靶向慢病毒载体RNA干扰小鼠血管内皮细胞异种抗原的研究

目的 使用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)方法抑制小鼠血管内皮细胞异种抗原半乳糖α1,3-半乳糖(Galα1,3-Gal)的表达.方法 经体外设计合成针对α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)mRNA的序列特异性小发夹RNA(shRNA),并构建携带α1,3-GT shRNA的重组慢病毒载体,以慢病毒感染小鼠血管瘤内皮细胞系EOMA细胞.采用荧光实时定量聚合酶链反应检测转染后的EOMA细胞α1,3-GT mRNA表达水平的变化;免疫荧光法和流式细胞术检测转染后的EOMA细胞异种抗原Galα1,3-Gal表达水平的变化.并将转染后的EOMA细胞与人血清混合培养,用四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞存活率.结果 成功获得携带α1,3-GT shRNA的成熟重组慢病毒颗粒,转染EOMA细胞效率可达75%.与空白对照组、空转染组以及阴性siRNA对照组比较,重组慢病毒转染EOMA细胞后,能有效抑制α1,3-GT的表达,抑制率为88%(P＜0.05);Galα1,3-Gal抗原表达水平明显降低(P＜0.05);而空白对照组、空转染组和阴性siRNA对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05).重组慢病毒转染后的EOMA细胞与人血清混合培养后的存活率较各对照组明显提高(P＜0.05).结论 成功构建靶向α1,3-GT基因的重组慢病毒载体,通过RNAi沉默α1,3-GT基因,抑制EOMA细胞异种抗原Galα1,3-Gal的表达,在体外实验中可减轻异种超急性排斥反应.     

猪到人异种移植超急性排斥反应的靶抗原

目的　探索猪到人异种移植超急性排斥反应的靶抗原。方法　对近年来国内、外有关文献进行检索 ,并作综述。结果　α半乳糖基 (α Gal)是目前公认的猪到人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,其表达受α 1,3半乳糖转移酶 (α 1,3GT)控制。克服α Gal引起的超急性排斥反应的方法有免疫吸附天然抗体、酶消化α Gal、α GT基因敲除及转基因技术等。除α Gal外 ,还存在与人血清中天然抗体相结合的其它抗原 ,如红细胞表面相对分子质量为 40× 10 3 的分子 ,猪胚胎脑细胞上相对分子质量为 2 10× 10 3 、10 5× 10 3 及 5 0× 10 3 的抗原分子等。结论　α Gal是异种移植超急性排斥反应的主要靶抗原 ,除α Gal外还存在有待进一步研究的非α Gal。     

转录因子诱骗性寡核苷酸转染猪血管内皮细胞抑制人补体介导的异种细胞毒作用

目的 探讨转录因子SP1诱骗性寡核苷酸(decoy ODNs)转染的猪血管内皮细胞对人血清补体介导的异种细胞毒作用的影响.方法 将培养的永生化猪血管内皮细胞系细胞株SV-40-PED分为3组.转染组:SV-40-PED转染了SP1 decoy ODNs;错配组:SV-40-PED转染了错配的decoy ODNs;空转染组:SV-40-PED仅用转染试剂oligofectamine作用.转染后26 h,采用细胞爬片免疫荧光技术、蛋白印迹法、逆转录聚合酶链反应及乳酸脱氢酶释放试验进行检测,分别观察各组SV-40-PED胞膜α-半乳糖残基(α-Gal)、蛋白质和α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)mRNA等表达的变化,以及转染了SP1 decoy ODNs的SV-40-PED对人血清补体介导的细胞毒作用的影响.结果 转染组SV-40-PED胞膜α-Gal的荧光表达明显减弱,部分胞膜可见点状荧光缺损,而空转染组和错配组仍可见明亮的绿色荧光.转染组蛋白表达水平均有不同程度的下降,相对吸光度(A值)仅为未转染组的52.6%.转染组α1,3-GT基因异构体1和2 mRNA的相对表达量分别为0.42±0.20和0.27±0.12,空转染组分别为0.72±0.17和0.50±0.19,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);错配组与空转染组相比,差异无统计学意义(P>0.05).体积分数为20%和40%的人血清对空转染组和错配组SV-40-PED均有不同程度的杀伤,而对转染组SV-40-PED的杀伤明显减弱(P<0.05).结论 经SP1 decoy ODNs转染的猪血管内皮细胞可以抑制人血清补体介导的异种细胞毒作用.     

