a group of round, smooth and transparent microcapsules under a phase-contrast microscope. The optimal combina-tion of parameters to obtain 0.4 mm DP cell microcapsules was voltage 7.0 kV, injection speed 55 mm/h, and distance 10mm. After 4-12 weeks, 18 of 20 DP cell microcapsule implan-tations had produced high-density hair. Histological obser-vation indicated that both large follicles and sebaceous gland structures were formed in the rat ear within 3-12 weeks.Conclusions: These findings show that the DP cell microencapsulation maintain the capacity for initiating the follicle regeneration and can be considered as a substitute for fresh isolated dermal papillae.     

微囊化人头皮毛乳头细胞移植诱导毛发形成

目的探索微囊化人头皮毛乳头细胞（以下简称毛乳头细胞）对裸鼠背部皮肤毛囊形成的诱导作用。方法胶原酶消化法体外分离、培养毛乳头细胞，再将毛乳头细胞以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-polylysine—alginate，APA）微囊包裹，以胶原凝胶作为载体，植入裸鼠背部皮下；移植空囊、游离毛乳头细胞各作为对照。观察移植部位毛发生长情况，利用组织学方法观测所形成的毛囊结构。结果微囊化毛乳头细胞皮下移植4周后，裸鼠背部移植区有白色、浓密、分布均匀的毛发长出。局部组织切片见大量发育完整的毛囊结构；而空囊及游离毛乳头细胞移植均未能诱导出上述现象。结论聚集性生长的微囊化毛乳头细胞能够保持诱导皮肤毛囊形成的作用，且这种作用无种属特异性。     

HSPC011基因在人毛乳头细胞表达的生物学功能

目的 探讨HSPC011基因在人毛乳头细胞表达的生物学功能。方法 应用Nucleo-lector^TM基因转染技术，分别将质粒pCI-neo、绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N1、真核表达重组质粒pCI-neo／HSPC011转染人毛乳头细胞和3T3细胞，了解HSPC011基因表达对这些细胞生长特性的影响。结果 通过观察绿色荧光蛋白在人毛乳头细胞和3T3细胞的表达，发现Nucleofector^TM基因转染效率分别约为70％和30％。HSPC011基因在人毛乳头细胞表达后，细胞形态幼稚而类似于3T3细胞，但其凝集性生长特性保持不变；HSPC011基因表达对毛乳头细胞的增殖活性无明显影响。HSPC011基因转染3T3细胞后，对3T3细胞的生长特性无任何影响。结论 初步体外实验表明，HSPC011基因在毛乳头细胞表达可能具有调节细胞分化的作用。     

胚鼠真皮细胞辅助毛囊重建的实验研究

目的 探讨胚胎期真皮信号对体外扩增后的新生鼠真皮细胞毛发诱导能力的影响.方法 将胎龄14 d的胚鼠真皮细胞,加入到由体外扩增3d的新生鼠真皮细胞与新鲜分离的新生鼠表皮细胞在裸鼠背部构建的小室中,将其毛发再生情况与未添加胚鼠真皮细胞时做比较.同时,分别以下列细胞构建小室作为对照:胚鼠真皮细胞+新生鼠表皮细胞；新鲜分离的新生鼠真皮细胞+新生鼠表皮细胞；扩增的新生鼠真皮细胞；胚鼠真皮细胞；新鲜分离的新生鼠真皮细胞；新生鼠表皮细胞.结果 在胚鼠真皮细胞辅助下形成的毛发数量为(207±15.948)根,明显高于缺乏胚鼠真皮细胞辅助时形成的毛发数量(67±8.963)根,差异有统计学意义(n=3,t =7.653,P=0.002).结论 胚胎期真皮信号可使体外扩增后的新生鼠真皮细胞的毛发诱导能力得到更充分的发挥.     

