炎性复合体mRNA在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义

目的研究炎性复合体(inflammasomes)在类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达及对细胞自身的影响。方法 (1)用Real-time PCR检测IPAF和NALP1 mRNA在3例关节创伤(正常组)、4例骨关节炎(OA组)和6例RA(RA组)患者滑膜细胞中的表达情况;(2)分别用培养液(对照组)、脂多糖(LPS,LPS组)、LPS+苄氧羰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-(O-甲酰)-氟甲基酮(Z-VAD-FMK,Z-VAD-FMK组)、肿瘤坏死因子(TNF,TNF组)及TNF+Z-VAD-FMK处理6例RA患者滑膜细胞24 h后,应用Real-time PCR技术检测IPAF和NALP1 mRNA表达情况。结果 (1)OA组IPAF和NALP1的mRNA表达均明显高于正常组和RA组(P<0.01),RA组IPAF和NALP1的mRNA表达均高于正常组,但差异无统计学意义。(2)TNF组IPAFmRNA较对照组表达增加达408%(P<0.05);TNF组NALP1 mRNA较对照组表达增加达119%(P<0.05),LPS组的水平是TNF组的1.18倍(P<0.05)。结论炎症因子TNF影响炎性复合体mRNA在RA-FLS中的表达。     

丹参诱导成纤维样滑膜细胞caspase-1基因表达研究

目的探讨丹参对类风湿关节炎患者和骨关节炎患者的成纤维样滑膜细胞（FLSs）caspase-1 mRNA表达的影响。方法类风湿关节炎（RA）患者关节滑液和骨关节炎（OA）患者关节滑液中游离滑膜样细胞经原代培养,分别用终浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2mg/ml的丹参作用24h后,观察形态;提取总RNA并逆转录成cDNA,采用SYBR green适时荧光定量PCR方法检测caspase-1的表达。结果无论RA还是OA,在丹参浓度为0.2mg/ml时,FLSs形态变化不明显;当丹参浓度为0.4mg/ml及以上时,FLSs发生凋亡样改变。caspase-1的基础表达量（未加丹参刺激）在RA FLSs与OA FLSs中为差异无统计学意义（P〉0.05）;以丹参浓度为0作为对照组,无论是在RAFLSs,还是在OA FLSs中,Caspase-1的表达量均随丹参浓度增加而增加,并且在丹参浓度为0.4mg/ml时开始差异有统计学意义（P〈0.001）。结论 caspase-1在RAFLSs和OA FLSs中的表达无明显变化可能表明两种细胞的炎性性质的一致性;丹参可诱导FLSs caspase-1在mRNA水平的表达增加,且呈剂量关系,这可能与丹参抗炎和（或）诱导FLSs凋亡有关。     

E2F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞中的表达研究

目的 研究E2F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞（RA FLs）中的表达,分析其表达与类风湿关节炎病理特征的关系,以及调控E2F2表达的机制。方法 采用瞬时转染的方法将E2F2 siRNA转染入RA FLs后,应用RT-PCR 法筛选干扰效率最高的siRNA,并应用MTS法检测干扰E2F2表达后对RA FLs增殖的影响,采用ELISA法检测E2F2下游基因表达的变化。采用RT-PCR法检测分别使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs以及共同使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs后E2F2的表达。通过染色质免疫沉淀法（ChIP）检测调控E2F2表达的方式。结果 在siE2F2后,与对照组相比E2F2在mRNA水平表达显著降低（P<0.01）,细胞增殖能力减弱（P<0.05）。在RA FLs中TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达。结论 在RA FLs中E2F2存在高表达现象,并且E2F2的高表达参与RA的病变过程,TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达,可做为治疗类风湿关节炎的新靶点。     

赤芍801对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞fas/faslmRNA表达的影响

目的 :探讨赤芍801对类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)中fas/fasl mRNA表达的影响。方法:RA患者关节液原代培养获取FLS,分别用浓度为0、4和64μg/mL的赤芍801作用24h后,提取总RNA并逆转录成cDNA,分别采用RT-PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR检测fas/fasl的表达。结果:逆转录PCR结果显示,fasl mRNA在RA FLS中未被检测出,fas mRNA在RA FLS中有表达。实时荧光定量PCR结果表明fas mRNA相对表达量在4μg/mL赤芍801刺激24h后增加无统计学意义。但在64μg/mL赤芍801刺激24h后增加有统计学意义(P<0.05)。结论:赤芍801可体外诱导RA FLS fas mRNA表达上调;未检测到fasl mRNA在RA FLS中的表达。     

