促血管生成素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带小鼠促血管生成素-1(Ang-1)基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法化学合成小鼠Ang-1基因经PCR扩增后亚克隆至穿梭质粒,重组质粒转化感受态细胞,所得转化子经PCR电泳分析并测序鉴定,携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK 293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定重组腺病毒滴度,所得腺病毒转染293T细胞48 h收集培养上清,通过Western Blot分析Ang-1蛋白的表达。结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kbp的特征性条带,测序结果显示基因序列与Gen Bank提供的Ang-1序列一致,经HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×109pfu/ml,转染293T细胞后培养上清Western Blot分析可见大小58 k D特征性条带,即转染后能分泌正确大小的重组Ang-1蛋白。结论 Ang-1基因重组腺病毒载体可成功构建,为进一步研究Ang-1蛋白对造血干细胞动员及血管新生的作用提供实验依据。     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

促血管生成素2及其受体Tie2基因RNA干扰表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素2(Ang-2)及其受体Tie2基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法以Ang-2、Tie2的mRNA已知序列为靶点,化学合成能编码针对Ang-2、Tie2基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸各2对,退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6-siRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ启动子的下游,构建重组质粒pSliencer-1.0-U6-Ang-2/Tie2-siRNA。结果将与目的片段相符的双链shRNA和线性化的pSilencer1.0-U6-siRNA质粒连接后,经限制性内切酶HindⅢ酶切电泳及测序分析证实,2条重组质粒载体构建正确,无任何碱基突变。结论成功构建pSilencer1.0-U6-Ang-2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,为进一步研究其对血管生成的作用打下基础。     

谷胱甘肽S转移酶-血管生成抑制素融合蛋白表达载体的构建

目的　构建谷胱甘肽S转移酶 -血管生成抑制素 (GST -Angiostatin)融合蛋白表达载体。方法　把血管生成抑制素 (Angiostatin)基因插入融合基因表达载体pGEX - 2T的多克隆位点上 ,转化大肠杆菌DH5α ,提取质粒DNA ,限制性内切酶消化DNA ,琼脂糖凝胶电泳。结果　经限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ酶切质粒DNA ,电泳结果证明Angiostatin基因已插入到pGEX - 2T中。结论　成功构建GST -Angiostatin融合蛋白表达载体 ,为获得较大量的基因工程Angiostatin产品 ,为肿瘤治疗研究作必要准备。     

携带人血管生成素-1腺病毒表达载体Padeasy-1/Ang-1的构建、鉴定和滴度测定

目的 克隆Ang-1基因,构建Ang-1/Pshuttle/Padeasy-1腺病毒表达载体,为进一步研究Ang-1防治卵巢癌病变的血管异质性提供理论基础.方法 提取流产胎儿肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增出Ang-1基因片段,并将其克隆到Pshuttle载体中进行序列分析,经PacⅠ线性化、连接到腺病毒表达载体Padeasy-1中,将Padeasy-1包装进脂质体、转染入人胚肾293细胞,测定病毒生物活性滴度.结果 从流产胎儿肝脏组织总RNA中,扩增出1.4kb的cDNA片段,成功构建了Padeasy-1/Pshuttle/Ang-1表达载体.结论 从流产胎儿肝脏组织中成功克隆Ang-1基因,成功构建Padeasy-1/Pshuttle/Ang-1表达载体,Padeasy-1/Pshuttle/Ang-1表达载体的滴度为1×1011PFU/mL.     

PTG重组腺病毒过表达载体的构建

目的 构建及鉴定携带小鼠PTG基因(NM＿016854)的过表达重组腺病毒载体,为深入研究PTG的功能奠定基础。方法 化学合成小鼠PTG基因的编码序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增、酶切,后插入GV314载体(CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP),得到重组穿梭质粒pGV314-PTG;进一步BamHⅠ/AgeⅠ双酶切,产物交换入线性化表达载体pDC315,构建重组腺病毒Ad-PTG,将其转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,进行纯化及滴度检测,最后利用PCR、Western blot及测序验证重组腺病毒。结果 经PCR、Western blot及测序后,结果显示成功构建pGV314-CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-PTG过表达腺病毒载体(Ad-PTG),终点稀释法测得病毒滴度为4×10¹⁰ PFU/ml, Western blot和荧光定量PCR显示PTG的蛋白和mRNA表达水平显著升高。结论 成功构建携带小鼠PTG基因的重组过表达腺病毒载体,且能有效上调肝细胞中PTG基因的表达。     

