丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶hFIST/HIPK2的表达纯化磷酸化

目的　观察一个新近克隆的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶hFIST HIPK2 (HumanFasinteractingsignaltransducer homeo domaininteractingproteinkinase)的表达、纯化、磷酸化。方法　用瞬时转染技术、Westernblotting检测hFIST HIPK2野生型及其变异型蛋白 (点突变型hFIST HIPK2K2 2 1A ,C 端缺失型hFIST HIPK2△C、N 端缺失型hFIST HIPK2△N)在 2 93T细胞中的表达、磷酸化 ,及从E coli中纯化GST hFIST HIPK2△C融合蛋白。结果　hFIST HIPK2全长序列cDNA长 4kb ,编码分子质量为 13 0× 10 3的hFIST HIPK2蛋白 ;hFIST HIPK2K2 2 1A的分子质量略小于hFIST HIPK2野生型 ,hFIST HIPK2△C、hFIST HIPK2△N的分子质量分别为 5 9× 10 3、69× 10 3。hFIST HIPK2野生型及其变异型蛋白的丝氨酸残基可自我磷酸化 ,其苏氨酸、酪氨酸残基不被磷酸化 ;hFIST HIPK2蛋白可自我降解 ,尤以hFIST HIPK2K2 2 1A蛋白最为明显 ;从E coli中纯化了一个分子质量为 84× 10 3的GST hFIST HIPK2△C融合蛋白。hFIST HIPK2与小鼠HIPK2、仓鼠PKM具有高度的同源性 ,分别为 96 1%、96 5 %。结论　hFIST HIPK2为一新的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 ,是DYRK激酶分支家族中的一员 ,也是新近发现的核蛋白激酶HIPKs (Homeodomaininteractingproteinkinases     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1基因沉默对肺癌细胞生物学行为的影响

目的 研究丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(LKB1)基因表达沉默对肺癌细胞生物学行为的影响.方法 以RNA干扰技术建立LKBI表达抑制的细胞模型,Westem blotting方法检测干扰LKB1蛋白表达的效果;通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测LKB1基因沉默肺癌细胞的增殖变化;应用Annexin V/PI双染法和流式细胞技术分析LKB1基因沉默后肺癌细胞周期的变化及其凋亡和坏死情况.结果 成功建立了LKB1基因沉默肺癌细胞模型,稳定表达LKB1-siRNA细胞的LKB1蛋白表达被明显抑制,LKB1基因沉默后肺癌细胞增殖速度明显加快,但其早期与晚期凋亡率较对照组相比并无显著变化.结论 LKB1基因的下调表达对95D细胞部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用.     

金花茶水提取物对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

目的:研究金花茶水提取物不同浓度、不同时间对人胃癌MGC-803细胞株增殖的影响。方法：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液体外培养人胃癌MGC-803细胞,绘制细胞生长曲线并计算人胃癌MGC-803细胞群体倍增时间;采用噻唑蓝比色法（MTT）检测不同浓度的金花茶水提取物作用不同时间对人胃癌MGC-803细胞的增殖抑制作用,计算细胞增殖抑制率及金花茶水提取物半数抑制浓度（IC50）,并通过统计分析,确认金花茶水提取物作用的最佳时间。结果：不同浓度金花茶水提取物对MGC-803细胞的增殖均有抑制作用,并且与剂量呈量效关系。24,48,72 h的IC50分别为（912.33±12.70）,（789.67±10.69）,（746.00±6.08）mg/L。结论：金花茶水提取物对人胃癌MGC-803细胞的增殖有抑制作用,抑制率与浓度呈量效关系,金花茶水提取物作用的最佳时间为48 h。     

膜联蛋白A7过表达对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨膜联蛋白A7(A N X A7)过表达对人胃癌M G C-803细胞增殖和凋亡的影响.方法 将人胃癌MGC-803细胞分为ANXA7过表达组、阴性对照组,脂质体转染法将pcDNA3.1-ANXA7重组质粒以及空质粒分别转染ANXA7过表达组和阴性对照组.采用Western blot鉴定ANXA7过表达;转染4...     