类风湿关节炎患者滑液NK-22细胞对成纤维样滑膜细胞增殖的影响及其机制研究

目的探讨类风湿关节炎患者滑液NK-22细胞对成纤维样滑膜细胞增殖的影响及其可能机制。方法采用流式细胞术检测20例RA患者及20例健康对照外周血(peripheral blood,PB)、10例RA患者滑液(synovial fluid,SF)中NK-22细胞(NKp44+CCR6+NK细胞)比例。流式细胞术分选滑液NK-22细胞,鉴定细胞纯度;体外悬浮培养2周,佛波酯(PMA()20ng/ml)和ionomycin(0.5μmol/L)刺激后NK-22细胞培养上清液分别作用于成纤维样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocytes,FLS)24 h、48 h、72 h、96 h,MTT法检测成纤维样滑膜细胞增殖情况。ELISA检测NK-22细胞培养上清中IL-22、T0.N05F)-;αR浓A度患。者结滑果液①NKR-A22患细者胞外比周例血为N4K.5-62%2细,明胞显比高例于为自0身.9外56周%,血明比显例高1于.31健5%康(对P<照0.外05)周。血②N流K式-22分细选胞2比×1例04个0.0N0K3%-2(2P细<胞,细胞纯度>90%。③PMA和ionomycin刺激后NK-22细胞培养上清作用于成纤维样滑膜细胞24 h、48 h、72 h、96 h可明显刺激成纤维样滑膜细胞增殖(P<0.05)。④PMA和ionomycin刺激后NK-22细胞培养上清中IL-22、TNF-α浓度分别为941.82 pg/ml和368.10 pg/ml。结论类风湿关节炎患者关节液NK-22细胞可明显刺激成纤维样滑膜细胞增殖,其可能机制与NK-22细胞能分泌白介素-22(IL-22)、肿瘤坏死因子(TNF-α)有关。     

CXCL16/CXCR6在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及其在滑膜细胞增殖中的作用

目的：探讨趋化因子CXCL16及其受体CXCR6在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）中的表达及其对FLS增殖的作用。方法:纳入RA 8例、骨关节炎（osteoarthritis,OA）7例、健康对照3例,采用组织块贴壁方法体外分离培养人膝关节FLS,第3~5代细胞用于后续研究。Western blot方法检测CXCL16及其受体CXCR6在3组FLS的表达水平;不同浓度的重组人CXCL16(0、10、50、100、200 μg/L)刺激3组FLS后,细胞活性检测试剂盒-8（cell counting kit,CCK-8）检测FLS增殖水平;Western blot方法检测重组人CXCL16刺激后RA-FLS中pAKT/AKT水平;ELISA法检测重组人CXCL16刺激后RA-FLS培养上清中TNF-ɑ、IL-6、MMP-3、RANKL水平。结果: RA-FLS中CXCL16、CXCR6蛋白表达水平均明显高于OA组和对照组（P<0.05）,OA组和对照组间差异无统计学意义;重组人CXCL16（50、100、200 μg/L）刺激后RA-FLS增殖能力明显高于非刺激组（P均<0.05）,OA组和对照组FLS经CXCL16刺激后细胞增殖水平无明显变化（P>0.05）;200 μg/L CXCL16刺激后,RA-FLS表达pAKT/AKT明显增高;CXCL16（50、100、200 μg/L）刺激后,RA-FLS培养上清中IL-6和RANKL表达明显增加（P < 0.05）,而MMP-3、TNF-ɑ水平无明显变化。结论:CXCL16及其受体在RA-FLS中表达增高,重组人CXCL16可促进RA-FLS增殖活化、分泌炎性因子增加,提示CXCL16参与了RA的滑膜炎症。     

