广西眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化及体外抗血小板聚集作用

目的 从广西眼镜蛇粗毒中分离纯化L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO),并对其物理、生化性质及体外抗血小板聚集作用进行研究.方法 用Sephacryls-200凝胶过滤,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换,CM-Sepharose CL-6B离子交换层析法分离纯化广西眼镜蛇毒中的LAAO,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在还原与非还原条件下测定其蛋白分子量,等电聚焦法测定等电点,比浊法测定广西眼镜蛇LAAO对二磷酸腺苷、胶原、凝血酶、花生四烯酸引起的血小板聚集率的影响.结果 从广西眼镜蛇毒中分离出的LAAO分子量约为55.2 KD,等电点为7.6;生物活性检测发现,该蛋白不具有磷脂酶A2和精氨酸酯酶活性,无纤溶及出血活性,能明显抑制二磷酸腺苷、胶原、凝血酶、花生四烯酸引起的血小板聚集,并呈明显的正相关.结论 分离纯化的广西眼镜蛇毒LAAO为电泳纯,并具有较强的抑制体外血小板聚集作用.     

金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达及其生物活性研究

 目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)基因,获得重组SEE蛋白(rSEE),并对rSEE进行生物活性分析。方法通过PCR从金黄色葡萄球菌FR1326菌株基因中得到肠毒素SEE的成熟肽基因,将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化,通过MTF法研究其生物活性。结果成功构建了SEE的表达载体,并得到高纯度的重组蛋白。MTY法结果表明,rSEE具有良好的促淋巴细胞增殖的能力以及肿瘤细胞的杀伤活性。结论具超抗原活性和高纯度的rSEE,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制,构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。     

精制抗眼镜王蛇毒血清的制备

 目的研制抗眼镜王蛇毒血清,以解决被眼镜王蛇咬伤后的救治问题。方法以眼镜王蛇毒为免疫原免疫马获得免疫血浆,经盐析制备IgG,IgG再经酶解、疏水柱纯化后得到F(ab′)₂活性片段,并以免疫扩散、ELISA测定其抗体特异性,以小鼠实验法测定其中和眼镜王蛇毒能力。结果得到的抗血清F(ab′)₂冻干品纯度达90%以上。结论研制出了特异性强、效价高的抗眼镜王蛇毒血清。     

基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

 目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×10³);重组pMAL-p2表达出51.0×10³的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。     

以人表皮生长因子受体2为靶点的强化融合蛋白LDP-Hr-AE的构建及抗肿瘤活性研究

 目的 制备一种以人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）为靶点的由抗体重链超变区多肽与力达霉素组成的强化融合蛋白LDP-Hr-AE,并初步探讨其抗肿瘤活性。方法 通过聚合酶链式反应扩增出抗人表皮生长因子受体2抗体C6.5重链CDR3区的20个氨基酸残基基因,将其与力达霉素辅基蛋白基因连接构建出融合蛋白基因ldp-Hr,转化至大肠杆菌中进行诱导表达。融合蛋白LDP-Hr采用HisTrap Ni²⁺亲和色谱柱进行分离纯化,高效液相色谱法检测其纯度。细胞免疫荧光法和基于流式细胞术的亲和实验分析融合蛋白与肿瘤细胞的结合活性。纯化的LDP-Hr蛋白与力达霉素发色团在体外进行组装,构建出强化融合蛋白LDP-Hr-AE。采用MTT法检测强化融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性,Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术的方法检测LDP-Hr-AE蛋白对细胞凋亡的影响。结果 成功构建并表达了融合蛋白LDP-Hr,目的蛋白以可溶形式分泌至大肠杆菌培养液和周质腔中,产量可达每升发酵液40 mg活性蛋白,纯化后的蛋白经高效液相色谱法检测纯度为97.4%。细胞免疫荧光实验和基于流式细胞术的亲和实验检测结果均显示LDP-Hr蛋白与HER2高表达的肿瘤细胞系（如SK-BR-3和SK-OV-3细胞）都有很强的结合活性。LDP-Hr蛋白与力达霉素发色团在体外组装后经高效液相色谱法检测350 nm处出现特定吸收峰,表明强化融合蛋白LDP-Hr-AE构建成功。采用MTT法检测了强化融合蛋白的体外杀伤活性,结果显示,LDP-Hr-AE对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,且其杀伤活性要高于力达霉素。细胞凋亡检测结果也表明LDP-Hr-AE在极低的浓度下（如0.1 nmol·L^-1）即可强烈的诱导细胞发生凋亡,且凋亡的比率随着蛋白浓度的升高而增加。结论 本实验制备的强化融合蛋白LDP-Hr-AE可以特异的与人表皮生长因子受体2结合,对肿瘤细胞具有强烈的杀伤活性和诱导凋亡能力,具有发展为抗肿瘤靶向药物的潜能。     

