自体移植静脉平滑肌细胞凋亡与增殖关系的实验研究

目的 :探讨移植静脉狭窄的机制。方法 :建立 10 0只 Wistar大鼠自体颈静脉移植于肾下腹主动脉模型。应用 DNA原位缺口末端标记及免疫组织化学 SP法 ,检测术后 1～ 8周移植静脉平滑肌细胞的凋亡和增殖细胞核抗原的表达。结果 :术后 1～ 8周移植静脉平滑肌细胞凋亡及增殖均高于对照静脉 (P <0 .0 1) ;术后 1～ 2周 ,凋亡低于增殖 ,术后 4～ 8周凋亡高于增殖 ,凋亡与增殖具有相关性 (r=0 .813,P <0 .0 5 )。结论 :移植静脉平滑肌细胞凋亡和增殖失衡与移植静脉的狭窄有关 ,防治移植静脉狭窄应调节增殖与凋亡的平衡。     

大鼠自体移植静脉血管平滑肌细胞增殖与血浆内皮素变化关系的动态研究

目的 :研究自体静脉移植术后血浆内皮素 (ET)变化与移植静脉血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的关系。方法 :建立大鼠自体颈静脉移植于肾下腹主动脉动物模型 70只 ,于术后 3d～ 8周 ,采用放射免疫法检测血浆ET的变化 ,免疫组化法观察增殖细胞核抗原 (PCNA)在移植静脉VSMC中的表达和分布。结果 :术后 1～ 2周 ,血浆ET比术前明显增高 (P <0 .0 1) ;血浆ET与移植静脉VSMC增殖具有相关性 (r=0 .783,P <0 .0 1)。结论 :静脉移植术后测定血浆ET有助于反映移植静脉VSMC的增殖水平 ,为内膜增生的防治提供线索。     

缺氧诱导因子1α与Gax基因对自体静脉移植术后内膜过度增生的调控机制

自体静脉移植术后内膜过度增生是影响术后效果的重要原因,缺氧诱导因子1α(HIF-1α)与Gax基因可以抑制自体静脉移植术后内膜过度增生,可作为治疗移植静脉再狭窄的一个新手段,HIF-1α通过调控血管内皮生长因子的表达,对恢复血管内皮细胞的结构和功能起着重要的调节作用,而Gax基因通过影响细胞周期和诱导细胞凋亡两条途径来调节血管平滑肌细胞的增殖。     

新辅助化疗对乳腺癌细胞凋亡和增殖的影响

目的:探讨新辅助化疗对乳腺癌肿瘤细胞的凋亡和增殖的影响.方法:应用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)及免疫组化的S-P法,分别检测新辅助化疗组和对照组乳腺癌组织中肿瘤细胞的凋亡指数(AI)和乳腺癌肿瘤组织的Ki-67抗原表达.结果:新辅助化疗组肿瘤细胞AI均数为9.26%,比对照组肿瘤细胞AI均数3.36%明显增高(P＜0.01).新辅助化疗组肿瘤细胞Ki-67抗原过表达率为15.63%,比对照组Ki-67抗原过表达率50.0%低(P＜0.05).结论:新辅助化疗能诱导人体乳腺癌肿瘤细胞发生凋亡,并能抑制其增殖.     

局部缓释雷公藤内酯醇对移植静脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究经外膜缓释雷公藤内酯醇(Triptolide,TL)对自体移植静脉血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖和凋亡的影响.方法:健康家兔24只,建立颈外静脉-颈总动脉移植模型,随机分为3组,空白对照组:移植血管不给任何处理;F-127多聚凝胶对照组:在移植血管外膜喷洒含二甲亚砜(DMSO)0.1ml的20%F-127多聚凝胶0.5ml;实验组:在移植血管外膜喷洒携带TL300μg的F-127多聚凝胶0.5ml.术后2周取标本,组织形态学方法检测血管内膜增生程度,免疫组化检测标本中增殖细胞核抗原(PCNA)和bcl-2的表达情况,TUNEL法检测标本中VSMC凋亡的水平.结果:静脉移植2周后,与空白组和F-127对照组比较,局部应用TL300μg明显抑制血管内膜增生(P<0.05),PCNA、bcl-2的表达均显著减少(P<0.05),TUNEL阳性细胞显著增加(P<0.05).结论:经外膜缓释TL可以抑制移植静脉VSMC增殖和促进VSMC凋亡,从而抑制血管内膜增生.     