微囊化人头皮毛乳头细胞体外培养及异种移植

目的探讨微囊化人头皮毛乳头细胞体外培养及异种移植的可行性,并对海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-polylysine-alginate,APA）微囊与海藻酸钠-BaCi2（barium-alginate,BA）微囊的物理、生物性能进行评价.方法采用“一步酶消化法”分离、培养人头皮毛乳头细胞,分别用APA微囊与BA微囊包裹.对两种微囊的生物相容性、机械强度、免疫隔离效果及微囊内细胞活性进行比较.结果APA微囊生物相容性优于BA微囊（P＜0.01）,但机械强度低于BA微囊（P＜0.01）;成囊后短期BA微囊内细胞活性高于APA微囊（P＜0.01）,但APA微囊内细胞活性增高较快（P＜0.05）.在微囊完整、表面无纤维化时,两种微囊均可起到良好的免疫隔离作用.结论微囊化人头皮毛乳头细胞可在体外及异种体内培养.综合评价APA微囊与BA微囊的利弊,在不同情况下选择不同的成囊方式是必要的.     

Experimental study on repairing of nude mice skin defects with composite skin consisting of xenogeneic dermis and epidermal stem cells and hair follicle dermal papilla cells

OBJECTIVE: To investigate the influence of hair follicle dermal papilla cells (DPCs) on biological features of composite skin. METHODS: In the test group, xenogeneic acellular dermal matrix was employed as the frame, DPCs were seeded on the subcutaneous side, and epithelial stem cells onto the dermal papilla side of the dermal frame so as to construct a composite skin. In the control group, there was no DPC in the frame. The two kinds of composite skin were employed to cover skin defects on the back of the nude mice. Wound healing was observed 4 weeks after grafting and area was analyzed and contraction rate was calculated. The tissue samples in the grafted area were harvested for HE staining and the state of the composite skin was observed. The stress-strain curve of the sampled skin was measured, so as to calculate the maximal breaking power of the sample. The data were collected and statistically analyzed. RESULTS: HE staining indicated that the epithelial depth was increased (more than 10 layers of cells) in test group, with only 6-7 layers in control group. The skin contraction rate in test group on the 4th week after skin grafting (3.94+/-0.013)% was much lower than that in control group (29.07+/-0.018)% (P<0.05). It was indicated by biomechanical test that the stress-strain curve of the composite skin in the test group was closer to that of normal nude mice skin in comparison to that in control group. The maximal breaking force of the composite skin in test group was (1.835+/-0.035)N (Newton), while that in control group was (1.075+/-0.065)N (P<0.01). CONCLUSION: Reconstruction of epidermis in composite skin was promoted by dermal DPCs seeded in the dermal matrix frame. As a result, there was less skin contraction in the composite skin with DPCs, so that the biological characteristics of the skin were improved.     

自体单株毛发移植修复女先天性无阴毛或阴毛发育不良

目的探索应用自体毛发单株移植修复女先天性无阴毛或阴毛发育不良的效果。方法对12例成年女性患者,均采用切取枕后区包含全厚皮肤与完整毛囊的条形头皮组织,在手术放大镜下,将头皮条全部分割成1个个单株毛发备用。用规格为0．9mm×38．0mm的针头穿刺打孔,将单株毛发移植到外阴部以增补稀疏的阴毛和扩大分布面积,每例移植400700个单株毛发,阴毛分布形态多选用倒三角形或菱形,密度为阴阜部阴毛按20株／cm^2植入,然后向外扩散密度逐步减小,最少不低于10株／cm^2。结果随访9个月至2年,植人毛发生长良好,阴毛形态及方向和分布范围均与正常接近一致,效果满意。均1次手术成功无需进行2次加密治疗,枕后供区切口瘢痕不明显。结论用毛发移植术补足阴毛,方法简便,创伤小,外形自然美观,是目前补充阴毛不足或无阴毛的理想方法。     

自体单株毛囊种植修复上唇胡须缺损

目的:探索应用自体单株毛囊移植修复上唇胡须缺损的效果。方法:对17例患者采用切取枕后安全区头皮条的方法或利用直径8mm的电动环钻获取毛发移植物,在3倍放大镜下制成单株移植物,并利用21或22G注射器针头穿刺打孔,然后用显微镊夹持毛干部,将毛发移植到缺损处以修复形态。结果:植入毛发生长良好,形态满意,移植毛发成活率在95%以上。结论:单株自体毛囊种植修复胡须缺损是一个适宜的方法。