佐剂诱导关节炎大鼠模型的建立及成纤维样滑膜细胞的分离

目的建立类风湿性关节炎(RA)动物模型；从炎性关节滑膜中分离成纤维样滑膜细胞(FLS)。方法应用热灭活结核杆菌H37Ra菌株与矿物油混合制备改良的佐剂,尾根部皮内注射Lewis大鼠诱导关节炎；剪取成功诱导关节炎大鼠的病变踝关节,从中剥离滑膜组织,充分剪碎后采用胶原酶消化法分离成纤维样滑膜细胞。结果成功诱导了大鼠关节炎,发病率为100%,发病时间有规律,组织学表现与RA相似；成功在体外培养了FLS并对其进行了鉴定,掌握了其生长形态和特征。结论成功制备RA动物模型并获得FLS,为今后RA发病机制探索和药物评价提供了良好的体内动物模型和体外细胞模型。     

成纤维样滑膜细胞激活在类风湿关节炎中的关键作用及其靶向治疗的研究进展

类风湿关节炎(RA)是临床常见病和多发病,以滑膜组织增生、间质炎性细胞浸润、微血管新生、血管翳形成及软骨和骨组织的破坏等为主要病理特征。目前,其发病机制尚未明确,有越来多研究表明成纤维样滑膜细胞的异常激活在疾病发生、发展中起着关键的作用。靶向成纤维样滑膜细胞的研究策略可为有效治疗RA提供新思路。     

昆母汤醇提液对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡及 caspase －3表达的影响

目的：观察昆母汤醇提液对人类风湿关节炎（ RA）成纤维样滑膜细胞（ FLS）凋亡及对caspase－3表达的影响,探讨昆母汤治疗 RA 的部分作用机制。方法滑膜组织取自行关节置换术或关节镜检查术的8例活动性 RA 患者,分离出 FLS 进行原代培养,采用流式细胞仪检测法检测昆母汤醇提液对 RA －FLS 细胞凋亡率的影响,采用酶联免疫吸附测定法检测培养上清液 caspase －3蛋白含量的变化。结果昆母汤醇提液和甲氨蝶呤均可显著促进 RA －FLS 的凋亡,且昆母汤醇提液促 RA －FLS 凋亡能力在一定程度上呈剂量依赖性。高剂量昆母汤醇提液可使 TNF －α诱导的 caspase －3表达量增加。结论昆母汤可能通过促进 caspase －3的表达来促进RA －FLS 凋亡,具有治疗 RA 的潜在价值。     

RhoA/ROCK信号通路对TLR-2配体诱导的类风湿关节炎患者成纤维滑膜细胞分泌趋化因子的调控作用

目的 研究RhoA/Rho激酶(ROCK)信号通路对Toll样受体2(TLR-2)配体诱导的类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)分泌趋化因子的影响.方法 RA FLS来源于活动性RA患者滑膜组织;肽聚糖被用于TLR-2配体;RhoA活性检测采用pull down方法;ROCK活性用磷酸化肌球蛋白结合亚单位1(MYPT1)蛋白表达来表示,磷酸化MYPT1蛋白检测采用免疫印迹法;细胞活性检测采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法,趋化因子水平采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测.结果 肽聚糖(5 mg/L)刺激使体外培养的RA FLS分泌白细胞介素8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2)和受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)明显增高,对RhoA和ROCK活化也有显著的刺激作用,肽聚糖诱导的上述作用能被TLR-2单克隆抗体所阻抑.RhoA抑制剂C3转化酶和ROCK抑制剂Y27632对PG诱导的IL-8、MCP-2和RANTES等趋化因子分泌有显著的抑制作用.结论 RhoA/ROCK信号通路对TLR2介导的RA FLS分泌趋化因子具有调控作用,通过抑制该通路活化可能有利于RA的治疗.