小分子干扰RNA转染猪血管内皮细胞优化体系的建立

目的 探索建立高效、稳定的小分子干扰RNA(SiRNA)转染方案并建立优化的猪血管内皮细胞RNA干扰(RNAi)转染体系.方法 针对猪α1,3-半乳糖苷转移酶(α1,3-GT)基因合成数对SiRNA分子,运用不同转染体系(DOSPA、RiboJuice及Lipofectamine 2000)转染永生化猪血管内皮细胞系(PED).分别应用流式细胞术、台盼蓝拒染试验及乳酸脱氢酶释放试验评价干扰α1,3-GT作用下PED的α1,3-半乳糖残基(α-Gal)表达情况以及SiRNA-脂质体转染对PED生长的影响.结果 PED能有效发生特异性RNA干扰现象,且呈明显的剂量依赖性特征.SiRNA-1与脂质体RiboJuice在12 nmol/L∶6 μl时,干扰效果最佳(67.3%～89.5%),整体量效优于DOSPA及Lipofectamine 2000转染体系.靶细胞转染SiRNA-1后48 h时的α-Gal相对表达水平为10.5%,而SiRNA-2转染组则未见明显干扰现象.脂质体转染体系在转染后6～12 h对靶细胞生长稍有影响,24 h后细胞活性逐渐恢复.结论 猪血管内皮细胞存在RNA干扰机制,RiboJuice转染体系是一种高效、低毒的SiRNA转染方式,为研究RNAi在抑制异种排斥反应中的应用奠定了基础.     

中国近交系猪到人异种移植靶抗原研究

目的　研究人血清对近交系猪组织的结合情况及猪组织内 α-半乳糖残基 (α- Gal)的分布。方法　采取近交系中国版纳小耳猪 4头及近交系五指山猪 1头的心、肝、脾、肺、肾、胰、小肠、胸腺、皮肤、淋巴结及各级血管组织 ,分别以中国正常人 A、B、O和 AB型血清及 BSI- B4为一抗或亲和物 ,用亲和免疫组织化学方法观察各型人血清对上述各组织的结合和组织内 α- Gal的分布情况。并用 α-半乳糖基酶 (α- GT)消化后 ,重复上述实验。结果　两种近交系猪组织的血清结合及 α- Gal分布情况相似。A、B、O和 AB型血清与被测两种猪的各部位组织结合无明显差异 ,主要为各级血管内皮细胞及部分实质细胞。BSI- B4与血清结合的部位相似。软骨、外周神经、肌肉未见血清及 BSI- B4结合。经 α- GT消化后 ,人血清和 BSI- B4与两种猪组织的结合反应除少数部位存在差异外 ,反应消失。结论　对猪进行基因改造时可不考虑其抗原强弱及分布问题。α- Gal是近交系猪的主要靶抗原 ,但不排除存在 α- Gal以外的靶抗原 ,通过对近交系猪基因改造克服排斥反应是较好的策略。     

异种移植免疫排斥的研究进展

异种移植是解决人体器官严重短缺的重要思路.随着对异种移植排斥和人畜共患感染性疾病的深入研究,以及α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除猪的成功构建,以猪为供体的异种移植与临床应用之间的距离正在逐渐缩短.阻碍异种移植发展的主要障碍仍是免疫排斥反应.本文试就目前异种免疫排斥的研究进展进行综述,希望对未来的临床异种移植研究提供参...     

