人工合成寡聚核苷酸的简便纯化法

人工合成寡聚核苷酸的简便纯化法郑谷，陈金东（南京铁道医学院生物教研室南京２１０００９）近年来，寡聚核苷酸序列已在分子生物学和分子遗传学的研究中起到重要的作用。但其合成工作十分艰巨。自ＤＮＡ合成仪的问世后，使寡聚核苷酸的合成实现了自动化，简化了ＤＮＡ合...     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞株的影响

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与肝癌细胞株共同孵育一定时间后，观察细胞形态变化，观察细胞DNA含量的分布，测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；电泳呈凋亡特征性Ladder带；流式细胞仪分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰；端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒合成，从而抑制肝癌细胞的生长。     

核糖体失活蛋白Luffin P1的构建

目的:构建免疫毒素Luffin P1的基因原核表达载体,获得免疫毒素Luffin P1,并对其进行鉴定及纯化.方法:设计寡聚核苷酸片段连接延长合成全长Luffin P1,PCR扩增后将其克隆入表达载体pET20b( )中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达蛋白Luffin P1,Western blot鉴定.结果:成功构建了免疫毒素表达载体pET20b( )-Luffin P1,获得纯化的免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论:通过基因工程成功表达免疫毒素Luffin P1,简化了其制备过程,有利于对其进一步研究应用.     

反义寡聚核苷酸治疗支气管哮喘的实验研究

目的探讨反义寡聚核苷酸治疗支气管哮喘的可能性及效果。方法根据小鼠IL-5cDNA序列设计合成反义寡聚核苷酸片段,用T4噬菌体多核苷酸激酶标记反义寡聚核苷酸的5′端,观察硬脂胺(SA)脂质体对反义寡聚核苷酸的转染效率的影响。用卵蛋白和氢氧化铝复制哮喘模型。用聚酰纤维分离小鼠脾T淋巴细胞进行体外培养并导入由阳离子脂质体携带的不同浓度的反义寡聚核苷酸,观察其对T淋巴细胞合成IL-5的影响。采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清液中IL-5浓度。结果SA脂质体能显著提高反义寡聚核苷酸的转染效率,1∶15m/m(反义寡聚核苷酸和SA脂质体质量比)时转染效率最佳,提高反义寡聚核苷酸转染效率12倍。未经卵蛋白刺激的正常鼠和哮喘鼠T淋巴细胞培养上清液中未测到IL-5,经卵蛋白刺激后,T淋巴细胞培养上清液中IL-5含量明显增高。导入不同浓度的反义寡聚核苷酸(10、20及30μmol/L)后,脾T淋巴细胞合成IL-5明显降低,细胞培养上清液中IL-5含量由(44.60±6.23)pg/ml分别降低到(30.70±7.362)、(17.20±6.181)和(8.16±2.34)pg/ml,抑制IL-5合成百分率分别为31.17%、61.43%和81.7%。结论反义寡聚核苷酸可明显抑制IL-5的合成,且呈明显的量效关系。支持其通过抑制致敏小鼠T淋巴细胞IL-5的转录而抑制其合成,为反义基因治疗哮喘提供了依据     

反义寡核苷酸治疗支气管哮喘的实验研究

目的 探讨反义寡聚核苷酸治疗支气管哮喘的可能性及效果。方法 根据小鼠ＩＬ－５ｃＤＮＡ序列设计合成反义寡聚核苷酸片段，用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酶标记反义寡聚核苷酸的５’端，观察硬脂胺（ＳＡ）脂质体对反义寡聚核苷酸的转染效率的影响。用卵蛋白和氢氧化铝复制哮喘模型。用聚酰纤维分离小鼠脾Ｔ淋巴细胞进行体外培养并导入由阳离子脂质体携带的不同浓度的反义寡聚核苷酸，观察其对Ｔ淋巴细胞体例中成ＩＬ－５的影响。采用酶     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的影响

目的观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后,观察细胞形态变化,检测细胞DNA含量的分布,测定端粒酶活性。结果端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在G1期前出现亚二倍体凋亡峰,端粒酶活性抑制。结论端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能抑制端粒酶活性,诱导胃癌细胞凋亡,从而抑制胃癌细胞的增殖。     

肺炎衣原体重组的RNase HIIa和RNase HIIb的生化性质鉴定与比较

目的对肺炎衣原体AR39的RNase HIIa和RNase HIIb(CpRNase HIIa和CpRNase HIIb)进行克隆、表达及生化性质鉴定与比较。方法按已知的CpRNase HIIs基因设计引物、扩增。用pET表达系统构建重组质粒,表达和纯化CpRNase HIIs。5′-32P标记底物RNA/DNA及含有核糖核苷酸的DNA,鉴定酶学性质。结果CpRNase HIIa和CpRNase HIIb均能切割RNA/DNA杂合体的寡聚核糖核苷酸链,产生3′羟基和5′磷酸基团的末端。但两者确实存在着不同的酶活性质。结论CpRNase HIIa和CpRNase HIIb在细胞内担负着不同的功能。     