Abstract：

Objective To evaluate the modulation of RhoA/Rho kinase (ROCK) signaling pathway,a small Rho GTPase that is considered as an important modulator in inflammatory responses,on Toll-like receptor-2 mediated chemokine secretion in fibroblast-like synoviocytes (FLS)from rheumatoid arthritis (RA) patients.Methods The RhoA activity was measured by a pull-down assay.And the ROCK activity was assessed by Western blot.The secretion of chemokines was measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).MTT test was used to detect the cellular viability.Results The stimulation of peptidoglycan(PG,5 mg/L) increased the levels of IL-8 (interleukin-8),RANTES (regulated upon activation normal T cell expressed & secreted) and MCP-2 (monocyte chemotactic protein-2)and boosted the activities of RhoA and ROCK versus the unstimulated RA FLS.And these effects of PG were suppressed by anti-TLR-2 monoclonal antibody.Inhibition of RhoA and ROCK with a specific inhibitor inhibited the secretion of IL-8,RANTES and MCP-2 in PG-induced RA FLS.Conclusion The present study provides novel evidence that the RhoA/ROCK signal pathway modulates the TLR-2-mediated secretion of chemokines in RA FLS.It suggests that the inhibition of RhoA/ROCK may be a new therapeutic approach for RA.     

成纤维样滑膜细胞Toll样受体在类风湿性关节炎的研究进展

Toll样受体（toll-like receptor,TLRs）是一种I型跨膜蛋白受体,可识别微生物上特定结构的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）和宿主自身损伤细胞产生的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs）,在天然免疫中发挥着重要作用。     

类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞lncRNA-miRNA-mRNA网络构建及关键基因预测

目的 探索类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)中长链非编码RNA(lncRNA)-微小RNA(miRNA)-mRNA网络及关键lncRNA,揭示lncRNA在RA中的作用.方法 在美国国立生物技术信息中心的基因表达数据库(GEO)中获取相关的数据集GSE103578、GSE83147、GSE128813,每个...     

miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞增殖

目的 研究缺氧在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）滑膜成纤维样细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）增殖中的作用及机制。 方法 采用HE染色法检测RA和对照骨关节炎（osteoarthritis, OA）滑膜组织FLS增生情况。分离原代RA-FLS并采用流式细胞术鉴定;将RA-FLS置于常氧（21%O2）或缺氧环境（3%O2）中培养,CCK-8法检测细胞增殖水平的变化,RT-PCR检测miR-let-7d表达的变化。通过类似物或抑制物改变miR-let-7d的表达,观察其对RA-FLS增殖、凋亡的影响;探究miR-let-7d靶基因在缺氧诱导的RA-FLS增殖中的作用。 结果 FLS在RA滑膜中增生明显,在缺氧环境下RA-FLS增殖加快,miR-let-7d表达水平降低;过表达miR-let-7d抑制RA-FLS增殖,但对细胞凋亡水平无明显影响;进一步的研究证实miR-let-7d靶基因HMGA2参与缺氧诱导的RA-FLS增殖。 结论 miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的RA-FLS增殖。     

姜黄素诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及其机制研究

目的 观察姜黄素(CUR)对体外培养的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)凋亡的诱导作用及其机制.方法 用不同浓度CUR处理在体外培养的RA-FLSs细胞后,CCK-8法检测CUR对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测CUR对RA-FLSs细胞凋亡的诱导效应;蛋白质免疫印迹方法(WB)检测细胞凋亡的外源途径中相...     

蒲公英甾醇对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、 迁移和凋亡及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的 探讨蒲公英甾醇对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)的增殖、迁移和凋亡及TLR4/NF-κB信号通路的影响和机制研究。方法 CCK-8检测蒲公英甾醇的毒性;ELISA法检测MH7A细胞中炎性介质的分泌水平;EDU检测MH7A细胞的增殖能力;Transwell法检测MH7A细胞的迁移能力;细胞流式术检测MH7A细胞的凋亡能力;Western blot法检测MH7A细胞中TLR4、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白的表达情况。结果 蒲公英甾醇的最佳作用浓度为5、10、15μg/ml;经LPS诱导后,蒲公英甾醇对MH7A细胞炎性因子的分泌量有抑制作用(P<0.05);与LPS组比较,不同浓度的蒲公英甾醇使MH7A细胞的增殖能力和迁移能力下降,凋亡率提高(P均<0.05);Western blot法检测结果显示,与LPS组比较,不同浓度蒲公甾醇使TLR4蛋白表达降低,NF-κB p65的磷酸化程度降低(P均<0.05)。结论 蒲公英甾醇能降低MH7A细胞的增殖能力、迁移能力并诱导其凋亡,可能与其降低TLR4和NF-κB p65的磷酸化程度有关。     

