神经营养因子和许旺细胞在脊髓损伤修复中的作用

目的：观察局部注射给予神经营养因子和许旺细胞，对大鼠脊髓损伤的修复作用。 方法：实验于2004-07／12在深圳第二人民医院完成。68只大鼠被分为正常对照组4只、空白对照组16只、神经营养因子组16只、许旺细胞组16只和神经营养因子复合许旺细胞组16只，空白对照组、神经营养因子组、许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组大鼠脊髓半横断手术后损伤部位分别给予生理盐水、神经生长因子和大鼠原代培养的许旺细胞，28d后考察大鼠运动能力和脊髓损伤节段背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平。 结果：68只大鼠均进入结果分析。①大鼠协调运动行为评价结果：脊髓半横断后损伤大鼠后肢运动明显受损，驻杆时间减少超过30％，单独的神经营养因子和单独许旺细胞处理能够在一定程度上恢复大鼠后肢协调运动能力，分别为对照的36％和65％，神经营养因子和许旺细胞协同作用效果理想，可达到正常对照的93％以上。②背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平检测结果：许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组阳性神经元数量和平均吸光度明显多于神经营养因子组[阳性神经元数量：（22．7&;#177;1．9），（31.3&;#177;5．3），（12．9&;#177;3．0）个／视野；平均吸光度：0．035&;#177;0．02l，0．075&;#177;0．033，0．023&;#177;0．011，P均〈0．01]。 结论：外源性给予神经营养因子的同时给予许旺细胞，能够更加优化神经修复微环境，有利于神经损伤后修复。     

许旺细胞源神经营养因子对脊髓背根节感觉神经元的保护作用

背景:许旺细胞源神经营养因子是从许旺细胞胞浆中分离纯化出的一种活性蛋白质,能明显的维持脊髓前角运动神经元的存活和促进周围神经的再生。目的:观察许旺细胞源神经营养因子对周围神经高位损伤所致脊髓背根节感觉神经元死亡的保护作用。设计:随机对照动物实验。单位:深圳市第二人民医院。材料:选用清洁级出生3周SD幼鼠30只,雌雄不拘。随机分为营养因子组和生理盐水对照组,各15只。两组动物均以左侧为正常侧,右侧为损伤侧。方法:实验于2003-05/2003-07在中山大学医学院实验动物中心完成。①两组大鼠均建立L4,5神经根高位离断动物模型,并将近侧神经残端与硅胶管吻接。根据分组,胶管内分别注入许旺细胞源神经营养因子(60mg/L)或生理盐水各20μL,凡士林封固硅胶管两端。②术后4周处死动物取材,观察损伤神经根背根节感觉神经元的存活率和形态学变化。主要观察指标:①两组鼠损伤侧坐骨神经再生情况大体观察。②两组鼠背根节神经元存活情况。③背根节神经元形态学变化。结果:30只鼠全部进入结果分析。①两组鼠坐骨神经再生情况大体观察:营养因子组神经新生轴突沿硅胶管生长,长度达1cm;对照组新生轴突较细少,长度约0.8cm。②两组鼠背根节神经元存活情况:营养因子组背根节内有少量纤维组织增生,神经元丢失不明显,存活率是91.8%,对照组背根节内纤维组织增生明显,神经元大量丢失,存活率是58.6%,营养因子组神经元存活率较对照组高33.2%(P<0.01)。③背根节神经元形态学变化:对照组背根节神经元的直径和面积显著低于营养因子组和正常侧犤(21.8±1.4)μm,(373.1±50.9)μm2比(24.8±1.1)μm,(482.8±42.2)μm2和(24.5±1.3)μm,(471.5±51.4)μm2,P<0.01犦,而营养因子组神经元直径和面积与正常侧相比差异无显著性(P>0.05)。结论:许旺细胞源神经营养因子对受损的背根节感觉神经元有明显的神经营养活性。     