膜联蛋白A7低表达对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨膜联蛋白A7(ANXA7)低表达对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响。方法 将人胃癌MGC-803细胞分为ANXA7低表达组(si-ANXA7)和阴性对照组(si-con),分别将靶向ANXA7的si-RNA和阴性对照RNA转染为ANXA7低表达组和阴性对照组。Western blot法检测ANXA7的表达;MTT法检测各组细胞的增殖能力;PI检测各组细胞的凋亡率;Western blot检测各组细胞增殖和凋亡相关蛋白PCNA和Cleaved casepase-3的表达。结果 与阴性对照组相比,ANXA7低表达组MGC-803细胞增殖能力显著降低,增殖相关蛋白PCNA表达显著下降(P<0.05);细胞凋亡增强,相关蛋白Cleaved casepase-3的表达显著升高(P<0.05)。结论 ANXA7低表达可抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖并促进其凋亡。     

夏星汤诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡及对p53、bcl-2基因表达的影响

目的 研究夏星汤药液对人胃癌MGC-803细胞株的增殖、凋亡及p53、bcl-2基因表达的影响.方法 采用MTT比色法检测夏星汤药液作用48h后对MGC-803细胞生长增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞化学法检测p53、bcl-2基因表达.结果 随着夏星汤药液浓度逐渐增加,细胞增殖率逐渐降低,细胞抑制率、凋亡率逐渐升高,p53(突变型)和bcl-2蛋白表达得分逐渐下降.结论 夏星汤能够抑制人胃癌MGC-803细胞增殖,对细胞有诱导凋亡作用,在凋亡过程中涉及p53(突变型)和bcl-2基因表达下降.     

中药诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡研究近况

近年来,诱导肿瘤细胞凋亡研究一直是国内外肿瘤研究的一个热点,目前的一些研究结果已经表明,许多中药或中成药的有效成分具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。     

沉默β-catenin表达对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响与作用机制研究

目的探讨β-链蛋白（β-catenin）表达下调对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响,并分析其作用机制。方法将RNA干扰慢病毒（β-catenin-RNAi慢病毒）及空载体慢病毒（β-catenin-Neg）分别感染MGC-803细胞,分为实验组（MGC-803-RNAi细胞）、阴性对照组（MGC-803-Neg细胞）、空白对照组（未处理的MGC-803细胞）。Westernblot检测验证转染效率;双染流式细胞术检测细胞凋亡率,单染流失细胞术分析细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力;Westernblot检测细胞Bax、Bcl-2、cyclinD1及基质金属蛋白酶（MMP）-7蛋白表达水平。结果MGC-803-RNAi、MGC-803-Neg细胞中显示绿色荧光的细胞约占80%,MGC-803细胞不显示荧光;与MGC-803-Neg、MGC-803细胞相比,MGC-803-RNAi细胞β-catenin表达水平明显下调(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05),出现G1/S期阻滞现象(P＜0.05),侵袭能力明显减弱(P＜0.05),Bcl-2、cyclinD1及MMP-7蛋白表达水平下调(均P＜0.05）,而Bax蛋白表达水平上调(P＜0.05)。结论沉默β-catenin表达可促进胃癌MGC-803细胞凋亡,阻滞其细胞周期进程,减弱其侵袭转移力,其作用机制可能与影响Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白表达有关。     

龙葵多糖对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

目的:研究龙葵多糖(Solanum nigrum polysaccharide,SNPS)粗提物对人胃癌MGC-803细胞株生长的移植,对其细胞周期的影响,探讨龙葵多糖对人胃癌细胞增值的影响.方法:MTT法检测SNPS对胃癌细胞MGC-803增殖作用;使用流式细胞仪检测1.6mg/mL SNPS作用72 h,MGC-803细胞的周期分布的影响.结果:结果表明SNPS对MGC-803细胞的增殖具有抑制作用,并具有时间及浓度依赖性.龙葵多糖1.6mg/mL组作用72 h,人胃癌MGC-803细胞被阻滞于G0/G1期(60.01±1.04),S(29.79±1.01)期和G2/M期(10.20±0.99)细胞数量减少,与细胞对照组比较有显著差异,具有统计学意义(P<0.05).结论:SNPS能显著抑制MGC-803细胞的增殖,阻止胃癌细胞由G1期进入S期、阻滞细胞周期进程.     

姜黄素、二苯甲酰甲烷、查尔酮对人胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响

目的:观察并比较姜黄素、二苯甲酰甲烷、查尔酮对胃癌细胞MGC-803生长抑制及凋亡的作用.方法:细胞增殖抑制采用MTT法,细胞凋亡采用流式细胞仪(FCM)检测.细胞形态变化采用HE染色、光学显微镜观察并照相.细胞DNAladder采取DNA抽取及电泳分析.结果:MTT显示MGC-803细胞株增殖抑制作用与药物剂量呈正相关.细胞凋亡率在24h内随药物剂量增加呈上升趋势.光镜下显示,经分别用姜黄素、二苯甲酰甲烷、查尔酮配制的12.5μmol/L、25.0μmol/L溶液处理24h后的MGC-803细胞,部分细胞密度变稀疏,体积变大,细胞膜完整或起泡,核仁丰富,核质比增大;DNA电泳显示, 12.5μmol/L、25μmol/L浓度查尔酮溶液处理组均有典型的DNA梯形图像.结论:姜黄素、二苯甲酰甲烷、查尔酮均可通过诱导MGC-803细胞凋亡而抑制其增殖,该作用有剂量依赖性,并导致相应细胞形态、DNA性状改变.     

