Connexin43基因缺陷新生小鼠心脏组织病理学研究

目的观察不同程度Connefin43基因缺陷对新生小鼠心脏发育的影响。方法采用Cx43基因敲除(Cx43 KO)和CMV43^CT两种Cx43基因缺陷的小鼠模型,聚合酶链反应鉴定基因型。然后将新生小鼠心脏分离固定,HE染色观察心脏的形态结构。普通C57BL6／SJ小鼠作为对照。结果所有11只纯合型Cx43 KO小鼠生后1d内均死亡,心脏表现为严重右室流出道梗阻。在20只纯合型CMV43^CT新生小鼠中,有12只生后2d内死亡,其心脏不仅表现有右室流出道梗阻,还出现了房间隔缺损、室间隔缺损等其他心脏畸形;而另外8只未见心脏异常。所有杂合型Cx43 KO和CMV43^CT基因缺陷的小鼠生后均存活,心脏病理学检测未见异常。结论Cx43基因缺陷与心脏发育异常有密切的关系,但不同类型和不同程度的Cx43基因功能缺失对心脏发育的影响也不尽相同。     

小鼠胚胎流出道嵴内α-SMA阳性细胞的命运

目的观察小鼠胚胎心脏流出道分隔、重塑过程中流出道嵴内α-SMA阳性细胞的功能与转归。方法用抗α-SCA、抗α-SMA单克隆抗体及TUNEL凋亡染色法对胚龄11—16d小鼠胚胎心脏连续切片进行染色。结果胚龄11—12d，流出道远端分隔过程中，未见细胞凋亡发生。胚龄13—16d，随流出道间充质隔的形成与心肌化，α-SMA阳性细胞聚集形成高度特征性漩涡状结构，并可见细胞凋亡现象。结论不同部位的流出道嵴α-SMA阳性间充质细胞的命运转归不同，其主要功能可能是参与形成升主动脉和肺动脉干相邻壁，并参与流出道间充质隔的心肌化。     

Bmpr2在Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的表达

目的 探讨心脏近端流出道隔心肌化的分子机制及其对胎鼠心脏圆锥动脉干畸形(CTD)的影响.方法 以胎龄11.5～16.5 d的连接蛋白43(Cx43)基因敲除(Cx43KO)纯合型(Cx43-/-)、杂合型(Cx43+/-)和野生型(Cx43+/+)胎鼠胚胎作为研究对象,采用PCR方法鉴定其基因型,免疫组织化学法测定骨形成蛋白Ⅱ型受体(Bmpr2)和α横纹肌肌动蛋白(α-SCA)的表达.结果 Cx43KO鼠胚心脏近端流出道隔心肌化细胞明显减少,尤其以胎龄13.5和14.5 d的Cx43-/-为著.胎龄11.5～13.5 d,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜均有Bmpr2表达,心室肌也有微弱的表达;Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏仅心房和心外膜区有Bmpr2的微弱表达.胎龄14.5～16.5 d,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmpr2表达,流出道隔未心肌化区域Bmpr2未见表达,与α-SCA表达一致;胎龄14.5 d的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁均有Bmpr2表达,而心室肌、流出道膈未见Bmpr2表达;胎龄15.5与16.5 d的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmpr2表达,而且Bmpr2在流出道膈未心肌化区域部分表达.结论 Cx43KO胎鼠心脏近端流出道隔存在明显心肌化延迟.Bmpr2很可能涉及心外膜和心肌细胞相互作用的分子机制,参与心肌细胞的成熟过程.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism of myocardialization of proximal outflow tract septum and its effect on the conotruncal anomaly in mice. Methods The C57/BL6 mice of embryonic day (E) 1 1. 5 - 16. 5 were selected. The phenotypes of connexin 43 ( Cx43 ) homozygotes ( Cx43 -/- ),heterozygotes (Cx43+/-) and wild-types (Cx43+/+) were genetically typed by polymerase chain reaction (PCR). Bone morphogenetic protein receptor 2 (Bmpr2) and α-sarcomeric acti (α-SCA) were detected by immunohistochemistry. Results The expression of α-SCA in the proximal outflow tract (OFT) septum was delayed obviously in Cx43 -/- predominantly at E13.5 and E14. 5. From E11. 5 to E13. 5, the expression of Bmpr2 was detected in cardiac atrium and epicardium of Cx43+/+ fetal heart. And Bmpr2 was slightly expressed in ventricular muscle of Cx43 +/+ fetal heart. And it was expressed slightly only in cardiac atrium and epicardium of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart. From E14. 5 to E16. 5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium, endocardium, trabeculum, ventricular muscle and OFT septum of Cx43 +/+ fetal heart. At E14. 5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium,endocardium and trabeculum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart while none in ventricular muscle and OFT septum. At E15.5 and E16.5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium,endocardium, trabeculum, ventricular muscle and OFT septum of Cx43 +/- and Cx43-/- fetal heart. Its expression was also detected obviously in OFT septum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart with incompleted myocardialization. Conclusion Cx43KO embryonic mice exhibit delayed myocardialization. As compared with the Cx43 +/+, the expression of Bmpr2 in proximal OFT septum was delayed obviously in Cx43 +/- and Cx43 -/- mice. And the expression of Bmpr2 is abnormal in OFT septum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart. Bmpr2 may be involved in the interaction between epicardium and myocardium. It may be a critical mechanism in the maturation process of cardiac muscles.     