转人α-1,2岩藻糖苷转移酶基因在异种移植中的研究

目的 研究转人α-1，2岩藻糖苷转移酶基因（HT）在克服超急性排斥反应（HAR）中的作用。方法 通过脂质体转染将人HT基因转入猪血管内皮细胞（PIECs）中，利用显微注射建立转HT基因小鼠模型，经流式细胞仪检测转HT基因阳性的PIECs表面抗原及小鼠外周血单核细胞表面抗原的变化。结果 转HT基因的PIECs表面的α-1，3半乳糖（α-Gal）比阴性对照下降了50％～60％，H抗原由无表达到44％～78％表达阳性；转HT基因小鼠白细胞表面的α-Gal比阴性对照下降了63％左右，H抗原阳性表达率为95％以上。结论 HT基因在细胞和小鼠体内均有较好的表达，可减少异种抗原与异种抗体的反应，在克服超急性排斥反应中能发挥一定的作用。     

一种新的非Gal异种移植抗原——FAM234A的鉴定

目的探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原。方法用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴。将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的未知抗原。采用流式细胞术测定PAEC表面结合的猴抗猪细胞抗体的平均荧光强度(MFI),用以表示PAEC表面抗原的含量。利用慢病毒介导的短发夹核糖核酸(shRNA)敲减PAEC中的FAM234A基因,检测该细胞结合的猴抗猪细胞抗体含量是否减少,以确定该基因是否为潜在的移植抗原。结果 PAEC中的非Gal抗原能够在猴体内引发大量的猴抗猪细胞抗体。在GTKO小型猪的PAEC中用shRNA敲减FAM234A基因后,PAEC结合的猴IgG抗体减少。结论 FAM234A是一种新的非Gal异种移植抗原。     

转染人补体调节基因对猪血管内皮细胞的保护作用

供者血管内皮细胞(EC)是猪到人异种移植时引发超急性排斥反应的靶抗原的主要分布部位。利用转基因技术让猪的内皮细胞表达人补体调节基因(hDAF)，可能会增强其血管内皮细胞的防御能力，借以克服超急性排斥反应的发生，联合转染一种以上人补体调节蛋白基因可能效果更好。为此，我们进行了如下实验。     

转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞抗人血清溶破实验

目的研究转入α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因克服异种移植超急排斥反应(HAR)的作用。方法构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒,体外培养猪动脉内皮细胞(PAEC),脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染PAEC,新霉素(G418)筛选具有抗性的细胞克隆,PCR检测重组基因的整合,流式细胞术(FCM)检测转染细胞H抗原和异种抗原α—Gal表达。分别以未转染的PAEC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作对照。将转染细胞和正常细胞分别以20％、40％和60％人血清孵育2 h,比较溶破细胞百分数。结果重组质粒转染PAEC经筛选得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,FCM检测正常PAEC与转染PAEC,α-Gal平均荧光强度由1346．81降至194．44,H抗原平均荧光强度由9．10增至215．93;α—Gal M2区由99．98％降至37．180A,H抗原M2区由13．80％升至78．54％。转染细胞以人血清孵育后溶破细胞百分数较正常细胞降低,分别由(32．32±2．37)％、(59．54±4．56)％和(71．46±5．94)％降至(15．78±2．69)％、(30．16±1．46)％和(40．48±3．77)％,差异均有统计学意义(P值均<0．05)。结论转人HT基因PAECα—Gal表达明显降低,H抗原表达升高,对人血清溶破的耐受性增强。转人HT基因可以一定程度抑制HAR。     

高致敏肾移植供受者的HLA配型研究

目的　探讨人类白细胞抗原 (HLA)配型在高致敏受者肾脏移植中的临床意义。　方法　对 18例高致敏受者采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测体内预存的群体反应性抗体 (PRA IgG)水平及其特异性 ;采用补体依赖性细胞毒试验 (CDC)和微量序列特异性引物聚合酶链反应 (Micro PCR SSP)技术进行HLA I类和II类分型。　结果　 18例高度致敏受者的PRA IgG水平为 40 %～ 96 % ,平均 5 6 % ;供受者之间按传统的HLA A、B、DR抗原错配 (MM )原则 ,0～ 1MM者 5例 (2 8% ) ,2～3MM者 13例 (72 % ) ,而按交叉反应组 (CREGs)错配原则 ,0～ 1MM者 11例 (6 1% ) ,增加了 33 % ,而2～ 3MM者仅 7例 (39% ) ;肾移植术后仅 4例发生急性排斥反应 ,排斥发生率为 2 2 % ,经OKT3 治疗后逆转。　结论　CREGs配型可显著提高供受者的HLA配合率 ,良好的HLA配型对减少高致敏受者肾移植的排斥反应、提高移植物存活率具有重要临床意义     

