The Application of Biotin-Avidin System in Double-Antibody Sandwich ELISA Method for Eosinophilia Cationic Protein

目的:评估生物素亲和素系统检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)双抗夹心ELISA试验中的应用.方法:建立直接包被抗体的检测法、先包被生物素的检测法和先包被亲和素的检测法,比较3种方法的灵敏度、不准确度和变异度,并用3种方法检测皮肤病患者和正常对照人群的ECP水平.结果:直接包被抗体的ECP检测法线性范围为2.5～200 μg/L,灵敏度为2.75 μg/L,不准确度为11.5％;先包被生物素的检测法线性范围为2.5～500 μg/L,灵敏度为2.61 μg/L,不准确度为10.9％;先包被亲和素的检测法线性范围为2.5～500μg/L,灵敏度2.68 μg/L,不准确度为11.9％;3种方法的重复性差异无统计学意义;先包被亲和素的检测法最稳定,直接包被抗体的检测法次之,先包被生物素的检测法最不稳定;3种方法及ADL双抗夹心检测试剂盒检测患者及正常对照者血清ECP水平,差异无统计学意义.结论:生物素亲和素包被可提高实验的灵敏度、线性范围,减少抗体用量,节约抗体包被时间.     

检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒的建立及应用研究

目的  建立特异、敏感的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒。方法  采用大肠杆菌菌体蛋白免疫家兔,制备得到高效价抗菌体蛋白抗血清。将经饱和硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和亲和层析纯化的兔抗大肠杆菌菌体蛋白特异性多克隆抗体作为包被抗体和检测抗体,用生物素标记检测抗体,并加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素。结果　建立的大肠杆菌菌体蛋白夹心ELISA检测方法的敏感性为0.32 μg/L,检测范围为1~100 μg/L,与国际同类商品化试剂盒相当。此法具有良好的稳定性,其批内变异系数小于7.7%,批间变异系数小于6.2%。结论  建立了特异、敏感、稳定的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒,为生物制品中残留大肠杆菌菌体蛋白的质量控制提供了一种重要的检测方法。     

原代地鼠肾细胞疫苗中残余宿主细胞蛋白检测方法的建立及初步验证

目的 建立定量检测原代地鼠肾细胞(primary hamster kidney cell,PHKC)疫苗中残余宿主细胞蛋白含量的方法 .方法 制备PHKC蛋白免疫家兔,对获得的抗血清进行纯化并标记辣根过氧化物酶,通过优化各反应条件建立ELISA方法 ,同时进行方法学验证.结果 ELISA检测方法的最佳包被抗体质量浓度为6 mg/L,酶标抗体工作浓度为1:2000,最佳检测区间为12.500～200.000μg/L,定量限度为23.250μg/L,准确度和精密度较佳.结论 建立了一种简单、准确、可靠检测PHKC病毒性疫苗中宿主细胞蛋白残留量的ELISA双抗体夹心法.     

AIB1蛋白双单克隆抗体夹心ELISA检测法的建立及初步应用

目的 建立双单克隆抗体夹心ELISA方法检测血清中AIB1的水平,探讨其在AIB1蛋白检测中的应用价值.方法 应用抗AIB1-C单克隆抗体4B9F12作为固相抗体,Biotin-1A2E1作为标记抗体,ELISA双抗体夹心法检测AIB1.构建及优化的内容包括:最适包被浓度、最适包被缓冲液、生物素标记抗体工作的浓度;鉴定的指标包括:敏感性、特异性、稳定性等.结果 使用0.05 mo·L-1碳酸盐缓冲液(pH9.6)为包被缓冲液,包被抗体4B9F12工作浓度为10μg·mL-1,Biotin-1A2E1工作浓度选择1∶500;采用双抗体夹心法检测外周血中AIB1的特异性和敏感性均较高.结论 抗AIB1双抗体夹心ELISA方案的构建、鉴定达到了预期目的 ,为临床研究奠定了基础.     