许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致神经元死亡的干预

背景：许旺细胞源神经营养因子是从许旺细胞胞浆中分离纯化出的一种相对分子质量为58000的神经营养物质，具有明显的神经营养活性，能对抗一氧化氮神经毒性物质。 目的：建立根性撕脱伤动物模型，观察许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致脊髓前角运动神经元死亡的保护作用。 设计：重复观察测量。 单位：深圳市第二人民医院骨三科，中山大学附属第一医院显微外科。 材料：实验于2003—03／05在中山大学医学院实验动物中心完成。选用清洁级3-4月龄SD大鼠20只，随机分为许旺细胞源神经营养因子组、生理盐水对照组，各10只。两组动物均以左侧为正常侧，右侧为损伤侧。 方法：①两组大鼠均建立颈6、7神经根性撕脱伤动物模型。②许旺细胞源神经营养因子组将一小块预浸有质量浓度为1g/L的许旺细胞源神经营养因子40μL的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面，生理盐水对照组将一小块预浸有等量生理盐水的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面。③明胶海绵表面置硅胶管，硅胶管一端与明胶海绵缝扎，另一端用凡士林封闭固定于皮下，关闭切口后伤口局部肌肉注射青霉素预防感染。术后两组动物分别通过硅胶管定期注射许旺细胞源神经营养因子或生理盐水20μL，1次／周，3周后取材。 ④切取颈6.7脊髓节段，观察损伤侧脊髓前角运动神经元的存活率和形态学变化以及一氧化氮合酶的表达。 主要观察指标：①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化。②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化。 结果：实验选用20只大鼠，全部进入结果分析。①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化：颈6.7神经根性撕脱术后3周，生理盐水对照组损伤侧68.6％的运动神经元死亡，存活率31．4％，明显低于正常侧（P〈0．01），且存活的神经元胞体严重萎缩；许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元的死亡率较生理盐水对照组减少35％（P〈0．01），存活率为66．4％，且存活的神经元胞体代偿性增大，基本与正常侧相似（P〉0．05）。②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化：正常情况下，脊髓中的一氧化氮合酶阳性神经元主要见于后角浅层，中央导水管周围、中间外侧柱和脊髓背根神经节中的内脏传入神经元，前角运动神经元不表达一氧化氮合酶。颈。神经根性撕脱术后3周，生理盐水对照组损伤侧脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达明显增多，而其正常侧和许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元均未见一氧化氮合酶表达增加。 结论：脊神经根性撕脱可引起脊髓前角运动神经元的死亡和一氧化氮合酶表达，许旺细胞源神经营养因子则对受损的神经元有明显的保护作用和抑制一氧化氮合酶表达。提示许旺细胞源神经营养因子的神经元保护作用可能是通过改变神经元的一些细胞分子例如一氧化氮合酶而实现的。     