胃肠道间质细胞瘤p53基因表达与增殖、凋亡及血管形成的关系

目的研究胃肠道间质细胞瘤(GIST)中p53基因表达与增殖、凋亡及血管形成的关系.方法我们研究了86例GIST,采用免疫组织化学法检测p53基因表达,采用胶银及免疫组织化学法检测核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)、增殖细胞核抗原(PCNA)、抗人增殖细胞抗体Ki-67(Ki-67)来反映细胞的增殖,采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数(API)来反映细胞的凋亡,采用免疫组织化学法检微血管密度(MVD)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)来反映血管形成.结果 p53阳性、阴性表达组的AgNORs,pCNA和Ki-67表达分别为(5.96±2.05)、(3.35±1.48)(P＜0.01)、(24.14±6.15)、(8.11±3.12)(P＜0.01)、(8.46±2.14)、(2.36±1.12)(P＜0.01);p53阳性、阴性表达组的API分别为(5.74±3.15)、(15.12±7.89)(P＜0.01);p53阳性、阴性表达组的MVD、VEGF表达分别为(19.82±7.15)、(10.78±3.89)(P＜0.01)、68.09%、35.90%(P＜0.01).结论突变型p53基因能够促进GIST增殖、抑制凋亡、增加血管形成,与肿瘤的形成、发生与发展密切相关.     

核因子κB的小干扰RNA防治自体移植静脉再狭窄的实验研究

目的 探讨核因子κB(NF-κB)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对大鼠自体静脉移植术后血管内膜增殖及相应炎性细胞因子表达的影响.方珐雄性Wistar大鼠80只,随机分为空白组(A组,n=10);自体静脉移植组(B组,n=18);空载体组(阴性质粒脂质体医用蛋白胶复合物转染移植静脉,C组,n=26)和基因转染组(NF-κB siRNA阳离子脂质体医用蛋白胶复合物转染自体移植静脉,D组,n=26).B、C及D组需制作大鼠自体颈外静脉--腹主动脉移植模型,每组4个时点(3,7,14,21 d),相应时间点取移植静脉观察病理形态学变化,免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA),PCR测定单核细胞趋化因子(MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA含量,Western blot测定NF-κB p65蛋白的表达.结果 自体静脉移植术后,B、C和D组移植静脉血管桥均出现内膜增生变厚,新生内膜有大量PCNA阳性细胞,中膜平滑肌细胞增生活跃.术后3 d,B组和C组MCP-1mRNA及TNF-αmRNA表达水平明显高于A组(P<0.05),但D组水平明显低于C组(P<0.05).术后7 d,B、C组NF-κB p65蛋白表达水平明显高于A组(P<0.05),与C组相比,D组NF-κB p65蛋白水平明显降低(P<0.05).结论 NF-κB的基因表达产物和MCP-1mRNA、TNF-αmRNA的表达有一定相关性,自体静脉移植术后新生内膜增生及炎性细胞因子表达在不同时相点呈动态变化.转染NF-κB siRNA阳离子脂质体复合物可抑制NF-κB的表达,减少MCP-1及TNF-αmRNA的表达,从而抑制移植静脉内膜增生和VSMC增殖,减轻再狭窄.     

miR-614过表达抑制肺腺癌A549细胞增殖、侵袭及裸鼠移植瘤生长

目的:探讨miR-614过表达对肺腺癌A549细胞增殖、侵袭及裸鼠移植瘤生长的影响.方法:将培养至对数生长期的人A549细胞分为对照组、miR-NC组(脂质体转染miR-NC mimic)和miR-614组(脂质体转染miR-614 mimic).RT-qPCR检测每组A549细胞中miR-614的表达,CCK-8法检测每组A549细胞增殖活性;Transwell法检测检测每组A549细胞侵袭细胞数,Western Blot法检测每组A549细胞血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)和Ki-67蛋白的相对表达量.皮下种植0.2 mL各组A549细胞悬液(5 ×106/mL),构建裸鼠移植瘤的模型,每周测量1次移植瘤组织的体积,造模5周后进行移植瘤组织称重.结果:miR-614组A549细胞增殖活性和侵袭细胞数低于miR-NC组(P＜0.05),细胞VEGF、MMP-2和Ki-67蛋白表达低于miR-NC组(P＜0.05),TIMP-2蛋白表达高于miR-NC组(P＜0.05);miR-614组裸鼠移植瘤质量低于miR-NC组,且造模3周、4周和5周后,移植瘤体积低于miR-NC组(P＜0.05).结论:miR-614过表达可抑制A549细胞的增殖和侵袭,进而抑制肿瘤生长.     