重组人胰岛素样生长因子-1分离纯化工艺的建立

目的：建立重组人胰岛素生长因子－1（rhIGF-1)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法：已构建好的表达载体转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导进行表达，将离心收集到的菌体用超声破壁，破壁菌液离心分离，收集上清液，进行阴离子交换层析，疏水层析和分子筛纯化，得到最终纯品，蛋白纯度用SDS－PAGE鉴定，ELISA法检测rhIGF-1含量，检测纯化后重组蛋白的生物学活性。结果：用大肠杆菌BL21表达rhIGF-1以可溶性形式存在胞浆中，经3步rhIGF-1分离纯化工艺，其工艺流程可获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1，为产业化及临床应用奠定基础。     

广东眼镜蛇毒的柱层析分离及其组份的酶活力测定

应用柱层析法分离眼镜蛇毒,对各组份进行了蛋白水解酶、胆碱酯酶和磷脂酶A活力测定。结果表明,广东产的眼镜蛇毒与湖南产的眼镜蛇毒各组份三种酶活力的分布有所不同。     

梅花鹿基质金属蛋白酶-13催化域的原核表达和活性分析

目的利用基因工程技术体外表达梅花鹿基质金属蛋白酶-13(MMP-13)催化域并初步探讨其活性,为进一步研究鹿茸再生和快速增长机制奠定基础。方法从梅花鹿鹿茸转录组数据中获得cd MMP-13基因序列,通过运用PCR方法获得了编码催化域(cd MMP-13)的c DNA序列,构建重组质粒p ET28a-cd MMP-13后,转化大肠杆菌,利用IPTG诱导蛋白表达并纯化蛋白,表达产物经复性后鉴定酶活性。结果表达产物为21 KDa的融合蛋白且具有明显明胶酶活性。结论体外表达的具有催化活性的融合蛋白可为研究鹿茸快速生长和再生机制提供材料和基础。     

大肠杆菌K88-LTB在原核细胞中的高效表达

利用PCR技术, 从大肠杆菌中扩增出不含信号肽序列的K88基因和LTB基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中, 构建了原核表达载体pQE30-K88-LTB,并转入大肠杆菌中。诱导后,蛋白电泳分析结果显示,目的蛋白获得高效表达。经蛋白印记检测表明,表达的蛋白能与大肠杆菌阳性血清和重组蛋白抗血清发生特异性反应。     

广西眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶对血小板聚集、释放及超微结构的影响

目的研究广西眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO)对人体外血小板聚集、释放及超微结构的影响。方法比浊法测定广西眼镜蛇毒LAAO对二磷酸腺苷(ADP)、胶原、凝血酶、花生四烯酸(AA)引起的血小板聚集率的影响,双抗夹心放免法测定GMP-140含量,并观察血小板超微结构。结果广西眼镜蛇毒LAAO剂量能明显抑制二磷酸腺苷(ADP)、胶原、凝血酶、花生四烯酸(AA)引起的血小板聚集,并呈明显的正相关;明显降低凝血酶诱导的血浆GMP-140水平,减轻血小板超微结构的损伤程度。结论广西眼镜蛇毒LAAO能明显抑制二磷酸腺苷(ADP)、胶原、凝血酶、花生四烯酸(AA)引起血小板聚集、降低凝血酶引起的血小板释放功能,减轻血小板损伤。     