检测黑猩猩腺病毒68型抗原的双抗体夹心ELISA的建立

目的  建立定量黑猩猩腺病毒68型（chimpanzee adenovirus type 68，AdC68）含量的双抗体夹心ELISA，并验证其可行性。方法  用表达绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的非复制型AdC68（AdC68GFP）感染HEK293细胞，收获病变细胞并进行超速离心纯化AdC68GFP。用纯化AdC68GFP免疫家兔制备抗AdC68GFP抗体。以抗AdC68GFP抗体为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的抗腺病毒HEXON IgG为酶标抗体，建立双抗体夹心ELISA，确定该法的线性范围，并验证该法的准确度、精密度、专属性和适用性。结果  纯化AdC68GFP的蛋白浓度为38.8 µg/ml，其中HEK293细胞的蛋白浓度低于0.3 µg/ml。双抗体夹心ELISA的最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为1∶50和1∶500。该法的线性范围为0.06~3.88 µg/ml，线性相关系数为0.999 6。高、低浓度AdC68GFP样品的回收率分别为93.17%和94.33%，变异系数分别为6.72%和3.44%。该法可特异性检测AdC68GFP抗原，未发现与HEK293细胞蛋白发生交叉反应。应用该法检测AdC68GFP纯化过程中的样品可反映病毒的纯化效果。结论  建立的双抗体夹心ELISA具有良好的准确度、精密度和特异性，可用于AdC68纯化工艺过程中对病毒蛋白含量的快速检测。     

流式微球分析技术联合检测血清MMP-9、MPO CD40L和t-PA的方法学建立及评价

目的 建立流式微球分析技术联合检测人血清中基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、髓过氧化物酶(MPO)、CD40配体(CD40L)、血浆纤溶酶原激活物(t-PA)的方法并对其进行系统性评价.方法 分别将四种选择好一定浓度的捕获抗体(MMP-9、MPO、CD40L和t-PA鼠抗人单克隆抗体)包被在四种已激活的不同荧光强度编码的羧基化聚苯乙烯微球上,用棋盘法对试验条件进行优化选择,并应用CLSI的有关规则进行方法学评价.结果 反应体系中四种鼠抗人单克隆抗体最佳加入量为10 μg,最佳生物素标记抗体浓度为1∶4000倍稀释,最佳反应时间为2h,亲和素最适孵育时间为1h.MMP-9线性范围是0.20～333.33 ng/mL,批内变异系数为4.60％～8.80％,批间变异系数为8.80％～9.60％,准确度相对偏倚为2.80％～3.18％,回收率是94.8～102.50％,灵敏度为0.20 ng/mL;MPO线性范围是0.26～111.11ng/mL,批内变异系数为5.90％～7.70％,批间变异系数为9.10％～11.40％,准确度相对偏倚为1.44％～4.12％,回收率是97.8～103.2％,灵敏度为0.26 ng/mL;CD40L线性范围是0.32～111.11g/mL,批内变异系数为5.40％～6.50％,批间变异系数为8.90％～12.40％,准确度相对偏倚为2.72％～5.95％,回收率是97.20～105.30％,灵敏度为0.32 ng/mL;t-PA线性范围是1.21～111.11 ng/mL,批内变异系数为2.20％～2.90％,批间变异系数为6.30％～12.20％,准确度相对偏倚为1.23％～4.60％,回收率是97.20～101.30％,灵敏度为1.21 ng/mL.高浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对四种因子有一定的干扰率,低浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对三种因子干扰较小.分别与ELISA方法比较无显著差异.结论 自建的MMP-9、MPO、CD40L和t-PA1流式微球联合检测技术,可拓展流式细胞分析技术,值得临床推广使用.     