细胞周期相关因子Gli2在大鼠自体移植静脉中的表达

目的 研究细胞周期相关因子Gli2在大鼠自体移植静脉中的表达变化及其与内膜增生的关系.方法 雄性Wistar大鼠36只,8周龄,体质量140 g.建立颈静脉-腹主动脉移植模型,分别于术后14 d、28 d各处死18只大鼠,取材移植血管,免疫荧光检测Gli2蛋白在移植血管新生内膜中的表达,Western印迹法观察Gli2及细胞增殖核抗原(PCNA)的表达,RT-PCR检测Gli2-mRNA的表达;以对侧颈静脉作为对照.结果 免疫组化结果显示,正常静脉、术后14 d和术后28 d移植静脉Gli2+细胞数比例分别为(3.2±0.4)%、(41.3±0.6)%和(58.3±0.6)%,正常静脉与移植静脉差异有统计学意义(P＜0.01).Western印迹法显示术后Gli2表达水平增加并与PCNA表达呈正相关(r=0.826,P＜0.01).RT-PCR结果显示术后14 d组和术后28 d组的Gli2 mRNA表达增加,分别为对照组含量的8.9和13.6倍.结论 自体静脉移植术后,Gli2在新生内膜中高表达并可能与细胞增殖相关.     

TUNEL法检测ER(-)乳癌细胞凋亡和Ki-67表达的研究

目的：探讨雌激素受体阴性乳癌细胞中Ki-67与细胞凋亡之间的关系。方法：通过1．25（OH）2D3诱发雌激素受体阴性乳癌细胞株MDA－MB－435s凋亡,采用MTT法检测细胞增殖情况,TUNEL法检测细胞凋亡指数,免疫组化法检测Ki-67阳性表达指数,进行相关性分析。结果：在10^-8mmol/L 1.25(OH)2D3诱发MDA－MB－435s凋亡过程中,肿瘤细胞 凋亡指数与Ki-67阳性表达指数呈负相关。结论：对凋亡指数及Ki-67阳性表达指数的综合分析,可全面反映细胞凋亡和增殖的平衡状态,对于判断肿瘤细胞的增生具有参考价值。     

移植静脉平滑肌细胞凋亡及相关基因表达与增殖关系的动态研究

目的 探讨移植静脉狭窄发生机制。方法 建立１００只Ｗｉｓｔａｒ大鼠自体颈静脉移植与肾下腹主动脉模型。采用透射电镜、原位ＤＮＡ片断末端标记（ＴＵＮＥＬ）和免疫组织化学法、检测移植静脉血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）凋亡及相关基因ｂａｌ－２、ｂａｘ蛋白和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达。结果 术后１￣８周,移植静脉ＴＵＮＥＬ及ＰＣＮＡ阳性ＶＳＭＣｓ多于对照静脉（Ｐ〈０．０１）;术后１￣２周为ＴＵＮＥＬ及Ｐ     

CDK2、CDK4基因与自体移植静脉内膜增殖的关系

[目的]了解CDK2、CDK4在大鼠移植血管的表达及对平滑肌细胞增殖的影响。[方法]Wistar大鼠50只,随机分为5组,建立自体静脉移植模型,分别于术后1、2、3、7及14 d取组织形态学观察,并用免疫组织化学和RT-PCR方法检测血管移植后不同时期CDK2、CDK4的表达情况,取正常静脉为对照组。[结果]移植后7 d,内膜厚度与管壁厚度接近高峰,与对照组及移植后1、2、3 d比较,差异有显著性意义(P<0.05)。免疫组织化学显示,移植静脉CDK2、CDK4阳性细胞在移植后2 d明显增加,7 d达到高峰,与移植后1 d比较,差异有显著性意义(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,CDK2、CDK4基因mRNA表达产量7～14 d达到高峰,与移植后1、2、3 d比较,差异有显著性意义(P<0.05)。[结论]CDK2、CDK4蛋白和mRNA表达在移植静脉早期开始增加,在7～14 d达到高峰。在移植静脉内膜增生过程中CDK2、CDK4表达可能起着一定的作用。     