姜黄素纳米微粒对体外胃癌MGC803细胞凋亡机制的影响

目的观察姜黄素纳米微粒对人胃癌MGC803细胞凋亡机制的影响。方法 MTT法建立细胞剂量效应曲线,光镜和电镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪分析MGC803细胞周期改变,免疫组化法检测凋亡相关Bcl-2蛋白表达。结果 MTT法显示,姜黄素纳米微粒抑制胃癌MGC803细胞增殖,呈现剂量-时间依赖性;光镜观察姜黄素纳米微粒组细胞损伤较轻,电镜下核周隙清晰,突触小泡较多;流式细胞仪法显示,姜黄素纳米微粒使胃癌MGC803细胞阻滞于G2/M期;免疫组织化学法显示,姜黄素纳米微粒使凋亡相关Bcl-2蛋白表达下调。结论姜黄素纳米微粒诱导人胃癌细胞MGC803凋亡并且延长药物对胃癌MGC803细胞作用时间。     

敲低膜联蛋白A7对胃癌细胞MGC-803增殖的影响

目的：：应用RNA干扰技术,靶向敲低人胃癌MGC-803细胞膜联蛋白A7(Annexin A7,ANXA7)的表达,观察ANXA7低表达对MGC-803细胞增殖的影响。方法：实验分为3组,以靶向ANXA7的siRNA转染MGC-803细胞为siRNA干扰组,另设阴性对照组和空白对照组,以Western blot法检测转染后MGC-803细胞ANXA7的表达,应用MTT法、克隆形成实验检测ANXA7低表达对MGC-803细胞的增殖能力的影响。结果：siRNA干扰组细胞ANXA7的表达较阴性对照组和空白对照组明显降低(P＜0.05)。敲低ANXA7表达后, MGC-803细胞的增殖活性和克隆形成能力明显降低(P＜0.05)。结论：ANXA7低表达可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖。     

Bufalin对MGC-803细胞生长、分化的影响

目的 :以低分化胃腺癌细胞系MGC 80 3为实验对象 ,观察了蟾酥提取物bufalin对其生长、分化的影响。方法 :应用台盼蓝染色法、 76 90 XU荧光染色法和电子显微镜等观察细胞生长、分化。结果 :0 0 1μmol/Lbufalin可显著抑制细胞生长 ,细胞粘附力下降 ,由梭形趋于圆形 ,核质比下降 ,细胞内核糖体和线粒体数目减少 ,内质网不如对照组细胞发达 ;76 90 XU荧光染色显示 ,用药 72h ,约 71%的细胞发生分化。结论 :bufalin能有效诱导胃癌MGC 80 3细胞分化     

染料木素对人胃癌MGC-803细胞增殖及PKA活性的影响

目的 本文通过研究染料木素（Gen）对体外培养MGC-803细胞增殖以及PKA活性的影响,探讨Gen抑制MGC-803细胞系增殖的分子机制.方法 光镜下观察经Gen处理后人胃癌MGC-803细胞形态学改变;应用MTT法检测Gen对体外培养的人胃癌MGC-803细胞增殖影响;PepTag法检测Gen对MGC-803细胞PKA活性的调节.结果 与空白对照组比较,经Gen处理后MGC-803细胞外形呈不规则状、细胞间隙增大、折光性差;MTT实验发现Gen能够抑制体外培养的MGC-803细胞增殖,并且抑制作用呈现时间及浓度依赖性;浓度为40 μg/mL的Gen可以显著上调MGC-803细胞的PKA活性（P＜0.01）.结论 Gen对人胃癌细胞系MGC-803细胞的增殖有抑制作用,上调PKA活性可能是Gen抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的机制之一.     

YWHAE表达沉默对胃癌MGC803细胞增殖的影响

目的 探讨沉默YWHAE表达对胃癌细胞增殖的影响.方法 实验分为三组,未转染组,构建YWHAE短发夹RNA(shRNA)表达载体及相应空载载体,慢病毒包装后分别感染胃癌MGC803细胞(干扰组,对照组),应用Western blot、RT-PCR方法检测YWHAE沉默效率;MTT技术观察YWHAE表达沉默前后细胞增殖变化;流式细胞术、细胞克隆实验检测细胞周期、凋亡及克隆形成变化情况.结果 慢病毒包装YWHAE-shRNA后成功感染胃癌MGC803细胞;RT-PCR、Western blot检测结果显示,与对照组比较,干扰组MGC803细胞YWHAE基因表达明显降低,抑制效率为72.7％.MTT结果显示,干扰组细胞增长速率明显低于对照组细胞,72 h增长倍数分别为1.56、2.43,差异有显著统计学意义(P<0.01);细胞克隆实验结果显示,干扰组及对照组克隆形成率分别为6.24％、31.00％,差异有显著统计学意义(P<0.01).流式细胞术检测显示,YWHAE基因表达沉默后,MGC803细胞凋亡率增加,由未消减前的3.23％增加到9.83％,差异有显著统计学意义(P<0.01);相比对照组细胞在G1期的比例(57.88％),干扰组G1期细胞比例明显增加(72.42％),差异有显著统计学意义(P<0.01).结论 沉默YWHAE表达能抑制胃癌MGC803细胞增殖,可能与诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡有关.     