纹状体内注射胶质细胞源神经营养因子对帕金森病模型大鼠多巴胺能神经元剂量依赖性的保护

目的：探讨不同剂量胶质细胞源神经营养因子对6-羟多巴制造的偏侧帕金森病大鼠模型黑质多巴胺能神经元的保护作用。方法：实验于2005-04／10在四川大学华西医学中心组织胚胎学与神经生物学教研室及信号转导与分子靶向治疗研究室完成。选取雄性SD大鼠（鼠龄1．5个月）20只。大鼠前脑内侧束注射6-羟多巴。4周后应用免疫组织化学法检测中脑黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元，小胶质细胞及星形胶质细胞数量的变化，建立帕金森病大鼠模型；取SD大鼠15只分为3组，分别为对照组．10，100μg胶质细胞源性神经营养因子处理组，每组5只。右侧前脑内侧束注射5g/L 6-羟多巴4mL，制备帕金森病模型，将不同剂量的胶质细胞源性神经营养因子（5g／L或25g／L，用生理盐水溶解）注入同侧的纹状体内，对照组纹状体内用等量生理盐水替代。手术后4周，取实验动物，麻醉，灌注，切片，再行中脑抗酪氨酸羟化酶免疫组织化学反应。镜下细胞计数；应用配对T检验，ANOVA，及SNK法进行统计。结果：所有实验动物生存状况良好，未发生死亡现象，全部进入结果分析。①损伤侧酪氨酸羟化酶阳性神经元形态未见明显的改变，但数量明显减少，明显低于对侧细胞数，差异有显著性[（11．36&;#177;3．85），（115．12&;#177;17．06），t=3．078，P〈0．01]。②损伤侧大多数小胶质细胞胞体变圆增大，突起变短增粗，染色变深。损伤侧明显高于对侧，差异有显著性[（292．20&;#177;19．73），（80．40&;#177;10．00），t=2．832，P〈0．01]。③中脑黑质损伤侧星形胶质细胞数量显著增加，增生的GFAP阳性星形胶质细胞胞体肥大，突起变短、增粗，染色变深。损伤侧显著高于对侧，差异有显著性[（507．64&;#177;19．99），（226．88&;#177;20．30），t=2．971，P〈0．01]。④损伤侧黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞数明显低于对侧，差异有显著性[（10．16&;#177;2．90）．（116．84&;#177;15．92），t=3．975，P〈0．01]。10μg胶质细胞源性神经营养因子处理组损伤侧明显高于对侧，差异有显著性[（114．60&;#177;18．71），（66．24&;#177;17．19）．t=3．811．P〈0．01]；100μg胶质细胞源性神经营养因子处理组损伤侧明显高于对侧，差异有显著性[（114．88&;#177;19．211），（92．72&;#177;16．29），t=3．725，P〈0．01]。③胶质细胞源性神经营养因子处理组存活的酪氨酸羟化酶阳性神经元数量均明显高于对照组（P〈0．01）。100μg胶质细胞源性神经营养因子处理组神经元存活率显著高于10μg胶质细胞源性神经营养因子处理组，差异亦具有显著性（P〈0．01）。结论：纹状体内运用胶质细胞源性神经营养因子，对多巴胺能神经元具有明显的保护作用．该作用在10～100μg范围内呈剂量依赖性。     

脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用及其细胞内信号传递

目的：观察体外培养大鼠胚脑皮质神经元对缺氧耐受的时间窗，探讨外源性脑源性神经营养因子对缺氧神经元保护作用的时效-量效关系，及该保护作用可能的细胞内信号传递途径。方法：实验于2004-02／2005-02在四川大学华西医院移植工程及移植免疫实验室完成。体外培养孕17-19dSD大鼠皮质神经元，随机数字法分为基线对照组、单纯缺氧组及缺氧＋脑源性神经营养因子组，7d后作缺氧培养，采用四氮唑盐比色法检测0-10h段各时间点单纯缺氧组和缺氧＋脑源性神经营养因子组（分别在缺氧前24h及缺氧前即刻加入25-100μg/L脑源性神经营养因子）存活率的差别，并用Western blotting检测两组神经元在Akt／磷酸化Akt及CREB／磷酸化CREB表达的差别。结果：①脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用是相对的，该保护作用具有时效-量效关系，缺氧前24h加入大剂量脑源性神经营养因子组（100μg/L）优于缺氧即刻加入小剂量（25μg／L）组，缺氧损伤到一定程度后（〉10h）脑源性神经营养因子的保护作用将明显减弱【缺氧前24h加入100μg/L脑源性神经营养因子在1，2，4，8，10h细胞活性分别为基线对照组的（133．85&;#177;3．72）％，（109．83&;#177;5．43）％，（86．15&;#177;0．68）％，（53．78&;#177;1．71）％，（33．41&;#177;1．64）％，而缺氧前即刻加入25μg/L。脑源性神经营养因子组在以上时点细胞活性分别为基线对照组的（81．55&;#177;1．07）％，（92．10&;#177;4．89）％，（78．75&;#177;1．87）％，（43．58&;#177;2.42）％，（33．13&;#177;0．94）％，单纯缺氧组的细胞活性分别为基线对照组的（82．12&;#177;3．15）％，（81．79&;#177;2．61）％，（64．5&;#177;4．56）％，（45．9&;#177;1．74）％，（35．45&;#177;1．25）％】。②加入脑源性神经营养因子可使磷酸化Ah表达增加，磷酸化CREB表达提前并维持较长时间。结论：脑源性神经营养因子可减轻缺氧对神经元的损害，而Akt表达上调可能是脑源性神经营养因子发挥其对缺氧神经元保护作用的重要途径之一。     