北葶苈子GGPS基因的克隆、序列分析与原核表达

目的:获得北葶苈子(Lepidium apetalum)中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)的编码基因,进行生物信息学分析,在大肠杆菌中表达该蛋白。方法:根据北葶苈子转录组测序结果中的GGPS基因序列,设计特异性引物,通过PCR扩增得到北葶苈子GGPS的c DNA序列,进行TA克隆、测序及序列分析,构建原核表达载体并于大肠杆菌中表达北葶苈子GGPS蛋白。结果:得到北葶苈子GGPS c DNA全长1 146 bp,编码381个氨基酸;序列分析表明北葶苈子GGPS基因编码的氨基酸序列包含类异戊二烯合成酶结构域,氨基酸序列进化关系表明北葶苈子GGPS与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白芥(Sinapis alba)亲缘关系最近;成功构建了p ET-32a-La GGPS原核表达载体,并在大肠杆菌BL21菌株中成功诱导表达。结论:首次克隆得到北葶苈子GGPS基因,并在大肠杆菌中成功表达了北葶苈子GGPS蛋白,为纯化该蛋白并研究其结构和功能奠定了基础。     

342bp人骨形态发生蛋白2成熟肽基因的克隆表达

目的探讨克隆人骨形态发生蛋白2(hBMP2)成熟肽的最精简的基因序列并原核表达方法。方法剔除所有信号肽和中间前肽的非必需基因序列,以RT-PCR方法克隆扩增出hBMP2的342 bp的成熟肽基因片段,将其与原核表达载体PBV220酶切后相连接并测序,构建PBV220-hBMP2的真核基因原核表达系统,在DH5α大肠杆菌下扩增并温度诱导表达hBMP2蛋白质,SDS-PAGE检测表达蛋白。结果RT-PCR扩增出hBMP2的成熟肽基因342 bp片段与Genbank公布的序列完全一致,且经DNA电泳和蛋白电泳鉴定,构建PBV220-hBMP2原核表达系统可导入DH5α大肠杆菌,并在温度诱导下表达出约16 kD的蛋白条带,诱导培养4 h后的蛋白表达量达到最高峰。结论成功扩增342 bp的成熟肽hBMP2基因片段能在原核大肠杆菌上有效表达生产hBMP2蛋白质。     

源于鲨鱼肝的一种新基因的克隆表达及其对肝肿瘤细胞的抑制作用

目的：从鲨鱼肝脏中克隆表达一种新基因psll2，纯化该基因的表达产物，研究其对肝肿瘤细胞的抑制作用。方法与结果：我们前面已报道发现了鲨肝细胞再生刺激因子（sHRSF），根据sHRSF的N端氨基酸序列设计了引物，并利用RT-PCR方法从鲨鱼再生肝组织的，6-RNA中扩增到大小约为350bp的cDNA片段，序列分析表明350bp的片段含有一个开放阅读框（ORF），含有333个碱基，编码111个氨基酸残基，其编码的N端氨基酸序列与天然sHRSF的前7个氨基酸一致。该肽被命名为PSL12（来源于鲨肝的分子量约为12kD的肽）。该cDNA被连接到质粒pGEM—T-Easy，获得重组质粒pGEM—T-psll2。根据cDNA序列分析和质粒pET-32a的多克隆位点（BamHI和SalⅠ）的序列，设计并合成了psll2基因的特异性引物，质粒pGEM—T-psll2作为模板，进行了PCR扩增。将此PCR产物插入pET-32a得到表达质粒pET-32a—psll2，并将它转化入E．coli的BL21菌株。经IPTG诱导，带有组氨酸标签的融合蛋白的表达量约为40％。用金属螯合层析纯化融合蛋白后，再用FXa切割融合蛋白，经ResourceQ和MonoQ柱层析得到PSL12纯品，它可抑制肝肿瘤细胞株SMMC．7721和HepG2的增殖。结论：从鲨鱼肝脏中获得了一种新基因psll2。该基因的表达产物PSL12能显著抑制体外培养的肝肿瘤细胞的增殖。     

人胰激肽原酶的表达

 目的克隆人胰腺组织激肽原酶基因，构建分泌型原核表达载体。方法使用RT-PCR的方法扩增人胰腺组织cDNA，从中扩增出激肽原酶基因。将扩增的激肽原酶基因用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，连接到同样双酶切处理的pET-20b(+)载体上，酶切鉴定后，进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE，在相对分子质量31.4×103处可见明显的高表达带。蛋白质免疫印迹实验表明，重组蛋白具有激肽原酶的抗原性。结论成功克隆人胰腺组织激肽原酶基因，并高效表达融合蛋白，为进一步开发基因工程药物打下基础。     