妊娠相关血浆蛋白A定量测定方法的建立

目的:建立人外周血妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)定量酶联免疫测定方法.方法:以生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素间接包被微孔板,将标记有生物素的抗PAPP-A抗体作为捕获抗体,结合标本中的抗原成分;标记有辣根过氧化物酶的抗PAPP-A抗体作为检测抗体,经酶催化底物显色,定量测定人体外周血PAPP-A.结果:所建立的测定方法灵敏度为0.31 mg/L,回收率均在95%～100%之间;该方法线性、稳定性及特异性良好;3份低、中、高浓度的血清标本重复测定10次,批内变异系数(CV)均小于10%,批间CV均小于15%;该方法测量结果与国外同类方法测量结果具有相关性(r=0.982,P<0.05),2种检测方法高度相关.结论:本文采用间接包被技术所建立的人外周血PAPPA固相酶联免疫测定方法灵敏、可靠、稳定性好,与国外同类方法的试剂盒之间相关性较高.     

用ELISA法测定基因转殖酵母菌发酵液中生物素

目的:采用一种简便、高灵敏度、高准确度的ELISA方法,对基因转殖可制造生物素的酵母菌发酵液中生物素含量的直接定量。方法:采用猪肺炎霉浆菌包被酶标板,再依次结合兔抗猪肺炎霉浆菌血清及生物素化羊抗兔IgG,形成生物素的固定相,用竞争抑制法测定生物素含量,各步实验条件均经优化。结果:测定的线性范围为 50～2 000ng/L,灵敏度I C_(50)=410ng/L,检测限为83 ng/L,线性相关系数r=-0.990;样品液1:1000稀释后,可消除基质效应的影响直接测定,加标平均回收率为101.13％。结论:用本文ELISA法测定基因转殖酵母菌发酵液中生物素的方法简便,结果可靠。     

应用欧(鼠平)单克隆抗体进行的生物素-链霉亲和素放大的免疫测定法检测汉坦病毒的敏感性

作者用抗汉坦病毒核蛋白(N)特异性欧(鼠平)单克隆抗体(McAb),通过生物素-链霉亲和素放大的双抗体夹心ELISA,检测细胞培养物和动物组织中的普马拉(PUU)病毒和汉坦病毒抗原.病毒(除kazan株外)均在     

TNF-α/hs-CRP双标记时间分辨荧光免疫法用于脓毒症早期筛查诊断的研究

目的 建立一种双标记时间分辨荧光免疫法（TRFIA）用于定量检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和超敏C-反应蛋白（hs-CRP）水平。方法 将抗TNF-α和hs-CRP单克隆抗体包被在96孔板,制备铕（Eu³⁺）和钐（Sm³⁺）检测抗体偶联物,建立双抗体夹心TRFIA法并组装成试剂盒,评价此试剂盒的灵敏度、线性范围、加标回收率和各项检测性能。结果 建立了TRFIA检测血清TNF-α和hs-CRP水平的新方法并组装成试剂盒,此试剂盒对TNF-α检测的线性范围为0~100 ng/L,灵敏度为0.05 ng/L,对hs-CRP检测的线性范围为0~100 mg/L,灵敏度为0.02 mg/L;对TNF-α检测的加标回收率92.00%~107.00%,对hs-CRP检测的加标回收率95.00%~106.82%,与其他常见的血清干扰物质无明显的交叉反应;对TNF-α检测的批内CV 4.57%~9.24%,批间CV 5.13%~9.27%;对hs-CRP检测的批内CV 3.57%~7.69%,批间CV 6.07%~10.00%;试剂盒能够在4 ℃稳定保存6个月,37 ℃下可稳定保存7 d以上。TNF-α的检测阈值为0.44 ng/L,hs-CRP的检测阈值为1.41 mg/L。该试剂盒检测判定结果与临床情况相一致,符合率100%。结论 双标记TRFIA法可定量检测TNF-α和hs-CRP水平,具有灵敏度和准确度高、特异性强、方便快捷等优点,可为脓毒症临床样品的早期筛查、疗效评价和预后评估提供一种新的检测方法。     