慢性排斥移植肾浸润细胞亚群及TNFα和IL-2R原位表达

目的探讨移植肾慢性排斥的细胞免疫学机制。方法对１８例肾移植术后慢性排斥病人移植肾进行活检,采用免疫组化技术检测移植肾内浸润炎性细胞亚群及ＴＮＦα和ＩＬ２Ｒ原位表达。结果慢性排斥移植肾间质中呈明显的单核细胞／巨噬细胞和淋巴细胞灶样浸润伴纤维化和小管萎缩,浸润细胞组成分别为ＣＤ＋３细胞（４６８±１９．０）％,ＣＤ＋４细胞（２４１±１７３）％,ＣＤ＋８细胞（２７３±６９）％,ＣＤ＋１４细胞（３３４±１９６）％,ＣＤ＋１９细胞仅（３２±１９）％,以Ｔ淋巴细胞和巨噬细胞为主。移植肾中ＴＮＦα和ＩＬ２Ｒ表达较正常肾脏明显增强,且主要分布于移植肾间质浸润炎性细胞。结论慢性排斥移植肾内浸润淋巴细胞和巨噬细胞处于活化状态,可能通过产生和释放各种细胞因子发挥其生物学作用,从而介导细胞免疫损伤,认为细胞免疫可能在慢性排斥发病中起作用。     

胰肾联合移植术: 附19例报告

摘要：目的 探讨胰肾联合移植术中药物的应用方法，以取得良好的术后效果。方法 19例胰肾联合移植受者，术中用药如下；以白蛋白（清蛋白）作为主要血管扩容剂，平均用量为1.5~2.0g/kg；电解质溶液输注量为30~50mL/kg；用异搏定（5mg/12h）、前列腺素E1 （100μg/12h）以减少移植器官的保存损伤；用生长抑素（3mg/12h）抑制移植胰腺外分泌功能。结果 19例受者移植胰腺通血后5~10min分泌含高淀粉酶（平均为20 800U/L）的胰液，供肾血管开放后2~10min，输尿管有尿液流出。术后2~4d肾功恢复，术后1.5h至9d停用胰岛素。结论 胰、肾联合移植术中合理应用白蛋白、血管扩张剂和生长抑素对移植胰、肾功能有良好作用。     

肾移植患者血小板活化指标测定的临床研究

为探讨移植肾排斥反应与血小板活化指标的关系，应用抗人活化血小板ＧＭＰ－１４０（α－颗粒膜蛋白）特异单克隆抗体Ｓｚ－５１（苏州－５１），检测６８例肾移植患者外周血血小板表面及血浆ＧＭＰ－１４０含量；同时采用放射免疫法测定血浆ＴｘＢ２（血栓烷Ｂ２）含量。术后肾功能正常者ＧＭＰ－１４０及ＴｘＢ２略有升高；发生急慢性排斥反应时两者均显著升高（Ｐ＜０．００１），排斥逆转或移植肾切除后逐渐下降。发生环孢素中毒者其含量无明显变化（Ｐ＞０．０５）。提示移植肾排斥与体内血小板活化有关，活化指标ＧＭＰ－１４０、ＴｘＢ２检测对早期诊断肾移植后排斥反应及环孢素中毒具有一定的临床价值，是监测移植肾排斥反应的一个较灵敏的生物学指标。     

门、肠引流式胰肾一期联合移植5例报告

目的:总结胰腺内分泌门静脉引流、外分泌肠腔引流式（PE）一期胰、肾联合移植的临床经验。方法：对5例1型糖尿病并发尿毒症患者施行PE一期胰、肾联合移植术的临床资料及手术技术和非手术性并发症的预防进行回顾性分析。结果：5例手术均获成功，其中3例恢复良好，2例围手术期死亡，分别死于胰漏感染和FK506药物中毒。存活者术后3d血肌酐、尿素氮恢复正常;术后7d停用胰岛素，移植胰内、外分泌功能正常。结论：PE引流式胰腺移植在生理、代谢和免疫学等方面更具优势和合理性;PE式将是胰腺移植优先选择的术式;加强围手术期管理有助于减少术后并发症，取得良好疗效。     

Laparoscopy in transplantation.