家族性进行性色素过度沉着症家系丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11基因的克隆和序列鉴定

目的进行家族性进行性色素过度沉着症(FPH)家系中患者丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(STK11)基因的克隆和序列鉴定,以期检测FPH发生是否由于STK11突变所致。方法从FPH患者永生化的B淋巴细胞中提取总RNA,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获取cDNA序列,加入特异性引物经PCR扩增STK11 cDNA双链,再经过HindⅢ、EcoRI双酶切PCR产物及质粒载体pcDNA3.0,酶切产物经回收、连接,产物转化到大肠杆菌DH5α,选取阳性克隆菌落进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析。结果成功构建重组质粒pcDNA3.0-STK11,其测序结果与美国国立生物技术信息中心查询的正常序列结果一致。结论该FPH家系发病并非由于STK11突变所致,在初步定位FPH致病基因的19p13.1-pter区段存在尚未发现的致病基因。     

姜黄素对人卵巢癌细胞株SKOV3的抗增殖作用

目的:探讨姜黄素对人卵巢癌细胞株SKOV3的抑制增殖作用及其机制.方法:采用MTT法测定姜黄素在不同浓度、不同时间对SKOV3的抑制增殖效应,流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡率,透射电镜观察细胞的超微结构变化,免疫细胞化学法检测凋亡相关基因蛋白的表达.结果:姜黄素可抑制SKOV3细胞的生长,其抑制率与药物浓度和作用时间呈依赖关系,72h的中效浓度(IC50)为79.96μmol/L,流式细胞仪分析证实姜黄素能使SKOV3细胞聚积在G2/M,电镜观察发现姜黄素可诱导细胞凋亡,姜黄素作用72h后,免疫细胞化学表明突变型P53蛋白(MTP53)及Bcl-2表达减弱,Bax及Fas表达增强.结论:姜黄素对SKOV3细胞有抑制增殖作用,通过下调MTP53、Bcl-2的表达及上调Bax、Fas的表达而诱导细胞凋亡.     

5-氮-2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人胃癌细胞系MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

目的研究人胃癌细胞系MGC-803经DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）作用后细胞增殖和凋亡变化。方法MTT比色法测定各组细胞的增殖情况,Annexin V染色法检测各组细胞凋亡率。结果单独应用5-Aza-CdR或TSA作用于胃癌细胞系MGC-803后,细胞增殖均受到抑制,生长抑制率分别为68.0%、65.8%;凋亡率分别为（42.31±4.53）%、（39.30±5.37）%,而联合用药组细胞生长抑制率明显增加,达到86.3%,细胞凋亡率为（68.20±7.14）%。结论与单用5-Aza-CdR或TSA相比,联合应用两种药物更能显著的诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,这可能为胃癌的生物治疗提供一种新的思路。     

半乳糖凝集素3表达抑制对人胃癌MGC-803细胞中Bcl-2和Bax表达的影响及其促凋亡作用

目的：探讨抑制半乳糖凝集素3（galectin-3）的表达对人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响,为基因靶向治疗提供潜在靶点。方法：人胃癌MGC-803细胞分为siRNA干扰组、空白对照组和阴性对照组,siRNA干扰组MGC-803细胞转染靶向galectin-3的siRNA,空白对照组MGC-803细胞只加转染试剂,阴性对照组MGC-803细胞转染阴性对照的siRNA。采用流式细胞术和碘化丙啶（PI）染色法检测各组细胞凋亡率和细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组细胞中galectin-3、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果：与阴性对照组和空白对照组比较,siRNA干扰组细胞中galectin-3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。PI染色,siRNA干扰组凋亡细胞数量明显增加,凋亡细胞出现细胞核固缩、染色质浓集、新月形和凋亡小体等细胞凋亡特征,阴性对照组仅有少量散在的凋亡细胞。流式细胞术和Western blotting法检测,与阴性对照组和空白对照组比较,siRNA干扰组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,Bax蛋白表达水平未发生明显变化（P>0.05）。结论：抑制galectin-3表达可促进MGC-803细胞的凋亡,提示galectin-3对胃癌细胞发挥癌基因作用,具有成为靶向治疗靶点的可能性。