甲型H1N1流感病毒NA蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

目的:利用原核系统表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白,制备NA特异性单克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术扩增A/Shenzhen/71/09病毒株NA基因,通过原核表达系统表达含6×His标签NA重组蛋白,利用镍离子亲和柱进行纯化。使用NA蛋白以100g/只剂量免疫BALB/C小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤技术筛选分泌NA特异性单克隆抗体的细胞株,采用Western-blot方法对单抗进一步验证。结果:成功克隆A/Shenzhen/71/09NA基因,长度约1400bp。将NA基因克隆入原核表达载体pET-21b(+),经IPTG诱导后在大肠杆菌包涵体中检测到目的蛋白,分子量约50kd。采用尿素变性处理后借助6×His标签对蛋白进行纯化。用纯化蛋白免疫小鼠,将脾细胞与SP2/0细胞融合,使用ELISA检测细胞上清NA抗体,共筛选1株持续分泌NA抗体的杂交瘤细胞株7C11。Western-blot验证该单克隆抗体可以特异性结合NA抗原。结论:成功表达甲型H1N1流感NA蛋白,获得1株分泌NA抗体的单克隆细胞株,从而为后续甲流诊断及疫苗研制奠定基础。     

人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物结构分析及活性研究

 目的确证人干细胞因子基因在大肠杆菌表达产物的正确性。方法通过蛋白质杂交，氨基酸末端序列分析，质谱分析及动物体内生物活性的研究，对人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物——重组人干细胞因子(rhSCF)分子进行了鉴定。结果大肠杆菌表达产物rhSCF N端15个氨基酸序列及C端2个氨基酸序列与理论推测一致，产物的相对分子质量为18 583.75，质量肽谱与理论序列的重叠率为98.2%，动物试验亦表明当与粒细胞集落刺激因子(G CSF)联用具有显著的外周血干(祖)细胞动员作用。结论人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物与理论推测完全一致，为其中试及临床试验奠定了基础。     

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

 目的构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞。方法人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内。结果TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白。结论构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础。     

侵染浙贝母的百合斑驳病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

目的:制备抗百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)CP血清,为研究侵染不同植物LMoV之间的血清学关系以及大田检测LMoV奠定基础。方法:根据Genbank报道的百合斑驳病毒CP基因序列设计引物,扩增其外壳蛋白基因并分析序列。将LMoV CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,通过IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然LMoV病毒结合。结果:LMoV的CP与目前已报道的LMoV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为95%～99%,氨基酸序列同源性为98%～100%。制备的抗体对CP具有高度特异性,且能够与天然LMoV病毒离子结合。结论:本研究制备的抗血清可以作为百合斑驳病毒的检测。     

侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(FVY)CP基因的原核表达及抗血清制备(英文)

目的:制备抗侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(Fritillary virus Y,FVY)CP血清,为大田检测FVY和研究FVY与其他病毒之间的血清学关系奠定基础。方法:根据Genbank报道的FVY CP基因序列设计引物,扩增其CP基因。Blast分析FVY CP基因核苷酸序列与其他马铃薯Y病毒属成员CP基因的同源性。将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,通过IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性。用原核表达的17种马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白作为抗原,检测抗FVY CP血清是否能与其进行交叉反应。采用ELISA分析抗体能否与天然FVY病毒离子结合。结果:FVY CP基因与油点草病毒Y(TrVY)CP基因、大豆花叶病毒半夏分离物CP基因和小西葫芦黄花叶病毒六安分离物CP基因分别有81.2%、68.1%和67.2%的同源性。制备的抗体对FVY CP具有高度特异性,同时能与大豆花叶病毒半夏分离物(SMV-P)CP蛋白有中等强度的结合,与小西葫芦黄花叶病毒CP...     

滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

目的:克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因(PpUGT1,PpUGT7),并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达.方法:试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录,根据滇重楼转录组数据设计特异性引物,克隆基因全长,使用软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time P...