肺炎衣原体重组的RNase HIIa和RNase HIIb的生化性质鉴定与比较

目的 对肺炎衣原体AR39的RNase HIIa 和RNase HIIb(CpRNase HIIa和CpRNase HIIb)进行克隆、表达及生化性质鉴定与比较.方法 按已知的CpRNase HIIs基因设计引物、扩增.用pET表达系统构建重组质粒,表达和纯化CpRNase HIIs.5'32P标记底物RNA/DNA及含有核糖核苷酸的DNA,鉴定酶学性质.结果 CpRNase HIIa和CpRNase HIIb均能切割RNA/DNA杂合体的寡聚核糖核苷酸链,产生3'羟基和5'磷酸基团的末端.但两者确实存在着不同的酶活性质.结论 CpRNase HIIa和CpRNase HIIb在细胞内担负着不同的功能.     

反义技术及其抗病毒作用

反义技术(antisensetechnique)是指根据碱基互补的原理,用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术[1]。包括反义RNA(asRNA)、反义寡聚核苷酸(asON)和具有核酸特异性切割活性的核酶(ribozyme)等。近年来的研究表明,反义?..     

聚合酶链式反应(PCR)

PCR(polymerase chain reaction)技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,这种方法被认为是生物技术方法学上的一次革命。具体方法是由高温变性、低温退火、适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,以达到使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是①置待扩增DNA于高温下解链成为单链模板;②人工合成的两个特异寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两端的两条链互补结合;③DNA聚合酶在72C条件下,将单核苷酸从引物3’端开始掺入,沿模板5’→3’方向延伸,合成DNA新链。由于每一周期所产生的DNA均能     

反义寡聚核苷酸的化学修饰

反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODNs)的概念最先提出于1967年，经过30多年的研究，人们已意识到在各种反义寡聚核苷酸的广阔领域里，有可能寻找到更有效的抗病毒和抗肿瘤新药。     

NMDA诱导神经元胆囊收缩素mRNA表达及其机制研究

目的：探讨NMDA诱导神经元胆囊收缩素mRNA表达及其机制。方法：利用体外培养的胚胎大鼠大脑皮层神经元和Northern Blot技术，观察NMDA诱导神经元胆囊收缩素mRNA的表达以及c-fos、c-jun反义寡聚核苷酸对该作用的影响。结果：NMDA刺激神经元2h后，胆囊收缩素mRNA的表达量与对照相比升高317％（P＜0．01），而预先给予50uMol-100uMol的c-fos、c-jun反义寡聚核苷酸后该作用被明显抑制（抑制率分别为71．5％、216．5％，P＜0．01）。结论：NMDA可通过c-fos,c-jun的介导作用诱导神经元合成胆囊收缩素，该结果在小剂量NMDA对谷氨酸兴奋性神经毒性的拮抗作用中具有重要意义。     

反义寡聚脱氧核苷酸抑制脑胶质瘤多药耐药基因1的表达

目的研究多药耐药基因1(MDR1)反义寡聚脱氧核苷酸对胶质瘤耐药细胞系C6/adr中MDR1表达的抑制作用.方法以胶质瘤细胞株C6/adr作为胶质瘤体外耐药模型,针对MDR1基因mRNA的AUG起始区-9～ 6序列合成反义和相应的正义寡聚脱氧核苷酸,均经硫代磷酸化修饰.反义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-AS)序列为5'-CTCCATCACCACCTC-3',正义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-S)序列为5'-GAGGTGGTGATGGAG-3'.在脂质体介导下MDR1-AS、MDR1-S转染C6/adr细胞,48 h后利用形态学观察和噻唑蓝快速比色法检测MDR1-AS的细胞毒性作用;半定量RT-PCR检测MDR1-AS处理前后的MDR1 mRNA的差异表达;流式细胞术分析P糖蛋白(P-gp)的阳性细胞率.结果MDR1-AS对C6/adr细胞无毒性作用;MDR1-AS处理后MDR1 mRNA的差异表达由处理前的106%降至30.44%;P-gp阳性表达率亦由处理前的100%降至32.77%.结论MDR1反义寡聚脱氧核苷酸可有效抑制MDR1mRNA及P-gp的表达,从而为基因治疗耐药胶质瘤提供了实验依据,有望开发成为逆转胶质瘤耐药的反义药物.     