小鼠胚胎心脏各部分化发育成熟差异研究

目的 探讨α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和中间丝结蛋白与小鼠胚胎心脏分化发育成熟的关系. 方法 用免疫组化方法对胎龄9-19 d小鼠胚胎心脏连续切片进行染色. 结果 胎龄9 d,原始心室和流出道α-SCA、a-SMA表达较强,而结蛋白表达较弱.心房α-SCA、a-SMA的表达限于背侧壁和腹侧壁,静脉窦仅见少许α-SCA弱阳性细胞.心房和静脉窦则无结蛋白表达.胎龄10 d,心房和心室膨出,心脏各部均表达较强的α-SCA、α-SMA和结蛋白.α-SCA、α-SMA和结蛋白的表达于胎龄12 d达高峰.之后,α-SMA和结蛋白表达逐渐下降,但在右心室和流出道表达持续时间较长. 结论 α-SCA、α-SMA和结蛋白在小鼠胚胎心脏表达的时空特征表明小鼠胚胎心脏不同部位心肌分化发育成熟不同步.     

连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道组织中转录因子的表达及意义

目的 研究连接蛋白43（Cx43）基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道组织中转录因子的改变,从分子水平探讨Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道发育异常的原因。方法 以胎龄13．5d和14．5d的Cx43基因敲除、Cx43杂合子和Cx43野生型鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象。分别提取总RNA,反转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Affymetrix 4302．0小鼠全基因组芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。用实时定量逆转录（RT）PCR的方法对基因芯片筛选出的与心脏发育相关的部分转录因子进行验证。结果 与Cx43野生型组相比,Cx43基因敲除组表达差异的基因中,有6个是与心脏发育相关的转录因子。实时定量RT—PCR验证了其中3个基因：Soxll、Foxpl和Tbx20。在胎龄13．5d,Cx43基因敲除鼠胚Sox11、Foxp1的表达量均明显低于Cx43野生型组（4．76±0．19 vs 5．34±0．25,5．08±0．28 vs 5．64±0．15,均P〈0．01）;Tbx20在各组间差异不明显。胎龄14．5d,各基因Sox11、Foxp1以及Tbx20的表达量在基因敲除组均明显低于Cx43野生型组（4．71±0．27 vs 5．00±0．19,5．25±0．31 vs 5．77±0．16,7．05±0．17 vs 7．43±0．25,均P〈0．05）。其变化趋势与基因芯片结果基本一致。结论 心脏特异性的转录因子Foxp1、Sox11和Tbx20等的表达异常可能与Cx43基因敲除小鼠流出道的异常发育有关。     

Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的关键基因

 目的 研究Cx43基因纯合敲除（Cx43-/-）小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的关键基因。方法 以胎龄（embryonic day,ED）14.5的Cx43-/-和野生型（Cx43+/+）鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象,分别提取总RNA,逆转录成cDNA,并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化,再与Affymetrix-430 2.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。结果 与Cx43+/+组相比,Cx43-/-组中表达上调2倍以上的基因共有143个,表达下调2倍以上的基因有235个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期、细胞黏附、细胞活动和细胞骨架的信号通路等主要生理过程。进一步筛查表达差异1.5倍以上的基因发现,与圆锥动脉干畸形相关的TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因在Cx43-/-组有明显变化。对这些基因进行荧光定量PCR验证,结果与基因芯片一致（P<0.05）。结论 利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43-/-鼠胚心脏近端流出道发育有关的多个基因,并经荧光定量PCR验证。其中TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因可能与Cx43-/-小鼠流出道梗阻的发生有关。     

连接蛋白40、45在连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达

目的 检测连接蛋白(Cx)40、45在Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达.方法 选取Cx43基因敲除胎鼠,通过PCR方法鉴定其基因型,以Cx43基因敲除胎鼠纯合子作为研究对象,野生型为对照组,获取胎龄10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5 d纯合子及野生型各2只胎鼠,免疫组化检测Cx40、Cx45在心脏各部位的表达,SCIM显微图像分析系统对染色强度进行定量分析.结果 (1)野生型小鼠心室原始小梁网在胎龄10.5 d就已经有Cx40表达(A值为8.6),随后在心房、心室、小梁网、房室间隔和主、肺动脉壁表达逐日增加,胎龄14.5 d在心室部位达到高峰(A值为94.8),然后逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx40在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为7.9,胎龄14.5 d心室部位为75.8.纯合基因敲除型胎鼠Cx40的表达量明显弱于野生型.(2)野生型小鼠肌小梁部在胎龄10.5 d出现Cx45的表达(A值为20.0),随后在房室各部位相继表达,胎龄12.5 d在心房部位达到高峰(A值为49.6),然后表达逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx45在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为17.8,胎龄12.5 d心房部位为31.5.纯合基因敲除型胎鼠Cx45的表达量明显弱于野生型.结论 Cx40和Cx45在Cx43基因敲除小鼠纯合子胎龄10.5～15.5 d这一心脏分隔、瓣膜发育的关键时期表达异常,可能与Cx43基因敲除小鼠心脏的异常发育有关.     

小鼠胚胎近端流出道隔的融合与心肌化研究

目的探讨心脏近端流出道隔的融合和心肌化过程及其机制。方法选用胚胎(embryonicday,ED)11.5至出生后1dC57BL6小鼠(简称C57小鼠)。采用免疫组化法测定横纹肌肌动蛋白αSCA,神经嵴细胞的标记物AP2及HNK1,凋亡相关分子activecaspase3的表达;采用TUNEL法原位检测细胞的凋亡程度。结果①近端流出道隔的融合及心肌化的时空模式:近端流出道心内膜垫于ED11.5开始融合,ED13.5基本完成融合;心肌化约从ED12.5开始,至ED15.5基本完成。整个心肌化过程呈现心肌从流出道隔由外向内的内向性生长趋势。②近端流出道隔HNK1的表达:从ED11.5到生后1d近端流出道隔极少或几乎无HNK1表达。③近端流出道隔AP2的表达:ED11.5几乎无表达,ED12.5、ED13.5可见少量表达,从ED14.5以后消失。④近端流出道隔细胞的凋亡:TUNEL和caspase3的检测均表明近端流出道隔的凋亡集中出现在ED12.5和ED13.5,一部分凋亡细胞可能为AP2阳性的神经嵴源性细胞。结论C57小鼠心脏近端流出道隔在胚胎发育早中期开始融合,并逐渐完成心肌化过程,心脏神经嵴细胞可能通过凋亡途径参与了该过程。     

Cx43基因异常胎鼠心脏畸形的超声心动图研究

目的 观察Cx43基因异常引起心功能障碍的超声心动图表现。方法 对胎龄为14．5d、15．5d或16．5d的Cx43基因剔除、CMV43和FZ转基因小鼠胚胎，进行多普勒超声心动图检测、心脏形态学检查和基因型测定。结果 cx43基因异常小鼠胚胎主要表现为心室收缩期射血峰值增高(IPSV)或／和舒张期房室瓣口血流频谱呈单峰(MIP)。IPSV增高与肺动脉口狭窄相一致；而舒张期MIP则与右心室肥厚或右心室扩大相符合。结论 超声心动图在小鼠心脏病模型的研究方面具有较高的价值；Cx43异常可导致肺动脉口狭窄和右室舒张功能障碍。     