构建神经再生室培养成年SD大鼠许旺细胞

目的：探讨从成年SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量许旺细胞的有效手段。方法：实验于2005-05／1在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①取成年SD大鼠1只截断坐骨神经5mm，缝接入20mm硅胶管中，形成神经再生室。7d后重新打开伤口，刨开硅胶管，截取再生室内神经段置离心管中作为实验组。②取SD仔鼠5只，无菌条件下取双侧坐骨神经混合于离心管中作为对照组。③将两组坐骨神消化培养。通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了许旺细胞增殖和纯化程度。结果：①两组培养的细胞光镜观察结果：实验组的许旺细胞密度高于对照组，特别是在培养4d后细胞的密度差别尤为显著。实验组的许旺细胞密度大于600个／mm^2，而对照组密度不足200个／mm^2。②两组许旺细胞免疫组织化学染色：实验组衬染后计数许旺细胞的纯度为（98．0&;#177;1.2）％，而对照组许旺细胞的纯度为（93．0&;#177;2．1）％（P〈0．05）。③两组细胞的生长曲线：培养7d，实验组细胞数量较对照组明显增加，达到（49．6&;#177;3．5）&;#215;10^7L^-1，远高于对照组的（31．7&;#177;3．9）&;#215;10^7L^-1。结论：从成年SD大鼠坐骨神经分离培养方法能获得大量高纯度的许旺细胞，为自体许旺细胞在修复周围神经缺损中的应用提供了可能。     

挤压伤后脊髓腹角和背角中神经营养因子-3和神经营养因子-4表达的时间演变规律

背景：神经营养因子-3和神经营养因子-4对体内、外神经元的发育、存活及功能维持具有重要的作用，是否对在挤压伤后脊髓神经元有保护和修复作用。目的：观察脊髓挤压伤模型大鼠伤后不同时间脊髓腹角和背角神经元神经营养因子-3和神经营养因子-4的表达，并分析其变化规律。设计：随机对照实验，单因素方差分析单位：北京联合人学继续教育学院，昆明医学院人体解剖学教研室。材料：实验于2003—01／03在昆明医学院神经科学研究所完成，选择成年SD大鼠24只，随机分为4组，对照组，挤压伤24h组，挤压伤7d组及挤压伤21d组，每组6只方法：挤压伤各组大鼠麻醉后，在T11行椎板切开后挤压大鼠T13脊髓节段。分别于术后24h，7d及21d断头处死动物，迅速取脊髓L1-L3节段制作20μm厚冰冻横切片。对照组不进行任何处理，和挤压伤24h组同时间点处死大鼠，制备切片过程相同：观察神经营养因子-3和神经营养因子-4样免疫反应阳性细胞在成年大鼠脊髓腹角和背角的分布，并计数两者相同面积内腹角和背角阳性有核细胞数。主要观察指标：①神经营养因子-3和神经营养因子-4在各组大鼠脊髓腹角和背角的分布。②神经营养因子-3和神经营养因子-4在各组大鼠脊髓腹角和背角神经元数量。结果：24只大鼠全部进入结果分析。①神经营养因子-3免疫阳性反应物主要在胞核着色，神经营养因子-4则胞浆及胞核均着色。②各组大鼠脊髓腹角和背角神经营养因子-3阳性神经元数量：挤压伤7d组和挤压伤21d组腹角阳性神经元数明硅高于对照组和挤压伤24h组[10．2&;#177;1．1，11．4&;#177;3．2，6．2&;#177;1．8，7．4&;#177;2．4，P〈0．01）]；背角阳性神经元数仅挤压伤21d组高于对照组[86．4&;#177;9．8，71．3&;#177;8．3，（P〈0．01）1，而挤压伤24h组及7d组低于对照组[48．5&;#177;5．1，41．5&;#177;3．7，71.3&;#177;8．3，（P〈0．01）1。③各组大鼠脊髓腹角和背角神经营养因子-4阳性神经元数量：挤压伤24h组，挤压伤7d组和挤压伤21d组的腹角阳性神经元数高于对照组[9．4&;#177;2．8，10．8&;#177;2．7，15．1&;#177;4．0，（P〈0．05）1，并且随时间的延长呈增加趋势（P〈0．05）；挤压伤7d组和挤压伤21d组背角的阳性神经元数较对照组和挤压伤24h组显著增加[28．1&;#177;3．1，35．1&;#177;4．4，23．3&;#177;2．3，24．1&;#177;1.8，（P〈0．01）]，亦有随时间的延长呈增加趋势（P〈0．01）。结论：脊髓挤压伤后，神经营养因子-3和神经营养因子-4神经元数量在脊髓腹、背角神经元中均有增加，但随时间的变化规律不完全一致．提示神经营养因子-3和神经营养因子-4在脊髓损伤修复中，对感觉和运动神经元发挥作用的时间可能不同．     