诱导痰嗜酸性粒细胞阳离子蛋白对支气管哮喘的诊断价值

目的：通过检测支气管激发试验阳性患者诱导痰中嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）水平,探讨ECP对哮喘的诊断价值.方法：选取呼吸内科以咳嗽3周以上就诊的患者,共300例,进行支气管激发试验检查.通过ELISA法检测所有支气管激发试验阳性患者诱导痰的ECP水平,根据最后追踪最终确诊为哮喘的患者,用ROC曲线统计分析得出哮喘患者ECP水平与激发试验阳性的临界值.结果：激发试验阳性患者最后确诊为哮喘组的ECP水平为226.6±30.8 μg/L,激发试验阳性患者非哮喘组ECP水平为61.0±22.2 μg/L,2组比较有极显著性差异（P＜0.01）;诱导痰ECP水平对支气管哮喘诊断的最佳临界值为186.05 μg/L,该切点的灵敏度为0.938,特异度0.895,Youden指数0.833.结论：ECP水平能作为气道高反应诊断的评价指标,有助于对支气管哮喘的诊断以及鉴别诊断.     

A biotin-avidin labeled enzyme immunoassay for the quantitation of serum TSH using protein-layered solid phase

A sensitive enzyme immunoassay for serum TSH has been developed utilizing the tight binding between biotin and avidin, and three layered protein polystyrene beads as solid phase. To increase binding capacity of TSH and sensitivity of the assay, the polystyrene beads were coated sequentially with mouse immunoglobulin as first layer, rabbit antimouse immunoglobulin as second layer and monoclonal anti-TSH as third layer. A serum sample was incubated simultaneously with a monoclonal anti-TSH immobilized polystyrene beads and a second monoclonal anti-TSH covalently attached to biotin. After washing, the antibody bound serum TSH-anti-TSH-biotin complex is reacted with horseradish peroxidase (HRP)-labeled avidin. Following a second wash, the bound HRP activity was measured colorimetrically. Reproducible results were obtained within 4 hours for serum TSH in the range between 0 μIU/ml and 50 μIU/ml with detection limit of 0.1 μIU per test.     

海洋真菌多糖间接竞争ELISA检测方法的建立及方法学评价

目的建立酶联免疫吸附法(ELISA)以检测海洋真菌多糖YS4108发酵过程中抗肿瘤多糖(YCP)的含量。方法以CDAP(1-氰基-4-二甲胺吡啶四氟硼酸盐)为交联剂制备YCP-BSA偶联产物,利用该偶联产物为包被抗原,YCP为竞争抗原,两者与定量的YCP-McAb反应,建立检测YCP的间接竞争ELISA测定法。结果最佳抗原包被浓度为2.5 mg/L,最佳单抗工作浓度为1∶5 000,HRP-抗小鼠IgG工作浓度为1∶4 000。得到回归方程lg(B/B0%)=-0.171 8 lgCYCP+1.963 8,r=0.991 6,可测量最适范围为1~1 000μg/L,最小检测量为0.1μg/L,批内和批间RSD分别小于5.45%和8.37%。结论建立了快速测定YCP含量的间接竞争ELISA法。     

CC反应蛋白荧光免疫层析定量检测试剂的研制及性能评价

目的旨在建立一种人CRP荧光免疫层析快速定量检测试剂。方法采用双抗体夹心法,以羧基荧光微球标记的抗人CRP单克隆抗体及羊抗兔IgG为标记抗体,另外一株抗人CRP单克隆抗体作为检测线,制备荧光免疫层析试纸条。结果研制的检测试剂盒检测限为0.12 mg/L,CV≤15%,线性范围(0.5~200)mg/L;对223份临床样本进行测试,经配对t检验分析,t=-0.155,P=0.877,与对照试剂性能无显著性差异。结论本研究研制出了一种操作简便、快速的CRP POCT定量检测试剂。     

Preclinical pharmacology and safety of a novel avidin derivative for tissue-targeted delivery of radiolabelled biotin