Cx43基因启动子甲基化下调乳腺癌Cx43的表达

目的：探讨乳腺癌细胞中Cx43蛋白的表达与基因启动子甲基化的关系。方法：免疫组化检测乳腺标本中Cx43蛋白的表达,甲基化PCR检测Cx43启动子甲基化的频度。5-氮杂脱氧胞苷培养乳腺癌MD-MBA-231细胞后,RT-PCR乳腺癌细胞中Cx43 mRNA,免疫组化、Western Blot检测Cx43蛋白表达,甲基化PCR检测启动子甲基化的变化。结果：与正常乳腺组织相比,乳腺癌中Cx43蛋白的表达下调,启动子甲基化频度高。在应用5-Aza-dC处理前,MD-MBA-231 Cx43基因呈甲基化状态,经4.0μmol/L的5-Aza-dC作用48h后,乳腺癌细胞Cx43基因甲基化逆转,Cx43基因mRNA及蛋白表达增加。结论：Cx43在乳腺癌组织中表达下调可能与启动子甲基化有关。5-Aza-dC能逆转乳腺癌细胞MD-MBA-231的Cx43基因异常甲基化,促进Cx43基因的再表达。     

Downregulation of Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 in the process of delayed myocardialization of cardiac proximal outflow tract septum in connexin 43 knockout mice embryo

Background  The connexin43 knockout (Cx43 KO) mouse dies at birth with an enlarged conotruncal region, which leads to the obstruction of the right outflow tract (OFT). Since myocardialization of the proximal OFT septum is one of the key events during heart development, we investigated the process in the Cx43 KO embryo hearts. Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 (ROCK1), is a recently found key molecule to regulate the myocardialization of OFT, but its spatiotemporal expression pattern during myocardialization remains unknown. The objective of this study was to investigate the differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wild type embryo hearts, and its relationship with the delayed myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

Methods  Using immunohistochemistry, the processes of myocardiolization were investigated both in Cx43 KO and wild type embryo hearts. The differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wildtype embryo hearts was evaluated both at the mRNA and protein level by real-time RT-PCR and immunohistochemistry.

Results  The expression of α-sarcomeric actin (α-SCA) in the proximal OFT septum of Cx43 KO embryos was delayed. Meanwhile, it was shown that the downregulation of ROCK1 coincided with delayed myocardialization. The expression of ROCK1 protein was mainly limited to the proximal outflow tract septum from embryo day (E) E11.5 to E15.5. Its expression pattern was similar with that of α-SCA. Real-time RT-PCR found that the expression level of Rock-1 mRNA began at a low level on E11.5 and reached peak at E13.5 and E14.5.

Conclusions  ROCK1 may have an important role in the process of myocardialization of the proximal OFT septum. Downregulation of ROCK1 is likely to contribute to the aberrant myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

     

心脏发育相关的微小RNA差异表达

目的 探讨微小RNA(miRNA)在心脏发育中的作用.方法 建立先天性心脏病-室间隔缺损相关基因Pax-8敲除小鼠模型Pax-8 KO-/-(纯合子)及Pax-8 KO +/-(杂合子),提取纯合子和杂合子小鼠心脏总RNA,采用含有567种miRNA的芯片进行检测并分析miRNA表达谱的差异,并通过荧光实时定量PCR技术对结果进行验证.结果 纯合子小鼠比杂合子小鼠左心室腔扩大,左心室壁肥厚,室间隔增厚,左室乳头肌肥大,心脏呈球形.超声结果显示杂合子小鼠左室收缩末期内径(LVIDs)[(1.23±0.25)mm比(1.93±0.50)mm]和左室舒张末期内径(LVIDd)[(2.13±0.18)mm 比(2.89±0.29)]均明显小于纯合子小鼠,差异有统计学意义(均P<0.01)心肌左心室壁以及室间隔组织可见大量的凋亡心肌细胞.在纯合子小鼠发现miRNA表达谱中差异表达的miRNA共10个, 其中2个miRNA表达下调,8个miRNA表达上调.荧光实时定量RT-PCR结果与芯片结果基本符合.结论 miRNA参与心脏发育过程,在先天性心脏病室间隔缺损的发病机制中可能发挥重要作用.     