胶质细胞源性神经营养因子对培养脊髓运动神经元的影响

背景：胶质细胞源性神经营养因子对运动神经元具有营养作用，但不同浓度的营养因子对培养运动神经元体外生长影响的作用缺乏量化数据，目的：采用体外培养胚胎大鼠的脊髓运动神经元，观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对其生长活性的作用。设计：以体外培养细胞为对象的验证性观察，单位：河北医科大学第二医院神经内科。材料：实验于2001-01／2002-09在河北医科大学第二医院神经内科实验室完成。选择成年清洁级雌雄SD大鼠合笼，取孕15d的大鼠胚胎进行脊髓分离。方法：取孕鼠15d胚胎的脊髓腹侧半组织进行原代体外分离培养。胶质细胞源性神经营养因子组按浓度1，10，50，100μg／L分为4组。对照组为不含胶质细胞源性神经营养因子的培养液。各组设立8个复孔，共做2个批次。从细胞形态学及应用MTT法观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓运动神经元的影响。主要观察指标：培养运动神经元的细胞存活数目和细胞突起的长度。结果：①脊髓运动神经元细胞突起的长度比较：胶质细胞源性神经营养因子1μg／L组、10μg／L组、50μg／L组和100μg／L组明显高于对照组[（107．4&;#177;35．4068，160．5&;#177;38．5649．450．5&;#177;60．6403，293．5&;#177;67．3814，82．8&;#177;7．9725）μm，t=2．610—2．647，P〈0．01]．②细胞存活数：胶质细胞源性神经营养因子1μg/L组、10μg/L组、50μg／L组和100μg／L组明显高于对照组[（13.9&;#177;0．8999，16．1&;#177;0.6680．20.1&;#177;0.6679．26．0&;#177;0.6030，10．5&;#177;0．7820）μm，t=2。211—2-312,P〈0．05]。③MTT比色微量分析：胶质细胞源性神经营养因子1μg／L组、10μg／L组、50μg／L组和1μg／L组明显高于对照组[（0.350&;#177;0.0598，0．3667&;#177;0．0719，0.3819&;#177;0．0638，0．3953&;#177;0．0605，0．2858&;#177;0．0325）μm，t=2．259—2．577．P〈0．05]．结论：不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对体外培养大鼠胚胎脊髓运动神经元有小同程度的促生长作用。     