人促血管生成素-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人促血管生成素-2(Ang-2)反义真核表达载体。方法应用基因重组技术将Ang-2 cDNA反向克隆到真核表达载体pECFP-N1中。结果XhoⅡ、BamhⅠ双酶切后．反义重组基因为5．4kb和0．726kb两条带。与理论计算相符。结论成功构建人Ang-2真核表达载体，为肿瘤细胞的Ang-2反义基因治疗研究创造了条件。     

人食管鳞癌组织中促血管生成素-2的表达

目的:探讨食管鳞癌及癌旁组织中促血管生成素-2(Ang-2)的表达.方法:采用免疫组织化学SP法检测56例食管鳞癌、13例原位癌、11例重度不典型增生和47例食管断端正常鳞状上皮组织中Ang-2的表达.结果:Ang-2的表达主要定位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜.食管鳞癌、原位癌组织中Ang-2的表达高于食管正常鳞状上皮组织(P＜0.01)和癌旁重度不典型增生上皮组织(P＜0.05);重度不典型增生上皮组织中Ang-2的表达也高于食管正常鳞状上皮(P＜0.01),但食管鳞癌组织和原位癌组织中Ang-2的表达差异无统计学意义(P＞0.05).Ang-2的表达与食管鳞癌的分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移无关(P均＞0.05).结论:Ang-2的阳性表达是食管癌鳞癌发生的早期事件.     

人血管形成素腺病毒重组粘粒构建

血管形成素(angiopoietin,ANG)是一种新近发现的与血管生长密切相关的生物因子,目前已发现有两种分型,即和型血管形成素(ANG,ANG2)[1,2]。其中型血管形成素具有很强的促进血管内皮细胞增殖和血管形成的作用[3],其编码基因位于染色体的8q22.3-q23区,受体为Tie-2。体内外实?..     

促血管生成素-2在口腔鳞癌中表达的初步研究

目的:研究口腔鳞癌组织中促血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)的表达及其与临床病理学特征间的关系,初步探讨Ang-2在口腔鳞癌中的作用及意义。方法:免疫组织化学SABC法检测口腔鳞癌标本41例(有淋巴结转移者13例)及30例癌旁正常组织和10例正常口腔黏膜组织中的Ang-2表达。应用BioMias图像处理系统处理图像。SPSS11.0统计软件行数据处理。结果:Ang-2表达主要集中于肿瘤细胞胞浆,尤其是癌灶边缘的血管重塑区。Ang-2在口腔鳞癌组织中表达显著高于癌旁正常组织(P<0.01)及正常口腔黏膜组织中Ang-2的表达(P<0.01);Ang-2表达与肿瘤的淋巴结转移(P<0.01)密切相关,而与病人的性别、年龄和临床分期及肿瘤的分化程度无关(P>0.05)。结论:Ang-2在口腔鳞癌组织中的过度表达可能在口腔鳞癌的发生、发展中起重要作用。     

人生长终止特异性同源盒基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因表达产物是核转录因子,主要存在于心血管系统中,对胚胎发育、细胞生长、分化和迁移等起基因调控作用,其表达异常与多种疾病相关.为深入研究Gax基因在临床疾病中的作用,文中构建表达了人Gax基因的重组腺病毒载体.方法 根据pEGFP-N1-Gax质粒的多克隆位点,用NheⅠ和Hind Ⅲ双酶切获得人Gax基因片段,连接至穿梭质粒pDC18-mCMV上,构建穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax,然后与骨架质粒pPE3共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Gax,反复感染293细胞扩增病毒后,氯化铯梯度离心纯化病毒,并测定病毒滴度.结果 穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax经双酶切和测序证实构建成功;PCR鉴定人Gax基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为4.5×1010pfu/ml.结论 该研究成功构建了重组腺病毒载体Ad5-Gax,为进一步在体内外研究Gax基因参与多种疾病的发生发展提供了材料.     

人EGFP—TERT—VEGF-Bcl—xlshRNA重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达绿色荧光蛋白（EGFP）和人端粒酶逆转录酶（TERT）、血管内皮生长因子（VEGF）、Bcl-xl基因shRNA的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对喉癌细胞（Hep-2）的感染效果。方法用基因工程技术将EGFP和TERT、VEGF、Bcl—xl基因短发夹RNA（shRNA）的cDNA从质粒载体pGenesil-1．1上亚克隆至穿梭质粒pENTR-EGFP-VTB上,再通过体外同源重组的方法将EGFP-VEGF-TERT-Bcl-xlshRNA表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,得到腺病毒载体pGsadeno-EGFP_VTB,将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293,并在其中包装扩增腺病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所携带EGFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对Hep-2细胞感染效率的检测。结果酶切鉴定及PCR结果证明EGFP-TERT—VEGF-Bcl—xlshRNA重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1．0×10^9PFU／ml,对Hep-2细胞有较强感染能力。结论应用体外同源重组方法成功构建了表达EGFP和TERT-VEGF-Bcl—xl基因shRNA的重组腺病毒载体。     