Abstract: We recently described an oxidized avidin variant, named AvidinOX^®, which is a product that chemically links to tissue proteins while maintaining the capacity to uptake intravenously administered biotin. Such product proved to be successful in targeting radionuclide therapy in a mouse model of inoperable breast cancer. Here, we show that the uptake of a single or multiple doses of biotin (up to five times), by the tissue‐bound AvidinOX^®, is stable for 2 weeks. Taking into account that oxidized avidin is the first chemically reactive protein to be proposed for clinical use, we evaluated its tolerability, immunogenicity and mutagenicity. Present in vitro data indicate that AvidinOX^® (up to 10 μg/5 × 10⁵ cells) does not affect cell viability or proliferation of PC3 human prostate cancer or 3T3 mouse fibroblast cell lines as well as primary mouse spleen cells. Safety pharmacology and toxicology studies were conducted using AvidinOX^® up to the highest concentration compatible with its solubility (about 12 mg/mL), representing four times the product concentration intended for human use, and in the maximum administrable volume compatible with each study system. The intramuscular administration in rat and monkey induced a moderate to strong inflammatory response particularly after a second administration and consistently with the induction of an immune response. Interestingly, the intramuscular administration of AvidinOX^® to rodents and monkeys exhibiting very high anti‐avidin antibody titres was well tolerated with no systemic symptoms of any kind. Intravenous administration of AvidinOX^®, performed to mimic an accidental injection of the dose intended for a local administration (15 μL of 3.3 mg/mL solution), showed significant localization of the product into the spleen not associated with uptake of the radiolabelled biotin intravenously injected after 24 hr, thus suggesting rapid inactivation. No mutagenic activity was induced by oxidized avidin in prokaryotic and eukaryotic cells. Overall, the present data indicate that AvidinOX^® is well tolerated in rodents and non‐human primates, thus supporting its clinical use within protocols of radionuclide therapy of inoperable tumour lesions.     

Beagle犬血浆中尼莫地平的HPLC法测定及其药动学

建立了HPLC法测定Beagle犬血浆中尼莫地平的含量,并研究了6只健康Beagle犬一日两次口服60 mg尼莫地平缓释片后的药动学.血浆样品经液-液萃取后测定,采用C18色谱柱,以乙腈-0.08mol/L乙酸铵(60:40)为流动相,检测波长358nm.尼莫地平在2.5～60μg/L浓度范围内线性关系良好,最低定量限为2.5μg/L,日内和日间 RSD均小于10%.主要药动学参数为:t1/2(5.6±0.7)h,c(39.0±3.6)μg/L,tmax(4.5±1.2)h,AUCo-t(626.0±34.0)μg·h·L-1,AUC0-∞(680.2±42.9)μg·h·L-1.     

孟鲁司特钠与布地奈德对血清ECP、IL-8的影响及其对毛细支气管炎的疗效比较

目的:分析孟鲁司特钠与布地奈德对毛细支气管炎患儿血清嗜酸粒细胞阳离子蛋白(ECP)、白细胞介素-8(IL-8)的影响,比较二者对毛细支气管炎的疗效。方法:选取我院确诊的毛细支气管炎患儿100例,随机分为A组(孟鲁司特钠口服)和B组(布地奈德雾化)各50例,监测孟鲁司特钠和布地奈德干预前后血清ECP、IL-8水平,并随访治疗后1年的复发情况。结果:A组ECP浓度从干预前(19.15±13.34)μg/L降至干预后(9.58±5.21)μg/L,B组ECP浓度从干预前(20.47±12.21)μg/L降至干预后(5.15±4.01)μg/L。干预前两组ECP比较差异无统计学意义(t=1.002,P>0.05);干预后A组ECP显著低于B组,两组比较差异有统计学意义(t=3.396,P<0.01)。干预后两组IL-8均明显下降,但组间比较差异无统计学意义(干预前t=1.479,干预后t=0.187,P均>0.05)。结论:A组治疗后患儿血清ECP下降更明显,复发率更少,说明孟鲁司特钠比布地奈德能更有效地治疗毛细支气管炎。