小檗碱抑制类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞的自噬并促进其凋亡：基于下调ROS/mTOR信号通路

目的 探究小檗碱（BBR）对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLSs）凋亡/自噬失衡的调控作用及机制。方法 CCK-8法检测BBR对RA-FLSs的增殖抑制作用,实验设空白对照组、TNF-α(25 ng/mL)组、TNF-α+BBR(10、20、30、40、50、60、70、80μmol/L)组,Annexin V/PI双染流式法和JC-1免疫荧光染色检测BBR对RA-FLSs凋亡的影响,Western blot检测BBR对RAFLSs自噬和凋亡相关蛋白表达水平的影响。进一步增加自噬诱导剂RAPA和自噬抑制剂氯喹（CQ）作为对照,激光共聚焦检测mCherry-EGFP-LC3B观察自噬流变化;并设置活性氧（ROS）模拟物H2O2和ROS抑制剂NAC观察BBR对ROS、mTOR、p-mTOR水平的影响。结果 CCK-8结果显示BBR可呈时间和浓度依赖性抑制RA-FLSs增殖活力,流式和JC-1染色结果显示BBR(30μmol/L)可显著增加RA-FLSs凋亡率（P<0.01）,降低线粒体膜电位（P<0.05）。Western blot结果显示BBR处理后Bcl-2/Ba...     

程序化细胞死亡因子5过表达促进雷公藤内醇酯诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

目的:探讨程序化细胞死亡因子5(progrmmed cell death 5,PDCD5)过表达对雷公藤内醇酯(triptolide)诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatiod arthritis fibroblast-likes synoviocytes,RA FLS)凋亡的作用.方法:体外分离培养RA FLS进行腺病毒Ad-PDCD5(含有PDCD5基因的腺病毒载体)的转染,分别用免疫印迹法和流式细胞术检测Ad-PDCD5转染后的RA FLS中PDCD5蛋白表达及经雷公藤内醇酯处理后的PDCD5蛋白过表达的RAFLS的凋亡率.结果:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为50、100、200和300的Ad-PDCD5感染RAFLS 36 h后,PDCD5蛋白表达水平呈现剂量依赖性增加.未经雷公藤内醇酯处理的非感染组、Ad-null组(不含目的基因的空载体)和Ad-PDCD5组RA FLS的凋亡之间差异无统计学意义,经雷公藤内醇酯处理后,其RA FLS的凋亡率分别为(22.51±3.87)%,(28.77±12.97)%和(48.87±12.69)%.表明此腺病毒体系能够有效地使PDCD5蛋白过表达,在RA FLS中,单独使用雷公藤内醇酯或者单独转染PDCD5都不能明显地诱导细胞凋亡,但过表达PDCD5再进行雷公藤内醇酯处理可以诱导细胞凋亡.结论:腺病毒Ad-PDCD5转染使PDCD5过表达,从而能够促进雷公藤内醇酯诱导的RA FLS凋亡,为类风湿关节炎的临床治疗提供了一个可能的干预靶点.     

miR-26a-5p通过JAK2/STAT3 信号通路对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

探讨miR-26a-5p对人类风湿关节炎（RA）-成纤维样滑膜细胞（FLSs）凋亡及炎性因子分泌的影响,阐明其作用机制。     

Fas／FasL诱导细胞凋亡

多细胞组织的内环境稳定性不仅受细胞增殖和分化调控，而且也受细胞衰亡的控制。细胞衰亡可分为两类：一类是坏死（necrosis），是由有害信号的极度刺激造成细胞损伤所引起的死亡，主要病理变化为核固缩、碎裂和溶解；另一类是凋亡（apoptosis），是由有害信号的温和刺激及某些生理刺激引起的细胞程序性死亡（Programmedcelldeath）。无论刺激信号是生理性的还是病理性的，任何诱导细胞自杀程序基因表达而致的细胞死亡均属凋亡。细胞凋亡的特征性形态改变有细胞团缩、染色质凝集及凋亡小体出现等。在细胞凋亡调控机制研究中，已证明某些原…