BACKGROUND: Solid-organ transplantation has become the treatment of choice for patients with end-stage renal disease, end-stage liver failure, and some patients with type 1 diabetes mellitus. Similarly, surgical expertise and mechanical improvements have led to significant advances in laparoscopic surgery. Laparoscopic interventions are sometimes not pursued in transplant recipients due to the lack of strong supporting evidence for the use of laparoscopic techniques in these patients. METHODS: Using an extensive literature search, we review herein the available data on the utility of laparoscopic interventions in transplant recipients, with particular attention to the risks and benefits, indications, and contraindications for this complex patient population. RESULTS: Although randomized trials are few, multiple case reports indicate that many transplant recipients have benefited from laparoscopic interventions. CONCLUSION: The well-known benefits of laparoscopy could be extended to transplant recipients.     

肾脏移植术后应用OKT3治疗难治性排斥反应

对２６例肾脏移植术后出现难治性排斥反应而接受ＯＫＴ３治疗的患者，进行治疗前后ＩＬ－１，ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的监测。使用ＯＫＴ３治疗急性加速排斥反应的治愈率８８．９％，有效率为１００％；急性难治性排斥反应治愈率为６６．７％，有效率为７３．３％；慢性排斥反应无效。     

Evolution of pancreas transplant surgery

Background: Type 1 diabetes mellitus is a chronic condition often leading to disabling complications including retinopathy, neuropathy and cardiovascular disease which can be modified by intensive treatment with insulin. Such treatment, however, is associated with a restrictive lifestyle and risk of hypoglycaemic morbidity and mortality. Methods: This review examines the role of pancreas transplantation in patients with Type 1 diabetes mellitus. Results: Pancreas transplantation is currently the only proven option to achieve long‐term insulin independence, resulting in an improvement or stabilization of those diabetic related complications. The hazards of pancreas transplantation as a major operation are well known. Balancing the risks of a surgical procedure, with the benefits of restoring normoglycaemia remains an important task for the pancreas transplant surgeon. Pancreas transplantation is not an emergency operation to treat poorly managed and non‐compliant patients with debilitating complications. It is a highly specialized procedure which has evolved both in terms of the surgical technique, patient selection and assessment. Conclusion: Pancreas transplantation has emerged as the single most effective way to achieve normal glucose homeostasis in patients with Type 1 diabetes mellitus.     

50岁以上肾移植的临床分析

自１９８９年１月～１９９５年１２月共施行同种异体尸肾移植术５５６例次，其中５０岁以上患者１８２例（３２７％），对这些患者的临床资料进行比较分析。结果显示：５０岁以上组１、３、５年的人／肾存活率分别为８３４％／７９３％、７７１％／７１１％和５４５％／４５５％，与４９岁以下组比较差异无显著性（Ｐ＞００５），急性排斥发生率并不比４９岁以下组高，并发症发生率尤其是感染发生率及致死率均高于４９岁以下组（Ｐ＜００５）。本资料说明，年龄不是肾移植的主要影响因素，感染和心血管并发症是主要的死亡原因和影响长期存活的因素。适应证的选择和术前充分透析，术后合理应用免疫抑制剂，定期复查及心、肝、肺功能的监护，是提高高龄肾移植患者长期存活的主要因素。     

供肾体积及功能与术后移植肾功能的关系研究

目的 探讨供肾体积及功能与术后移植肾功能的关系.方法 对53例亲属活体肾移植供、受者术前的供肾体积及功能与受者术后平稳期移植肾功能的关系进行统计分析研究.结果 术前供肾体积与术后移植肾功能密切相关(r=0.539,p<0.01),其中供肾体积大于110 cm3者术后移植肾功能显著优于体积小者(81.19+16.5 vs 66.97+12.72 ml/min,p<0.01);术前供肾功能与术后移植肾功能存在一定的相关性(r=0.363.p<0.01).结论 术前供肾体积大小与功能状况是影响术后移植肾远期功能的重要因素.当患者有多个供肾来源时,应优先选择供肾体积较大及功能良好者,从而提高移植肾的远期存活率.