Changes of Ca^2＋ activated potassium channels and cellular proliferation in autoge-nous vein grafts

Objective: To investigate changes of Ca2+ activated potassium channels ( KCa) in autogenous vein grafts. Methods: Contraction of venous ring was measured by means of perfusion in vitro. The intimal rabbits proliferation of vascular and proliferation of cultured smooth muscle cells ( vascular smooth muscle cells, VSMCs) were observed by the means of computerised image analysis and MTT method respectively. Furthermore, whole cell mode of patch clamp was used to record KCa of VSMCs isolated from autogenous vein grafts. Results: One week after transplantation there were no significant differences of contraction and intimal relative thickness between autogenous vein grafts and control. Contraction and intimal relative thickness of autogenous vein graft were significantly increased 2 weeks after transplantation (P < 0. 05 , n = 8 vs control) , and they was more enhanced 4 weeks after vein transplantation ( P < 0. 01 , n =8 vs control ). TEA( blocker of Ca2+ activated potassium channels) increased MTT A490 nm     

反义mTOR基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响

目的:观察反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因转染对移植静脉内膜增生的影响。方法:聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载制备纳米级粒子混合物。建立自体静脉移植模型,随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组转染纳米粒子包载的反义mTOR基因,空载体组转染纳米粒子包载的空载体,对照组不予特殊处理。分别于术后3、7、14、28d取材,常规HE、弹力纤维VG染色,RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot检测mTOR基因的mRNA及蛋白的变化,TUNEL法观察血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化。结果:转基因组内膜中mTOR蛋白产物表达较其他组明显减少(P<0.05);转基因组内膜增生程度在术后7、14、28d较其他组明显减少(P<0.01);转基因组凋亡细胞较其他组明显增高(P<0.05)。结论:反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生,促进VSMC的凋亡。     

纳米粒子介导的BMP-2基因转染对移植血管内膜增生的抑制作用

［摘要］ 目的：研究人骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因局部转染后,BMP-2基因蛋白过表达对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用,探讨防治移植静脉再狭窄的新途径。方法:以包载BMP-2基因的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的纳米级粒子混合物(BMP-2-PLGA)转染培养的兔VSMC,作为BMP-2-PLGA纳米粒子组,同时设空白PLGA纳米粒子组及对照组,MTT法测定细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期。建立自体静脉移植兔模型,随机分成转基因组、空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组,分别于术后3、7、14和28 d取出移植静脉,Verhoeff染色检测血管内膜厚度,Western blotting法检测BMP-2蛋白的表达,免疫组织化学法检测BMP-2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果：与对照组比较,BMP-2-PLGA纳米粒子组细胞发生明显的G1期阻滞(P<0.05),细胞增殖抑制率及细胞凋亡率增加(P<0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔血管内膜平均厚度明显减少(P<0.05),空白载体粒子组与单纯静脉移植对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔移植静脉组织BMP-2蛋白表达于术后3、7和14 d明显增多(P<0.05),PCNA表达于术后7～28 d明显降低（P<0.01）;空白粒子组与单纯静脉移植对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：BMP-2基因的表达能够有效抑制自体静脉移植后内膜增生及VSMC的增殖,促进体外培养VSMC的凋亡。
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RNA干扰沉默哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白基因表达对大鼠血管平滑肌细胞增殖活性及移植血管内膜增生的影响

目的 构建靶向哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因的RNA干扰表达载体,研究其对离体培养的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性及大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法 设计并合成针对大鼠mTOR基因的短发夹环RNA（shRNA）序列和对照序列,插入逆转录病毒载体pLXIN,转染包装细胞获得重组的病毒载体。感染VSMC,Northern杂交和免疫蛋白印迹检测mTOR及其下游底物4E-BPl和p70s6k表达的变化,流式细胞仪检测VSMC增殖周期的变化,MTT法检测VSMC增殖活性的改变。建立大鼠自体静脉移植模型54只,随机分成转基因组、对照组、空白对照组,术后7d、14d、28d取材,常规HE染色、免疫组织化学染色、免疫蛋白印迹检测mTOR表达,TUNEL法检测VSMC凋亡。结果 shRNA序列插入pLXIN载体,成功包装并且感染VSMC,证实针对mTOR基因的pLXIN-shRNA能够显著抑制mTOR表达,mTOR通路下游的p70s6k表达减少,而4E-BP1的表达却显著增加;被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0／G1期;局部感染移植血管能够显著减少mTOR基因的mRNA及蛋白质产物表达（均P〈0．01）,内膜增生程度亦较其他组明显减轻（P〈0．01）,凋亡细胞增多（P〈0．01）。结论 成功构建靶向mTOR基因的RNA干扰表达载体,沉默mTOR基因表达能够抑制VSMC分裂、分化和增殖,减轻内膜增生,增加VSMC凋亡。     