人MxA基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增全序列MxA基因,应用基因克隆技术将MxA基因克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack(携带有绿色荧光蛋白基因)中,将线性化的pAdTrack-MxA和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同电转化入新鲜感受态大肠杆菌BJ5183中,两者在其中完成同源重组,MxA重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证,验证正确的MxA重组腺病毒线性化转染入293细胞中包装成完整病毒颗粒,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果:重组腺病毒穿梭质粒pAd-Track-MxA连接成功,测序结果表明克隆的MxA基因序列与GenBank中人MxA基因序列仅有5个核苷酸不同但所编码氨基酸仅1个发生改变,且此氨基酸位于非功能区。MxA重组腺病毒经PacI酶切后产生30kb和4.5kb大小2个片段表明同源重组成功。重组腺病毒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并测感染滴度为1.59×108(pfu/ml),具有较高感染效率。结论:我们已成功克隆了中国人的MxA基因,并成功构建重组腺病毒质粒,为进一步应用此基因进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定了基础。     

HBX基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建携HBX基因的腺病毒载体,为进一步研究HBX基因的功能,为阐明HBV感染导致肝癌的机制研究建立基础.方法:采用PCR技术从HBV全基因组DNA中扩增HBX基因;将HBX基因亚克隆至质粒pHAHA,构建质粒pHAHA-HBX,酶切pHAHA-HBX质粒,将HAHA-HBX片段克隆到腺病毒载体pAd-Track-CMV中,得到pAdTrack-CMV-HBX,同时与pAdEasy-1共转染293细胞,确定转染效率.检测培养上清病毒中HBX的存在.结果:将PCR扩增HBX片段成功克隆到腺病毒载体中,并经序列分析证实;建立了产病毒细胞株,证实重组病毒中含有HBX基因.结论:成功构建了携HBx基因的腺病毒载体.     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因重组腺病毒简便快速的构建方法

目的:利用细菌内同源重组法构建含血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒。方法:应用PCR技术从质粒PUHD AT2R中克隆出AT2R基因片段,定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化Adeasier1细胞,抽提经鉴定含有目的基因的重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒Ad AT2R。用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有GFP报告基因,对病毒滴度进行监测。结果:PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因AT2R,滴度为1.5×1012pfu/ml。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒比传统的细胞内同源重组法具有成功率高、方法简便、快捷和实验周期短的优点。AT2R基因重组腺病毒的成功构建为进一步实验研究奠定了基础。     

ndrg2基因2种亚型重组腺病毒载体的构建

目的：构建表达N-myc下游调节基因2（ndrg2）2种亚型的重组腺病毒载体,为与ndrg2相关肿瘤的基因治疗奠定基础.方法：采用腺病毒表达系统ViraPowerTM Adenoviral Expression System构建腺病毒载体.首先将ndrg22种亚型（长短2种亚型分别命名为ndrg2L,ndrg2S）利用酶切、连接、转化、扩增后提取质粒等方法克隆入入门载体pENTR2B以获得入门克隆pENTR2B-NDRG2L和pENTR2B-NDRG2S,经双酶切及PCR鉴定正确后,用重组酶LR Clonase^TMⅡ Enzyme Mix进行入门克隆与表达载体pAd-CMV/V5-DEST间的重组反应,以获得表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L和pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2S的质粒.表达克隆经PCR鉴定后用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒（分别命名为Ad-NDRG2L和Ad-NDRG2S）,经过反复的感染扩增后,用半数组织培养感染剂量法（TCID50）检测病毒滴度,用Western Blot法检测重组病毒载体是否能正确表达NDRG2蛋白.结果：证实入门克隆pENTR2B-NDRG2L/S和表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L/S经酶切鉴定和PCR鉴定质粒构建正确,转染HEK293A细胞并反复扩增后获得的病毒滴度分别为：Ad-NDRG2L,4.0×10^12空斑形成单位（PFU）/L;Ad-NDRG2S,6.3×1012PFU/L.且这2个病毒能正确表达NDRG2蛋白.结论：成功构建了ndrg2基因长短2种亚型的重组腺病毒载体,并包装扩增病毒,可为肿瘤基因治疗的研究提供依据.     

小鼠Osf2／Cbfal基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。     

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使 VEGF基因的高效转染成为可能