合成DNA片段的分离及连接

研究设计了一段带终止信号的DNA序列,通过DNA合成仪分为四个片段合成。本文介绍经DNA合成仪合成DNA片段后的处理,纯化及连接过程.经测定DNA的连接效率在65％左右。     

反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.     

大鼠肝含5/端的氨甲酰磷酸合成酶I基因的克隆(简报)

氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)是尿素循环的第一个酶,主要存在于肝细胞线粒体,在肝细胞癌变过程中CPSI基因调控异常,以致酶活性显著降低。为研究CPSI基因的调控机制以及与肝细胞分化及癌变的关系,本文克隆了含5′末端的CPSI基因。根据编码CPSI的1～10氨基酸的mRNA顺序合成30个核苷酸寡聚物作为探针,对大鼠肝DNA EcoRI部份酶切组建的Charon 4A基因库进行筛选。噬菌体在     

(GTG)5探针产生的DNA指纹图在近交系小鼠遗传检测中的应用

目的探讨用非放射性标记的寡聚核苷酸探针(GTG)5进行近交系小鼠的DNA指纹分析。方法用非放射性标记的寡聚核苷酸探针(GTG)5制作BALB/c、C57BL/6J、DBA/2、C3H近交系小鼠的DNA指纹图,对这四个品系的小鼠进行遗传检测,分析各品系内和品系间的遗传变异性。结果(GTG)5探针可产生具有良好多态性的DNA指纹图,平均图带数为8~12条。各品系内的DNA指纹图平均相似系数(-x)在0.96~1.00的范围内,具有相同指纹图的概率(P)均在3.1×10-1以上,极显著地高于品系间的相似系数(0.22~0.39)和相同指纹图的概率(P<1.07×10-4)。结论(GTG)5可用于制作近交系小鼠的DNA指纹图以对其进行遗传检测。     

脂质体介导ANG反义核酸对 A549 细胞作用的研究

目的：研究脂质体介导ANG反义核酸转染A549细胞后，对其中ANG蛋白表达的影响。探讨其作为抗血管生成与抗肿瘤药物的可行性。方法：用人工合成的人ANG反义寡聚核苷酸，以脂质体为载体转染人肺癌A549细胞，研究A549细胞在基因转染后，其ANG蛋白表达的变化。结果：脂质体转染程序优化后，得到最佳转染效率，免疫组化显示细胞内ANG蛋白表达明显减少，培养基ELISA检测显示每细胞分泌的ANG蛋白量与对照组相比有显著差异。结论：ANG反义寡聚核苷酸抑制A549细胞中ANG的表达，为体内研究提供了基础。     

脂质体介导的99mTc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究

目的探讨脂质体介导的99mTc标记癌基因c-myc mRNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.方法合成15 bp的癌基因c-myc mRNA的反义、正义及无义寡核苷酸,用99mTc标记后(简称99mTc-DNA),一部分用脂质体包裹,以不同放射性强度的99mTc-DNA及脂质体包裹的99mTc-DNA转染细胞,于转染后不同时间测定细胞摄取率,在转染后18 h测定细胞返流比率,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况,用流式细胞术测定癌蛋白的表达.结果在1～5 h内,细胞的摄取率随时间的延长而增加,脂质体包裹的99mTc-DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的99mTc-DNA.四唑盐比色实验,随着脂质体介导的99mTc-反义DNA剂量的增加,细胞数量逐渐减少,而正义、无义寡聚核苷酸组,细胞数量则没有减少的趋势.细胞的返流比率,反义、正义、无义寡核苷酸分别为39.51%、44.12%、63.92%.测定癌蛋白的荧光强度,反义寡核苷酸组2.9860±0.3733、正义寡核苷酸组4.2600±0.2218、无义寡核苷酸组5.2620±0.8562,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组.结论脂质体介导的99mTc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.     

mPLG—PGEM重组表达质粒构建及反义RNA探针的制备和标记

纤溶系统参与体内众多的与细胞外基质降解有关的生理及病理过程，如血栓形成／溶解，动脉粥样硬化、血管新内膜形成，排卵，组织重建，肿瘤转移等[1,2].PLG是纤溶系统的核心成分及功能分子[3]，因此研究PLG基因转录表达在某些生理及病理过程中的变化具有十分重要的意义。目前，用于基因转录表达的核酸探针主要分3种：DNA，反义RNA以及人工合成寡聚核苷酸[4,5]。反义RNA探针的特点是DNA－RNA、RNA－RNA杂交体的稳定性好，特异性强，灵敏度高，杂交信号强[6]，因而，在国外已得到广泛应用，国内则多采用人工合成的寡聚反义RNA探针…