大鼠移植静脉重塑中Wnt5a表达的变化

 目的研究Wnt5a在自体移植静脉重塑过程中的表达变化。方法建立大鼠颈静脉-腹主动脉移植模型，分别于术后7、14、28d取材移植血管，采用免疫组化方法检测Wnt5a蛋白在移植血管中的表达，Real-timePCR定量检测Wnt5amRNA的表达；以对侧颈静脉作为对照。结果免疫组化结果显示：正常静脉、术后7、14、28d移植静脉Wnt5a阳性细胞比例分别为（4.67±0.21）%、（20.34±0.26）%、（35.25±0.20）%和（57.24±0.52）%，正常静脉与移植静脉之间差异有统计学意义（P<0.01）。Real-timePCR结果显示：术后7、14、28d大鼠Wnt5amRNA表达增加，分别为对照组的3.56、8.44和16.87倍。结论自体静脉移植后，Wnt5a在新生内膜及中膜中高表达，并可能与细胞增殖有关。     

大鼠自体静脉移植后内膜增生与平滑肌细胞增值

研究大鼠颈外静脉移植入颈总动脉后内膜增生（IH）的发病机制。应用组织切片的特殊染色，单克隆抗PCNA抗体及抗Dm抗体的免疫组化方法观察IH的发生过程。结果：①术后1d移植静脉的内膜消失，术后2d出现IH并逐渐增生，IH中可见大量平滑肌细胞（SMC），术后12周IH的面积与术后18周元显著差异；②IH中SMC的Dm呈阳性；③IH中SMC的PCNA指数于术后2d骤然升高，术后2周达高峰。结论：IH发生在移植术后2d，逐渐增厚至术后12周方停止，术后早期发生的IH是由中膜的SMC移行至内膜并增殖所致。SMC增殖的高峰在术后第2周。     

C-myc siRNA抑制大鼠自体移植静脉再狭窄的研究

目的静脉移植术后c-myc基因持续高表达是导致血管内膜增生进而再狭窄的原因之一。文中探讨通过局部给药方法给予针对c-myc基因的小分子干扰RNA(siRNA)对自体移植静脉内膜增生的影响。方法建立SD大鼠自体颈外静脉-颈总动脉移植模型。32只大鼠按移植静脉外膜局部给药不同处理方式方法分为未处理组(No treatment组)、凝胶组(Gel组)、无义序列组(scramble sequence group,SCR组)、c-myc RNA干扰组(C-myc siRNA组),于术后3周处死大鼠取移植静脉,光学显微镜下测量内膜厚度,免疫组化染色检测移植静脉增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、c-myc蛋白的表达,Q-RT-PCR检测移植静脉c-myc mRNA的含量。结果 C-myc siRNA组内膜厚度[(15.0±2.2)μm]显著低于No treatment组[(58.3±8.3)μm]、SCR组[(60.5±6.1)μm]和Gel组[(63.5±5.4)μm]。C-myc siRNA组静脉内膜区和中膜区PCNA阳性细胞率显著低于SCR组[分别为(8.4±2.2)%vs(68.5±5.0)%,P<0.05和(15.0±3.1)%vs(55.2±7.5)%,P<0.05],c-myc蛋白阳性细胞率C-myc siRNA组显著低于SCR组[(30.6±2.6)%vs(48.5±3.5)%,P<0.05]。C-myc siRNA组移植静脉中c-myc mRNA的表达相对量显著低于SCR组(0.48±0.05 vs 1.00±0.12,P<0.05)。结论C-myc siRNA能抑制移植静脉中平滑肌细胞的增殖,抑制内膜的增生,减轻移植静脉再狭窄程度。