缝隙连接蛋白在心房纤颤患者心房肌的表达及其信号转导途径

目的探讨缝隙连接蛋白在心房纤颤(房颤)心房肌的表达及其信号转导机制.方法 63例接受开胸手术患者(包括慢性房颤、阵发性房颤、窦性心律患者),手术时取心房组织,应用逆转录-聚合酶链反应技术检测心房肌钙调磷酸酶调节亚单位(Calcineurin B)、丝裂原激活的蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)mRNA表达量,采用Western印迹方法,检测细胞外调节激酶1(ERK1)、磷酸化细胞外调节激酶1(P-ERK1)、缝隙连接蛋白40(Cx40)、缝隙连接蛋白43(Cx43)蛋白表达量的改变.结果慢性房颤、阵发性房颤患者左心房与右心耳组织Cx40蛋白表达量(左心房2.2±0.8,2.2±0.6;右心耳2.1±0.5,2.0±0.8 ), 与窦性心律组相比,差异有显著意义(P<0.05).慢性房颤、阵发性房颤患者Cx43蛋白仅在左房组织表达高于窦性心律瓣膜病组(3.1±0.6,2.8±0.7 vs 1.0±0.2,P均<0.05).Calcineurin B mRNA、 MKP-1 mRNA、P- ERK1蛋白在慢性房颤、阵发性房颤患者各组的表达水平均明显高于窦性心律组(P<0.05).免疫组化显示慢性房颤、阵发性房颤患者Cx40、Cx43均分布紊乱,聚集于细胞的侧边、胞浆或核周.结论房颤患者心房肌Cx40、Cx43 蛋白基因表达增高且分布异常,可能与ERK1及一些磷酸酶的异常激活、调控失衡有关.     

促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因敲除(KO)小鼠饲养、繁殖及基因型鉴定的方法。方法从美国Jackson实验室引进CRH KO小鼠,按照遗传学规则,对杂合子型(CRH+/-)小鼠进行配对繁殖,提取幼鼠尾部组织全基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对幼鼠基因型进行鉴定。结果 CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠的繁殖和饲养均获得成功,采用PCR成功地对所获得的小鼠进行基因分析,在子代小鼠中存在野生纯合子型(CRH+/+)、杂合子型(CRH+/-)及CRHKO纯合子型(CRH-/-)小鼠。CRH-/-小鼠较另外2种基因型小鼠存活率明显下降,但3种基因型小鼠在出生后10 d及30d体质量无明显差异。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法可从杂合子型(CRH+/-)小鼠中获得CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠。     

高血糖致畸小鼠胚胎Pax3与Cx43基因的表达及定量研究

目的　探讨高血糖是否是糖尿病致畸的原因及其致畸机理。方法　采用皮下注射高渗糖的途径制成高血糖小鼠模型 ,并设立敌枯双实验组和空白、5 %葡萄糖及敌枯双对照组 ,通过逆转录聚合酶链反应及免疫组化的方法检测各组小鼠胚胎体中Pax3及Cx4 3基因的mRNA及蛋白的表达。结果　皮下注射高渗糖可致孕小鼠高血糖 (13 4mmol/L± 0 8mmol/L) ,其明显高于空白和 5 %葡萄糖对照组 (两者分别为 4 9mmol/L± 0 4mmol/L及 4 8mmol/L± 0 4mmol/L) ;高糖组吸收胎、死胎及畸胎发生率均显著高于两对照组 (P <0 0 1) ,胎重明显低于两对照组 ;高糖组Pax3的表达明显低于两对照组 (P <0 0 1) ,而Cx4 3的表达则明显高于两对照组 (P <0 0 1)。敌枯双组Pax3的表达无明显改变 ,Cx4 3的表达则明显高于两对照组 (P <0 0 1)。结论　高血糖是糖尿病致畸的主要原因 ;高血糖可通过诱导Pax3基因突变 ,使其蛋白表达下降 ,进而使Cx4 3基因及其蛋白过表达而致畸。