大鼠脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子及神经营养因子3的表达变化

目的：观察脊髓半横断损伤后早期不同时间神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的表达变化。方法：实验于2005-07／12在解放军总医院神经外科实验室完成。取成年清洁级雄性SD大鼠，体质量（250&;#177;20）g。将24只SD大鼠按双盲法随机分为2组，对照组6只，仅进行至椎板切除，即行切口关闭，不损伤脊髓。损伤组18只，3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，T10处椎板切开后，在T9～T10间用虹膜刀片横断半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫，刺激无反应后，关闭切口。分别于伤后3，7，21d不同时间点取材，每个时间点6只。取损伤位点尾侧段T10节段制作冰冻切片，运用神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3兔抗血清以免疫组化ABC法染色。观察并计数脊髓半横断损伤后尾侧端腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的阳性神经元数。组间比较均采用q检验。结果：①神经生长因子、脑源性神经营养因子主要分布于正常大鼠脊髓腹角神经元细胞浆，神经营养因子3分布于脊髓腹角神经元细胞核、胞浆。②损伤后3，7，21d腹角脑源性神经营养因子和神经营养因子3阳性神经元数均较对照组明显增加[（15．48&;#177;3．20）。（12．59&;#177;2．03），（11．33&;#177;1．92），（7．31&;#177;1．54）；（16．73&;#177;3．30），（11．15&;#177;2．85）。（13．20&;#177;3．39）。（6．00&;#177;1．50），（P〈0．01）1，术后3d时达高峰，随伤后时间的延长进行性减少。⑧损伤后3，7，21d神经生长因子阳性神经元数较对照组明显增加[（10．63&;#177;2．90），（14．07&;#177;2．37），（9．35&;#177;3．50），（4．00&;#177;0．63）。（P〈0．01）]，术后7d时达高峰，3d与21d比较差异无显著性意义。结论：脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3表达明显增加，提示它们可能在脊髓半横断损伤早期修复中发挥作用。     

周围神经端侧吻合后侧支发芽过程中睫状神经营养因子和S-100蛋白的表达

目的：观察与许旺细胞关系密切的睫状神经营养因子和S-100蛋白在周围神经端侧吻合后神经再生过程中的表达。 方法：实验于2002-10／2004-05在上海海军医学研究所完成。选取3月龄SD大鼠16只，随机分为吻合近端组、吻合远端组，8只／组。右侧为吻合组，左侧为正常对照组，于术后1，2，4，8周从吻合近端组及吻合远端组各取1只，共8只。全部大鼠右侧自腓神经切断，胫神经外膜开窗，腓神经远端行外膜端侧吻合于胫神经开窗处。吻合近端组与吻合远端组分别切取吻合近端、远端神经，制备纵切片标本，睫状神经营养因子和S-100蛋白采用免疫组织化学反应并结合计算机进行反应强度的半定量分析。阳性反应染色强的部位透光弱，其灰度值就低，反之灰度值高。 结果：实验纳入大鼠16只，均进入结果分析。①各组术后不同时间睫状神经营养因子免疫反应灰度值的比较：与正常对照组比较，吻合近端组术后1，2，4，8周均基本相近（P〉0．05）；吻合远端组术后1，2，4周均明显升高（117．83&;#177;10．44，155．57&;#177;10．76，186．42&;#177;5．23．142．83&;#177;6．99，P均〈0．01），8周时降至正常水平（P〉0．05）。②各组术后不同时间S-100蛋白的表达：术后1，2，4，8周与正常对照组比较．吻合近端组均无明显差异（P〉0．05）；吻合远端组均呈下降趋势（98．80&;#177;3．43，37．21&;#177;11．44．56．01&;#177;5．77。65．13&;#177;12．36．68．17＋9．35．P〈0．01或0．05）。 结论：在端侧吻合中，由于供体神经轴突的完整性，无法得到近端的因子调节，侧支发芽主要依赖于远端许旺细胞和靶器官。吻合远端睫状神经营养因子呈先下降后上升的趋势，而S-100蛋白呈上升趋势．两者均随神经的修复逐步上调，表明睫状神经营养因子与神经轴突的再生密切相关。提示许旺细胞在端侧吻合轴突侧支发芽中有着必不可少的作用。